重组腺相关病毒rAAV在神经科学中的应用

• 病毒质量不稳定
– 多批次包装条件不均一 – 纯化过程导致的空壳率不可控
新型rAAV杆状病毒制备系统
杆状病毒系统制备rAAV的流程图
新型AAV杆状病毒制备体系的优势
灵活性高、通用性强、病毒质量高、产量高，适于大规模放大生产，rAAV纯化 后能够达到很高的纯度，可有效解决非人灵长类动物神经环路标记的大量需求。
rAAV的应用-神经示踪
图a.利用狂犬病毒系统逆向追踪小鼠背外侧被盖区（LDT）中PV阳性和SOM阳性中间神经元的直 接调控网络示意图；图b. LDT中PV阳性和SOM阳性中间神经元都接受来自外侧僵核（LHb）的直 接调控(Yang H et al. Nat Neurosci. 2016.）
rAAV的应用-神经示踪
rAAV在肝脏纤维化研究中的应用
rAAVX-EYFP感染肌成纤维细胞效 果图（Rezvani M et al. Cell Stem Cell. 2016.）
rAAV的应用-脑中枢神经元的感染
rAAV-GFP注射海马感染效果图（Broekman ML et al. Neuroscience. 2006.）
AAV病毒颗粒示意图；B：AAV病毒基因组结构（Kotterman MA et al. Nat Rev Genet. 2014.）
病毒载体选择指南
Adenovirus 基因组 包膜 dsDNA 无 Adeno-associated Virus (AAV) ssDNA 无 Lentivirus ssRNA (+) 有
rAAV的应用-神经元投射研究
rAAV注射红核区，分别在7 d和30 d观察转 导效率和感染RN细胞的特异性（Blits B et al. J Neurosci Methods. 2010.）
rAAV的应用-心脏心肌细胞的感染
不同血清型不同滴度的rAAV病毒感染心肌 细胞（Prasad KM et al. Gene Therapy. 2011.）
>2个月 6 kb 一般 10^8-9 vg/mL 70%
AAV载体的优势与局限
• 优势
– 安全性高
• 无致病性、不整合、低 免疫原性
• 局限
– 外源基因容载能力有限
• ＜4.7 Kb
– 表达时程长
• ＞5个月高效稳定表达
– 通用启动子高表达外源 基因的毒性
– 嗜性广
• 分裂及非分裂细胞（神 经元）、多种血清型实 现不同靶向
纯化后的rAAV病毒经过扫描电镜检测，完整 的rAAV颗粒比例大于85%， 病毒质量高。
纯化后的rAAV处理后进行SDS-PAGE凝胶电泳考马斯亮蓝染色检测， 可以观察到明显的病毒粒子衣壳蛋白VP1，VP2，VP3所对应的 1:1:10 比例组成的三种蛋白，分子量与预期一致，纯度高于95%。
AAV的血清型与其对细胞组织的转导特 性
基因组大小 细胞感染 整合机制
持续时间 包装能力 免疫原性 滴度 转导效率
38-39 kb 分裂细胞和非分裂细胞 非整合
<10天 7.5 kb 强 10^11-12 vg/mL 100%
5 kb 分裂细胞和非分裂细胞 定向整合
>3个月 4.5 kb 弱 10^12-13 vg/mL 70%
9 kb 分裂细胞和非分裂细胞 整合
rAAV的应用-骨骼肌细胞感染
AAV-lacZ注射肌细胞，原位杂交检测病毒的表达量（Kessler PD et al. PNAS. 1996.）
rAAV的应用-肺部细胞的感染
在CMV和RSV启动子调控下AP在肺部的表达 情况（Halbert CL et al. Hum Gene Ther. 2007.）
利用AAV和狂犬病毒RV逆向跨单突触 系统研究杏仁核基底外侧核后部至腹
侧海马CA1区之间存在丰富的谷氨酸
能兴奋性单突触输入（Yang Y et al. Nat Commun. 2016.）
重组腺相关病毒rAAV
中科院神经所病毒平台 2017年1月
腺相关病毒（rAAV）简介
• 腺相关病毒、细小病毒科
• 无包膜单链DNA病毒，基因组长约4.7-6 kb
• 是迄今发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒，通常需要 在辅助病毒的辅助下才能发生产毒性感染，生成子代AAV
AAV的基因组及其编码的蛋 白
• 不同血清型AAV对小鼠组织细胞的嗜性差异很大（Karen Kozarsky et al. Nat Methods. 2010.）
rAAV的应用-视网膜内界膜细胞的感染
Байду номын сангаас
在内界膜注射 rAAV2-CBA-GFP，病毒感染 效果图。A：在注射部位，大部分的视网膜 神经细胞病毒表达水平都很高 ；B: 视网膜 muller细胞和双极细胞均检测到信号 （Boye SE et al. Hum Gene Ther. 2016）
rAAV三质粒制备系统
A：rAAV载体原理（Kotterman MA et al. Nat Rev Genet. 2014.）；
B：制备rAAV的三质粒系统示意图（Ayuso E et al. Curr Gene Ther. 2010.）
传统三质粒制备AAV系统的缺陷
• 生产能力低
– 103-104vg/cel – 难满足灵长类研究及临床需求