重组腺病毒构建的标准操作规程
构建重组腺病毒
重组腺病毒载体1、片段处理先测质粒含量，限制性内切酶NheI和SpeI双酶切含有目的基因的T 载体质粒DNA，双酶切体系根据质粒含量而定，TaKaRa公司的的Buffer与体系总体积比为10:1，酶10U/µL可切底物1µg（实际操作时通常加2-4倍量，但所加酶的体积不能超过反应总体积的十分之一）。
先进行琼脂糖凝胶分离，用洁净的刀片切出目的条带，纯化回收目的片段（试剂盒）。
限制性内切酶SpeI单酶切pAd4△E3穿梭质粒，酶切4-6小时，先取少量进行凝胶电泳，电泳时设立未切的质粒对照，以确定质粒被完全切开，如果没有完全切开，继续延长时间或加大酶量酶切，确定酶切完全后，进行去磷酸化，纯化回收线性pAd4△E3穿梭质粒（要根据质粒的大小确定合适的纯化回收方法）。
2、连接16℃，过夜。
体系：连接酶的Buffer通常为2X，所以，这里就要加总体积1/2的Buffer，同样，连接酶的量也不能超过总体积的1/10!!3、转化入DH5α细胞取10µL连接产物加入100µLDH5α感受态细胞（实验室保存的感受态细胞保存在-70度，取出前要准备好冰水混合物，将感受态细胞取出后，迅速放入冰水）中，轻轻混匀后冰浴30min（目的是让连接产物中的DNA分子与细胞膜吸附在一起）；42℃水浴热激90s（使细胞膜上的孔径变大，DNA分子进入内部），再立即冰浴3min（让细胞膜上的孔快速闭合）；加入890µL LB培养基，37℃温和振荡1h；8000rpm离心5min; 无菌弃去600µL上清，重新悬浮；均匀涂布于含氨苄青霉素（pAd4△E3穿梭质粒不是卡那霉素抗性，而是氨苄青霉素，这是最最重要的）的培养皿上，培养12h。
4、挑分离良好的单克隆，接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37度剧烈震荡（240rpm）摇菌挑取数个菌落，接种于LB培养基中，37℃震荡过夜培养。
腺病毒中文操作手册
腺病毒中文操作手册腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统AdEasyTM操作手册目录第一章简介 1 第二章应用重组腺病毒的优点 2 第三章AdEasyTM 技术 3 3.1 技术概况 3 3.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3 第四章主要流程 4 4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体 44.1.1 克隆的一般原则 4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体54.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生54.2.1 共转化的一般原则 54.2.2 共转化方法 54.2.3 预期结果 5 4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增 6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A 细胞 64.4.1 细胞铺板 64.4.2 磷酸钙转化技术7 第五章常见技术85.1 QBI-293A细胞培养8 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生9 5.2.1 感染QBI-293A细胞95.2.2 病毒空斑形成9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞9 5.3 MOI测定10 5.4 腺病毒感染力测定105.4.1 X-Gal染色11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化11 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表示和基因输送11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增125.5.3 Western杂交13 5.5.4 Southern杂交和点杂交13 5.5.5 病毒裂解产物PCR 145.5.6 免疫测定145.5.7 功能测定14 5.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒16 5.7.1 不连续密度梯度离心17 5.7.2 连续密度梯度离心17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集17 5.8 病毒滴度测定185.