仪器分析高效液相色谱
仪器分析 高效液相色谱法
第17章HPLC法17.1 内容提要17.1.1 基本概念高效液相色谱法──在经典液相色谱法的基础上，引入了气相色谱(GC)的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，使之发展成为高分离速率、高分离效率、高检测灵敏度的高效液相色谱法，易称为现代液相色谱法。
高效液相色谱仪──采用了高压输液泵、高效固定相和高灵敏度检测器等装置的液相色谱仪称为高效液相色谱仪。
梯度洗脱──用两种(或多种)不同极性的溶剂，在分离过程中按一定程序连续的改变流动相的浓度、配比和极性，使样品中各组分能在最佳的分配比下出峰的操作技术。
也称为梯度淋洗。
低压梯度──又称外梯度，特点是先混合后加压。
它是采用在常压下预先按一定的程序将溶剂混合后再用泵输入色谱柱系统，易称为泵前混合。
高压梯度──又称内梯度，特点是先加压后混合。
它有两台高压输液泵、梯度程序器(或计算机及接口板控制)、混合器等部件组成。
两台泵分别将两种极性不同的溶剂输入混合器，经充分混合后进入色谱柱系统，是一种泵后高压混合形式。
柱外效应──由色谱柱以外的因素引起的色谱峰形扩展的效应。
柱外因素常指从进样口到检测器之间，除色谱柱以外的所有死时间，如进样器、连接管、检测器等的死体积，都会导致色谱峰形加宽、柱效下降。
液固吸附色谱法──以固体吸附剂为固定相，吸附剂表面的活性中心具有吸附能力，样品分子被流动相带入柱内，它将与流动相溶剂分子在吸附剂表面发生竞争吸附性。
K值大的强极性组分易被吸附，K值小的弱极性组分难被吸附，样品组分因此被分离。
液液分配色谱法──根据物质在两种互不相溶(或部分互溶)的液体中溶解度的不同，有不同的分配，从而实现分离的方法。
分配系数较大的组分保留值也较大。
正相分配色谱法──流动相极性低而固定相极性高的称为正相分配色谱法。
反相分配色谱法──流动相极性高而固定相极性低的称为反相分配色谱法。
化学键合相──利用化学反应将有机分子键合到载体表面上，形成均一、牢固的单分子薄层而形成的各种性能的固定相。
仪器分析高效液相色谱法
仪器分析高效液相色谱法高效液相色谱法（HPLC）是一种常用的仪器分析方法，广泛应用于化学、药学、环境科学、食品科学等领域。
本文将介绍HPLC的原理、仪器组成、操作步骤以及应用领域。
HPLC的原理是利用样品在液态流动条件下在固定相上的分配行为进行分离和定量分析。
相比于传统的色谱法，HPLC具有操作简便、分离效果好、灵敏度高等优点。
HPLC的仪器组成主要包括溶液配制系统、进样系统、柱温控制系统、分离柱、检测器和数据处理系统。
其中，溶液配制系统主要用于调配流动相，进样系统用于将样品注入分离柱，柱温控制系统用于控制柱温度，分离柱用于实现样品的分离，检测器用于检测样品，数据处理系统用于处理和分析检测结果。
HPLC的操作步骤如下：1.首先，需要根据需要选择合适的固定相和流动相，然后将固定相充填到分离柱中。
2.将样品溶解于合适的溶剂中，并按照一定的稀释比例稀释溶液。
3.将稀释后的溶液注入进样器中。
4.打开柱温控制系统，设置合适的柱温。
柱温的选择应考虑到样品的性质以及分离柱的要求。
5.打开溶液配制系统，调配合适的流动相，并将流动相以一定的流速通过分离柱。
6.启动检测器，并设置适当的检测波长和灵敏度，以便对样品进行检测。
7.数据处理系统会自动记录检测结果，并进行相应的数据处理和分析。
HPLC广泛应用于化学、药学、环境科学、食品科学等领域，常见的应用包括药物分析、环境污染物检测、食品成分分析等。
例如，可以利用HPLC对药物中的成分进行分离并进行定量分析，以保证药物的质量和疗效。
在环境科学中，HPLC可以用于检测空气、水体和土壤中的有机污染物。
在食品科学中，HPLC可以用于检测食品中的残留农药、添加剂和重金属等。
总之，HPLC是一种常用的高效仪器分析方法，通过流动相在固定相上的分配行为实现样品的分离和定量分析。
由于其操作简便、分离效果好、灵敏度高等优点，成为化学、药学、环境科学、食品科学等领域中不可或缺的分析工具。
(完整word版)仪器分析高效液相色谱试题及答案
高效液相色谱习题一：选择题1.在液相色谱法中，提高柱效最有效的途径是（D ）A.提高柱温B.降低板高C.降低流动相流速D.减小填料粒度2.在液相色谱中，为了改变柱子的选择性，可以进下列那种操作（C ）A. 改变固定液的种类B.改变栽气和固定液的种类C. 改变色谱柱温D.改变固定液的种类和色谱柱温3.在液相色谱中，范第姆特方程中的哪一项对柱效的影响可以忽略（ B ）A.涡流扩散项B.分子扩散项C.流动区域的流动相传质阻力D.停滞区域的流动相传质阻力4. 在高固定液含量色谱柱的情况下，为了使柱效能提高，可选用 (A )A.适当提高柱温B.增加固定液含量C.增大载体颗粒直径D.增加柱长5. 在液相色谱中, 为了提高分离效率, 缩短分析时间, 应采用的装置是 ( B )A. 高压泵B. 梯度淋洗C. 贮液器D. 加温7. 在液相色谱中, 某组分的保留值大小实际反映了哪些部分的分子间作用力？（ C ）A. 组分与流动相B. 组分与固定相C. 组分与流动相和固定相D. 组分与组分8. 在液相色谱中, 通用型检测器是 (A )A.示差折光检测器B.极谱检测器C.荧光检测器D.电化学检测器9. 在液相色谱中, 为了获得较高柱效能, 常用的色谱柱是 (A )A.直形填充柱B.毛细管柱C.Ｕ形柱D.螺旋形柱10. 纸色谱的分离原理, 与下列哪种方法相似？ ( B)A.毛细管扩散作用B.萃取分离C.液-液离子交换D.液-固吸附二：简答题1. 在液相色谱中，色谱柱能在室温下工作，不需恒温的原因是什么？答：由于组分在液-液两相的分配系数随温度的变化较小，因此液相色谱柱不需恒温三：计算题1. 一液体混合物中，含有苯、甲苯、邻二甲苯、对二甲苯。
用气相色谱法，以热导池为检测器进行定量，苯的峰面积为1.26 cm2。
甲苯为0.95 cm2，邻二甲苯为2.55 cm2，对二甲苯为1.04 cm2。
求各组分的百分含量？（重量校正因子：苯0.780，甲苯0.794，邻二甲苯0.840．对二甲苯0.812）。
仪器分析-高效液相色谱法
流动相的选择与制备
选择合适的流动相
根据被分析化合物的性质， 选择适当的流动相，如有 机溶剂、缓冲液等。
流动相的配制
按照实验要求，准确称量 流动相组分，混合均匀， 并进行过滤和脱气处理。
流动相的梯度洗脱
对于多组分分离，可以采 用梯度洗脱技术，以提高 分离效果。
仪器的开机与平衡
开机
按照仪器说明书，打开仪器电源， 启动仪器操作系统。
药物制剂质量控制
高效液相色谱法可以用于药物制剂的质量控制， 检测制剂中药物的含量、纯度和稳定性等指标。
环境样品分析中的应用
污染物检测
高效液相色谱法可以用 于检测环境中的有机污 染物，如农药、多环芳 烃等，为环境污染控制 和治理提供依据。
饮用水质量检测
通过高效液相色谱法可 以检测饮用水中的有害 物质，如消毒副产物、 微量有机物等，保障公 众的饮用水安全。
粒径
色谱柱的粒径影响分离效 果和分离时间。粒径越小， 分离效果越好，但分离时 间越长。
长度
色谱柱的长度影响分离效 果和载样量。长度越长， 分离效果越好，但载样量 越小。
检测器
类型
常用的检测器有紫外-可见光检测器、荧 光检测器、电导检测器等，根据被测物质 的性质和检测需求选择合适的检测器。
响应速度
线性范围
质。
测定水体、土壤、空气 中的污染物和有害物质。
用于蛋白质、核酸、细 胞等生物大分子的分离
和检测。
高效液相色谱法的优势与局限性
优势
高分离效能、高灵敏度、高选择 性、应用范围广。
局限性
需要专业操作人员、仪器昂贵、 样品前处理复杂、耗时长。
02 高效液相色谱法的仪器构成
CHAPTER
环境仪器分析 第七章 高效液相色谱法
主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段
柱内径1~3cm，固定相粒径>100μm 且不均匀 常压输送流动相 柱效低（H↑，n↓） 分析周期长 无法在线检测
1．经典LC：仅做为一种分离手段
2．HPLC：分离和分析
柱内径2~6mm，固定相粒径<10μm（球形，匀浆装柱） 高压输送流动相 柱效高（H↓，n↑） 分析时间大大缩短 可以在线检测
A 2 dp
next
A dp
， dp A H ， n 柱效
图示
续前
3）传质阻抗项及其影响
C C m C sm C s C m C sm （忽略固定相传质阻抗 ）
注：只考虑流动相和静态流动相的传质阻抗 忽略固定相传质阻抗
A dp
B 2 D m 2 D g
B t R ，B D g
T T D g 或D g M df 2 C Cm C s C g Cl Cl Cl Dl
DL T
续前
2. HPLC ： H A C u
B 2 D m
第七章
高效液相色谱法
High Pressure Liquid Chromatography
第一节
概述
高效液相色谱法：以气相色谱为基础，在经典液相 色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法
一、HPLC与经典LC区别 二、HPLC与GC差别
三、高效液相色谱的特点
四、高效液相色谱的局限性
一、HPLC与经典LC区别
•
•
• • •