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 195.8.2 空斑测定法20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法20 第六章疑难解答226.1 QBI-293A细胞培养22 6.2 感染力测定22 6.3 转移载体克隆23 6.4 在BJ5183细胞中共转化和重组246.5 转染QBI-293A细胞25 6.6 筛选和测定25 6.7 在QBI-293A细胞中表示26 6.8 重组腺病毒的扩增26 6.9 纯化26 6.10 病毒滴度测定 27缩写英文全称中文全称Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白cDNA Complementary DNA 互补DNA cccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNA CPE Cytopathic Effect 细胞病理效应CsCl Cesium Chloride 氯化铯DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小时ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千碱基对KDa KiloDaltons 千道尔顿LB Luria-Bertani ( broth ) LB培养基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点Min Minute 分钟MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数mRNA Messenger RNA 信使RNA MWCO MOIecular Weight Cut-off PAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位pi Post Infection 感染后RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose50 50%组织培养感染剂量TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白TE Tris/EDTA TE溶液wt Wild Type 野生型X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。
4-1BBL重组腺病毒载体的构建及表达
Ｉ—ｎ ａｉｅ ｌｓ ｄ ｐ ｄ ｒｃ Ｃ ｌ ｅｒｚｄｐａ ｍｉ Ａ Ｔ ａｋ ＭＶ・ ４ １ Ｂ ａ ｄ ｃ—ｒ ｓｏｍｅ ｎｏ ｃｍｐｔｎ Ｊ １ ３ ｗｔ ｄ ｎ ｖｒｓ ｂ ｃ ｂ ｎ ｌｓ ｉ ｍ — Ｂ Ｌ ｎ ｏｔａ ｆｒ ｄ ｉｔ ｏ ｅｅ ｔＢ ５ ８ ｉ ａ ｅ ｏ ｉ ａ ｋ ｏ ｅ ｐａ— ｎ ｈ ｕ
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１Ｂ Ｂ Ｌ表达。结论 成 功构建 了含 ４ １ Ｂ —Ｂ Ｌ基 因的腺病毒载体 ， 该载体可用于前列腺癌的免疫治疗 。
吉玛重组腺病毒操作手册说明书
如有疑问欢迎垂询上海电话：************-8009苏州电话：*************-8042E-mail：************************** E-mail：************************吉玛重组腺病毒操作手册GenePharma Recombinant Adenovirus Operation Manual2017 年 6 月如有疑问欢迎垂询上海电话：************-8009苏州电话：*************-8042E-mail：**************************E-mail：************************目录一、产品简介 (4)二、腺病毒载体优势 (4)三、生物安全性 (5)3.1安全性 (5)3.2实验室安全措施 (5)四、流程描述 (6)五、材料与仪器 (7)5.1实验材料 (7)5.1.1细胞株 (7)5.1.2质粒 (7)5.1.3试剂 (8)5.2实验耗材及仪器 (8)5.2.1耗材 (8)5.2.2仪器 (9)六、具体步骤 (9)6.1细胞培养 (9)6.1.1活细胞计数 (9)6.1.2细胞株的冻存 (9)6.1.3细胞复苏 (10)6.1.4细胞传代 (10)6.2病毒包装 (10)6.3病毒收集 (11)6.4病毒扩增 (12)6.5病毒纯化 (12)6.6病毒重悬和保存 (13)6.7病毒滴度检测 (13)七、使用方法 (14)如有疑问欢迎垂询上海电话：************-8009苏州电话：*************-8042E-mail：************************** E-mail：************************重组腺病毒在细胞水平使用 (14)7.1病毒滴度复核（有限稀释法测定） (14)7.2靶细胞感染预实验 (16)7.3正式试验 (18)八、运输和储存 (18)九、常见问题及解决方案 (19)十、吉玛案例 (20)十一、附录 (21)如有疑问欢迎垂询上海电话：************-8009苏州电话：*************-8042E-mail：************************** E-mail：************************一、产品简介腺病毒(Adenovirus，Adv)是一种线性双链DNA 病毒。
TCRVβ7.1重组腺病毒载体的构建-最新文档
TCRVβ7.1重组腺病毒载体的构建能够特异识别抗原肽-MHC复合物的T 细胞受体(T cell antigen receptor ,TCR)，在肿瘤抗原的识别及杀伤过程中具有重要作用[1,2]，将肿瘤抗原特异性识别的TCR基因转染T细胞用于杀伤肿瘤细胞，是肿瘤免疫治疗的方法之一[3]。
在以往实验中发现转染TCRVβ7.1基因的T细胞对肝癌细胞株BEL-7402[4]杀伤活性明显提高，由于脂质体的转染率较低和毒性较大，现构建重组腺病毒载体Ad.TCRVβ7.1，以提高转染率和降低毒性。
1材料与方法1.1质粒、菌株和细胞AdMaxTM 腺病毒包装系统(腺病毒骨架质粒、腺病毒穿梭质粒pDC315、HEK293细胞)购自加拿大Microbix公司；PBMC从人血分离；质粒pcDNA3.1- TCRVβ7.1、Hela（宫颈癌细胞）及大肠杆菌E.coli DH5α由本室保存。
1.2试剂限制性内切酶、T4DNA连接酶、反转录试剂盒及DNA Mark购自Takara公司。
Lipofectamine2000和Trizol购自Invetrogen公司。
质粒提取及胶回收试剂盒均购自Omega公司。
淋巴细胞分离液购自天津市灏洋生物制品科技XX公司。
1.3穿梭质粒pDC315 - Vβ7.1的构建穿梭质粒pDC315 - Vβ7.1构建过程如（图1）。
设计一对带有EcoRⅠ和XhoⅠ的TCRVβ7.1引物，PCR产物双酶切后连接到穿梭质粒pDC315中，得到腺病毒穿梭质粒pDC315 - Vβ7.1。
图1 穿梭质粒pDC315Vβ7.1的构建1.4重组腺病毒Ad.TCRVβ7.1的包装接种4×105个低代的HEK293细胞于六孔板中，约24h后细胞密度达到60%～80%时，用脂质体Lipofectamine2000将穿梭质粒和骨架质粒共转染293细胞。
待细胞长满培养板时，将其消化转移至10cm细胞培养皿中继续培养。
(整理)FnCBD64基因重组腺病毒载体AdFnCBD64的构建
FnCBD64基因重组腺病毒载体Ad.FnCBD64构建的实验研究徐瑞剑王志强包头市九原区医院胸外科内蒙古包头 014060内蒙古自治区自然科学基金项目项目编号2009MS1148通讯作者：王志强Xu ruijian Wang zhiqiangDepartment of Thoracic Surgery, Jiuyuan District Hospital of Baotou, Baotou Inner Mongolia 014060实验目的：构建纤维连接蛋白羧基端细胞结合域（FnCBD64）基因重组人腺病毒载体（Ad.FnCBD64）。
实验方法：1.FnCBD64重组腺病毒粘粒载体的构建。
2.293细胞和Hela细胞的培养。
3.磷酸钙转染。
4. 筛选和扩增FnCBD64基因重组腺病毒。
5．设计公共PCR引物。
6. 鉴定Ad. FnCBD64重组腺病毒。
7. 浓缩纯化重组腺病毒。
8. 测定病毒滴度（50％组织培养感染量TCID50）。
9.体外安全性研究。
结果：成功构建了纤维连接蛋白羧基端细胞结合域（FnCBD64）基因重组腺病毒载体Ad.FnCBD64。
结论：本实验成功地构建了携带人FnCBD64基因的重组腺病毒，为应用FnCBD64促进骨髓间质干细胞的黏附力提供了转染载体，使应用骨髓间质干细胞体外构建组织工程心脏瓣膜成为可能。
运用基因转染的技术加强及改造种子细胞的功能是组织工程研究中的热点问题之一。
通过这一手段的应用，不仅能获得具备旺盛生理功能的种子细胞，而且还能使种子细胞大量表达需要的目的蛋白，有利于组织构建。