液-液分配色谱技术的关键是相体系选择。 可通过调节流动相的极性，来获得良好的柱 效和缩短分析时间。 液-液分配色谱可用于几乎所有类型化台物， 极性的或非极性的、有机物或无机物、大分 于或小分于物质的分离，只要官能团不同、 或者官能团数目不同、或者是分子量不同均 可获得满意的分离。
仪器分析-色谱法
高效液相色谱法(HPLC) 是在气相色谱和经典液相色谱的基础上，采用高压泵、高效固定相以及高灵敏度检测器等新实验技术建立的一种液相色谱分析法。
特点：高压、高柱效、高灵敏度2.HPLC中分离条件的选择：a.固定相与装柱方法的选择:选粒径小的、分布均匀的球形固定相(dp≤10μm)首选化学键合相，匀浆法装柱b.流动相及其流速的选择: 选粘度小、低流速的流动相c.柱温的选择:选室温25-30℃左右。
太低流动相黏度增加，太高容易产生气泡第一节液-固色谱法1.液-固色谱法是利用各组分在固定相上的吸附能力不同进行分离的，也称液-固吸附色谱。
2.分离原理.：组分分子与流动相分子竞争吸附吸附剂表面活性中心，靠组分分子的分配比不同而分离。
3.吸附剂吸附试样的能力，主要取决于吸附剂的比表面积和理化性质，试样的组成和结构以及流动相的性质等。
1）组分与吸附剂的性质相似时，易被吸附;2）组分分子结构与吸附剂表面活性中心的刚性几何结构相适应时，易于吸附。
吸附色谱是分离几何异构体的有效手段;不同的官能团具有不同的吸附能力，因此，吸附色谱可按族分离化合物4.固定相：常用的液-固色谱固定相是表面多孔和全多孔微粒型硅胶、氧化铝等。
一般采用5~10μm的全多孔型微粒。
这些吸附剂的极性都比较大，对非极性组分的保留能力较弱，与极性化合物的相互作用较强。
5.流动相：在液-固色谱中，选择流动相的基本原则是极性大的试样用极性较强的流动相，极性小的则用低极性流动相。
液-固色谱的流动相必须符合下列要求:1）能溶解样品，但不能与样品发生反应。
2）与固定相不互溶，也不发生不可逆反应。
3）粘度要尽可能小，这样才能有较高的渗透性和柱效。
4）应与所用检测器相匹配。
例如利用紫外检测器时，溶剂要不吸收紫外光。
5）容易精制、纯化、毒性小，不易着火、价格尽量便宜。
第二节化学键合相色谱法1.液液分配色谱法分离原理：根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同，在两溶液间进行不同分配而实现分离。
仪器分析第4讲 高效液相色谱法
经典液相色谱法 75-600 0.01-1.0 1-20 50-200 2-50 1-10
高效液相色谱法 3-50（常用5-10）
20-300 0.05-1.0
2-30 104-105 10-6-10-2
2．高效液相色谱法与气相色谱法
（l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和 沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数 的20％．对于占有机物总数近80％的那些高 沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质， 目前主要采用高效液相色谱法进行分离和 分析．
3. 柱外效应
由于色谱柱之外的因 素引起的色谱峰的展 宽，例如进样系统、 连接管路及检测器的 死体积等。
3-3 高效液相色谱的类型及其分离原理
液—液分配色谱及化学键合相色谱 液—固吸附色谱 离子交换色谱 离子色谱 空间排阻色谱
1、 液-液分配色谱
liquid- liquid partition chromatography
4、 离子色谱
ion chromatography
离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种 分离方法。由于离子交换色谱法在无机离子的分 析和应用受到限制。例如，对于那些不能采用紫 外检测器的被测离子，如采用电导检测器，由于 被测离子的电导信号被强电解质流动相的高背景 电导信号掩没而无法检测。
2、 液-固吸附色谱
liquid-solid adsorption chromatography
流动相为液体，固定相为固体吸附剂
分离原理：利用溶质分子占据固定相表面吸附 活性中心能力的差异
分离前提：K不等或k不等
液—固吸附色谱
固体吸附剂主要类型： 极性的硅胶（应用最广） 氧化铝 分子筛 非极性的活性炭
1971年科克兰等人出版了《液相色谱的现代实践》一 书，标志着高效液相色谱法（HPLC）正式建立。
仪器分析笔记 《高效液相色谱分析》