腺病毒载体是组织工程基因改造的常用的病毒性载体，同其他的载体体系对比，腺病毒载体是最具有潜力的载体之一，具有高效感染分裂细胞及非分裂细胞能力，制备容易、纯化和储存方便，并且滴度高、容量大[1]。
能插入大片段的目的基因，携带的外源基因不会整合在宿主染色体中，在靶细胞内以附加体形式存在，插入突变的危险极低，具有较低的遗传毒性。
重组腺病毒rAd-mIL-15的构建及表达
重组腺病毒rAd-mIL-15的构建及表达谭榜云;李莉;刘志武【摘要】目的构建并制备鼠白细胞介素-15(mIL-15)重组腺病毒(rAd-mIL-15),感染HEK293细胞,为肝细胞肝癌的免疫治疗奠定基础.方法采用聚合酶链反应(PCR)扩增mIL-15,将扩增产物连接到穿梭载体pDC316上,构建重组穿梭质粒pDC316-mIL-15.在Lipofectamine2000脂质体介导下将腺病毒骨架载体pBHGlox△E1,3 Cre和穿梭质粒pDC316-mIL-15共转染入HEK293细胞,进行同源重组,得到腺病毒重组质粒pAd-mIL-15.随后在HEK293细胞中包装扩增病毒并测定病毒滴度.采用PCR对重组腺病毒进行鉴定.结果重组腺病毒质粒经PCR鉴定,证实含有mIL-15基因,重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达1.25×1010 PFU/mL.结论采用细胞内同源重组方法可成功构建含mIL-15基因的重组腺病毒,并可获得高滴度病毒,其能高效感染HEK293细胞,能为进一步研究奠定基础.%Objective To construct and prepare the recombinant adenovirus carrying mouse interleukin-15 (mIL-15 ) ,and to transfect it into HEK293 cells on order to lay the foundation for immunotherapy of hepatocellular carcinoma(HCC) .Methods The PCR was adopted to amplify mIL-15 ,the amplified products were connected into shuttle vector DC 316 ,the recombinant shuttle plasmid pDC316-mIL-15 was constructed .Under mediation of lipofectamine2000 ,recombinant adenovirus backbone vectorpBHGlox△E1 ,3 Cre and shuttle plasmid pDC316-mIL-15 were co-transfected into HEK293 cells for conducting the homologous recombina-tion .The recombinant adenovirus plasmid rAd-mIL-15 was obtained .Then the amplified virus was packed in HEK293 cells and the viral titer wasmeasured .The recombinant adenovirus was identified by PCR .Results The recombinant adenovirus plasmid was verified to contain mIL-15 gene by PCR identification .The recombinant adenovirus vector was successfully constructed ,the viral ti-ter reached 1 .25 × 1010 PFU /mL .Conclusion Recombinant adenovirus vector containing mIL-15 can be successfully constructed by adopting the intracellular homologous recombination method ,moreover which can obtain high titer virus ,can efficiently infect HEK293 cells and lay a foundation for further study .【期刊名称】《检验医学与临床》【年(卷),期】2017(014)022【总页数】3页(P3300-3302)【关键词】白细胞介素-15;重组腺病毒载体;包装【作者】谭榜云;李莉;刘志武【作者单位】兰州大学第一医院检验科 ,甘肃兰州730000;兰州大学第一医院检验科 ,甘肃兰州730000;兰州大学第一医院检验科 ,甘肃兰州730000【正文语种】中文白细胞介素(IL)-15是学者于1994年从猿肾上皮细胞系成功分离时发现。
〖医学〗重组腺病毒载体的构建
BTEB2简介
基本转录元件结合蛋白2－转录因子 功能：促进VSMC增殖和表型转化
外源性基因的制备
VSMC中提取总RNA RT－PCR得到BTEB2 cDNA 体会：从目的基因丰度高的组织或细胞
中提取。
重组穿梭质粒的构建－－将 PCR产物克隆到穿梭质粒
用BamH I 和 EcoR I 双酶切穿梭质粒 pDC315及BTEB2 cDNA
用T4连接酶将BTEB2 cDNA反向连接到 穿梭质粒 定向克隆
体会：设计引物时引入需要的酶切位点 可使基因定向克隆的程序简化
重组穿梭质粒的鉴定
酶切鉴定：用BamH I 和 EcoR I 双酶切 重组穿梭质粒pDC315ASBTET2，电泳
目的片段测序
重组腺病毒的制备
脂质体介导重组穿梭质粒和腺病毒基因组质粒 共转染293细胞
腺病毒载体的包装细胞
HEK293细胞的培养 高糖型DMEM 10%FBS（构建），10%NBS（扩增）
HEK293细胞的传代次数与腺病毒载体构 建和扩增 构建：＜20代－－构建成功的关键 扩增：无特殊要求
重组原理
重组腺病毒载体构建
以反义BTEB2腺病毒表达载体为例 介绍重组腺病毒载体的构建过程
重组腺病毒的鉴定
病变293细胞于液氮、37°C反复冻融， 离心
取上清提取重组病毒DNA 用目的片段引物和病毒基因组特征片段
引物作PCR
病毒滴度测定
24孔培养板每孔接种1×105个293细胞 培养24小时后，取病毒转染液0.2ml加
PBS至总量2ml，混匀后作10倍比稀释至 第8管，每孔加入不同稀释度的病毒液 0.2ml。 37°C 5%CO2培养1小时后，每孔补加 1.5ml培养液，继续培养36－48小时
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重组腺病毒构建的标准操作规程（编号：048）
1、目的及适用范围
该SOP用于规范真核细胞表达重组蛋白的操作。
2、主要仪器及试剂
电转仪、Adeasy-1系统（穿梭载体pshuttle-cmv,pAdtrack-CMV）、骨架病毒（pAdeasy-1）、重组菌（BJ5183感受态）、包装细胞（293A）、Taq酶。
限制性内切酶、碱裂解法提取质粒溶液I、II、III、酚、氯仿
3、操作步骤
3.1目的基因的克隆：引物设计时要GOI中有没有Pme I/EcoRI和PacI酶切位点。
3.1.1通过限制酶切分析/PCR/基因测序确认GOI克隆到穿梭载体，翻译方向跟启动子方向相同。
3.1.2如果采用pShuttle 或pAdTrack，必须提供启动子和多聚腺苷酸信号。
所有的穿梭载体必须包括一个Kozak 信号序列。
3.1.3因为在转化和转染前，用Pme I/EcoRI和PacI酶，所以要避免GOI中有这些酶的酶切位点。
如果有PacI酶酶切位点，建议通过点突变除去。
3.1.4如果表达多个基因，避免头对头的方向，采用头尾相接的方式。
3.1.5建议在穿梭载体中，通过瞬时转染检测GOI的表达。
3.2制备电转 BJ5183 感受态细胞：BJ5183为链霉素抗性，固体和液体LB加终浓度为30μg/mL 的链霉素培养。
划线培养、挑单菌落摇床培养，转接到200-300mL液体培养基中，37℃摇床培养至A550约0.8，转移到无菌离心管中冰浴10～30min，4℃3000rpm离心10min，用50mL灭菌的超纯水配制的10%甘油重悬,重复两次离心重悬，4℃3000rpm离心10min，用10mLWB重悬，4℃3000rpm离心10min最后用0.5mL重悬。
分装20μL/管，-80℃冻存。
3.3用卡那抗性培养基培养2mL含有GOI穿梭质粒的细菌培养过夜。
提取质粒DNA。
推荐使用碱裂解法提取质粒，保证穿梭质粒的完整性可以提高在BJ5183细菌中重组的效率。
3.4 用Pme I或EcoRI线性化穿梭质粒：必须保证酶切完全。
0.1μg-0.5μgDNA用300U的酶100μL 体系。
电泳检测酶切是否完全。
3.5乙醇沉淀法回收纯化线性化的穿梭载体。
3.6 冰上操作：向20μLBJ5183感受态细胞中加入pAdeasy-1腺病毒骨架质粒和线性化的穿梭质粒，混匀，总体积不超过30μL。
3.7 将感受态和DNA混合物转移到用冰预冷的电转杯中，电击转化。
电击完成后加入预热的LB
101。