第二章高效液相色谱分析§2.1 高效液相色谱法概述（掌握）2.1.1 高效液相色谱法的特点1、与经典液相色谱法比较2、与气相色谱法比较3、高效液相色谱法的发展A、固定相的变化填料粒度减小，粒型规整；键合型固定相；整体结构固定相；亲和固定相。
目前，出现使用1.0µm填料的超高压液相色谱。
B 、流动相变化目前，出现120～220℃超热水为流动相、FID 和FPD 检测器的HPLC 。
C 、全新方法剪切流路液相色谱；不同分离机制组合的多维液相色谱以及HPLC 与MS 、NMR 、IR 联用的多维液相色谱法。
4、高效液相色谱法的特点①高压 ：采用高压输液设备，（150~350）× 105 Pa ②高速：分析速度快； ③高效：柱效很高。
（n>30000），可以在数分钟内完成数百种物质的分离；④高灵敏度：10—9g （UV ）；10—11g （荧光检测）。
5、高效液相色谱法的局限①溶剂用量太大；②缺乏诸如气相色谱使用的TCD 、FID 通用型检测器； ③不能替代气相色谱法，难分离化合物(柱效10万以上)，必须使用毛细管气相色谱法进行分离； ④不能替代中、低压柱色谱法，一些生物活性化合物不能承受200kPa ～1MPa 压力。
§2.2 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素（了解）2.2.1 影响色谱峰的扩展的因素高效液相色谱法的基本概念及理论基础，与气相色谱法是基本一致的，其区别主要在于流动相的不同。
现根据速率理论及色谱峰扩展及色谱分离的影响讨论如下：高效液相色谱的范氏方程：2222m p sm p s fd m p mm s C d C d C d C D H d u u u D D D λ⎛⎫=++++ ⎪ ⎪⎝⎭ 若将上式简化，可写作：BH A Cu u=++这与气相色谱的速率方程形式是基本一致的，主要区别在于纵向扩散项可以忽略不计，影响柱效的主要因素是传质项。
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种不同有机基团通过化学反应键合到载体表面的一种方法。它代替了固定液的机 械涂渍，因此它的产生对液相色谱法迅速发展起着重大作用，可以认为它的出现 是液相色谱法的一个重大突破。最常用的强极性固定液β,β′---氧二丙睛，中等极性 的聚乙二醇，非极性的角鲨烷等。
1．高效液相色谱法与经典液相色谱法
高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在于高速、高效、高 灵敏度、高自动化。
高速：HPLC采用高压输液设备，流速大增加， 例:分离苯的羟基化合物，7个组分只
分析速度极快，只需数分钟；而经典方法靠 需1min就可完成。对氨基酸分离，
重力加料，完成一次分析需时数小时。
(3)气相色谱一般都在较高温度下进行的，而高效液相色谱法则经常 可在室温条件下工作。P296
从色谱分析的发展来看，HPLC比GC更为有用、更具发展前途
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3.HPLC的特点
1、样品不必气化
2、分离温度低
3、选择性好
4、样品回收容易
5、分离效果好 塔板数达到104 ~105/m
6、采用高压输液泵，高效微粒固定相和高灵敏度检测器 7、仪器设备费用昂贵，操作严格。
总之，高效液相色谱法是吸取了气相色谱与经典液相色谱优点，并 用现代化手段加以改进，因此得到迅猛的发展。目前高效液相色谱法已 被广泛应用于分析对生物学和医药上有重大意义的大分子物质，例如蛋 白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物等物质 的分离和分析。
如果采用流动相的极性大于固定相的极性，称为反相分配色谱， 它适用于非极性化合物的分离，其流出顺序与正相色谱恰好相反。
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液液分配色谱
正相色谱法
1.极性固定相 聚乙二醇、氨基与腈基键合相 2.相对非极性流动相 正已烷、环已烷 3.极性调节剂 乙醇、四氢呋喃、三氯甲烷 4.分离中等极性和极性较强化合物. 酚类、胺类、羰基类及氨基酸类 5.组分流出顺序 极性小先洗出
用经典色谱法，柱长约170cm，柱径
高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍 0.9cm，流动相速度为30cm3·h-1，需
均匀、传质阻力小，因而柱效很高。可以在 用20多小时才能分离出20种氨基酸；
数分钟内完成数百种物质的分离。
而用高效液相色谱法，只需lh之内即
高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV——10-9g, 可完成。
液---固吸附色谱是以固体吸附剂作为固定相，吸附剂通常是些多 孔的固体颗粒物质（如硅胶、氧化铝等），在它们的表面存在吸附中 心。液固色谱实质是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分离 的。 1．分离原理
当流动相通过固定相（吸附剂）时，吸附剂表面的活性中心就要 吸附流动相分子。同时，当试样分子（X）被流动相带入柱内，只要 它们在固定相有一定程度的保留就要取代数目相当的已被吸附的流动 相溶剂，于是，在固定相表面发生竞争吸附:
(2)气相色谱采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力，即不产 生相互作用力，仅起运载作用。而高效液相色谱法中流动相可选用不同极 性的液体，选择余地大，它对组分可产生一定亲和力，并参与固定相对组 分作用的剧烈竞争。因此，流动相对分离起很大作用，相当于增加了一个 控制和改进分离条件的参数，这为选择最佳分离条件提供了极大方便。
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6.1.2液---液分配色谱法
在液---液色谱中，流动相和固定相都是液体，它能适用于各种样品类型 的分离和分析，无论是极性的和非极性的，水溶性和油溶性的，离子型的和 非离子型的化合物。
1.分离原理 液液分配色谱的分离原理基本与液液萃取相同，都是根据物质在两种
互不相溶的液体中溶解度的不同，具有不同的分配系数。所不同的是液液色 谱的分配是在柱中进行的，使这种分配平衡可反复多次进行，造成各组分的 差速迁移，提高了分离效率，从而能分离各种复杂组分。
X + nSad = 达平衡时,有
Xad + nS K ad
[ X ad ][S]n [ X ][Sad ]n
其中Kad为吸附平衡常数，值大表示组分在吸附剂上保留强，难于洗
脱。Kad值小,则保留值弱，易于洗脱。试样中各组分据此得以分离。
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2.固定相 液---固吸附色谱所用固定相多是一些吸附活性强弱不等的吸附
剂，如硅胶、氧化铝、聚酸胶等。由于硅胶的优点较多，如线性容 量较高，机械性能好，不溶胀，与大多数试样不发生化学反应等， 因此，以硅胶用得最多。
3.流动相
把吸附色谱中流动相称作洗脱剂。在吸附色谱中对极性大的试样 往往采用极性强的洗脱剂；对极性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂。 洗脱剂的极性强弱可用溶剂强度参数（ε0）来衡量。ε0越大，表示洗 脱剂的极性越强。
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3．流动相 在液液色谱中为了避免固定液的流失，对流动相的一个基本要求
是流动相尽可能不与固定相互溶，而且流动相与固定相的极性差别越 显著越好。
根据所使用的流动相和固定相的极性程度，将其分为正相分配色谱 和反相分配色谱。
如果采用流动相的极性小于固定相的极性，称为正相分配色谱， 它适用于极性化合物的分离。其流出顺序是极性小的先流出，极性 大的后流出。
荧光检测器——10-11g。
经典LC
HPLC
柱之内径
1~5cm
~0.4cm
长度
50~100cm
15~50cm
填充材料粒度 150µm~200µm
4µm~10µm
使用压力
1~10atm
50~
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2．高效液相色谱法与气相色谱法
（l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物，它们 仅占有机物总数的20％。对于占有机物总数近80％的那些高沸点、热稳定 性差、摩尔质量大的物质，目前主要采用高效液相色谱法进行分离和分析。
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§6.1 HPLC的主要类型及选择
广义地讲，除柱色谱外，薄层色谱（液—固色谱）和纸色谱（液—液 色谱）也属于LC。
狭义的LC指柱色谱。按分离机理，柱色谱法可分为液—固吸附色谱、 液—液分配色谱、键合相色谱、离子色谱等。
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6.1.1液—固吸附色谱法