犬细小病毒VP2基因
犬细小病毒VP2基因原核表达条件优化与蛋白纯化
１ ０ ｍ ｌｍＬ Ｉ Ｔ 诱 导 ６ ｈ时 条件 下 蛋 白 表 达 量 最 高 。Ｓ Ｓ Ｐ ＧＥ电 泳 检 测 的 纯 化 目的 蛋 白约 为 ９ Ｄ ， 预 ． ｍｏ／ Ｇ Ｐ Ｄ －Ａ ０ｋ ａ与 计 大小 一致 。ＶＰ ２基 因融 合 蛋 白 的优 化 表 达 和 纯 化 为 研 究 犬 细 小 病 毒 亚 单 位 疫 苗 奠 定 了基 础 。 关 键 词 ： 犬 细 小 病 毒 ； ２基 因 ； 合蛋 白 ； 化 与 纯 化 ＶＰ 融 优
犬 细 小病 毒 ＶＰ ２基 因 原核 表 达 条 件优 化 与 蛋 白纯化
陈 胜 男 ， 素 贞 ，翟 少 伦 ， 子 健 马 简
（ 疆 农 业 大 学 动 物 医学 学 院 ， 鲁 木 齐 新 乌 ８０ ５ ） ３ ０ ２
摘
要 ： 为 了 提 高 犬 细 小 病 毒 ＶＰ ２基 因 在 大 肠 杆 菌 Ｅ．ｃ ｌ ＢＬ １（ ｏｉ ２ ＤＥ３ 中 的表 达 量 ， 过 改 变 诱 导温 度 、 导 时 ） 通 诱
ｐａ ｍｉ ｃ ｅ ｉｈ ａｃ ｌ ， Ｌ２ ＤＥ３ ｌｓ ｄＥｓｈ ｒｃ ｉ ｏ ｉ Ｂ １（ ）ｗａ ｈ ｐ ｉ ａ ｅ ． ｍｍｏ ／ ＰＴＧ ｒ ｎ ｕ ｅ ｏ ｔ ｓｔ ｅｏ ｔ １ｗｈ ｎ １ ０ ｍ ｌｍＬ Ｉ ｗｅｅ ｉｄ ｃ ｄ ｆ ｒ６ ｈ ａ
３ ℃． ５ Ｆｕｓｏ ｏ ｅｎ ｐｕ ｉｉｄ ｂｙ Ｇｌ ｔ ｔ ｏ ｐ ｒ ｓ Ｂ ｆｉ ｉｙ ｃ ｌ ｍ ｎ ｗａ ｂｏｕ Ｄａ ｗｈ ｃ ｒ ｉ ｎ ｐｒ ｔ ｉ ｒｆｅ ｕ ａ ｈｉ ｎｅ Ｓｅ ｈａ ｏ ｅ ４ ａ ｆｎ ｔ ｏ ｕ ｓａ ｔ９０ ｋ ｉ ｈ ｗｅ ｅ
ｓｏ ｏ ｅｎ ｓ ｔｔ ｅ ｂ ｓ ｏ ｔ ｙ ｎｇ ｓ — ｎｉ ａ ｃ ｎ ｆＣＰＶ ． ｉ ｎ ｐｒ ｔ ｉ ｅ ｈ ｙ ｗｏｒ ｓ Ｃａｎ ｎ ｄ： ｉ ｅｐａｒ ｖｉ ｕｓ；Ｖ Ｐ２；ｆ ｉ ｎ ｐｒ ｔ ｉ ｏ ｔｍ ｉａ ｉ ｎ ｒｆｃ ｔｏ ｖｏ ｒ ｕｓｏ ｏ ｅｎ； ｐ ｉ ｚ ｔｏｎ ａ ｄ ｐｕ ｉｉａ ｉ ｎ
犬细小病毒DD株的分离鉴定和VP2基因序列分析
Ａ ｓ ａｔ Ａ ｓ ａｎ ｏ ａ ｉｅ ｐ ｒｏｉ ｓ Ｃ Ｖ） ａ ｓｌ ｅ ｒｍ ｂｏｄ ｅｅ ｆａ ｌ ｐ ｐ ｙ ｓｓｅｔ ｆ ｂ ｔ ｃ ： ｔ ｉ ｆｃｎｎ ａｖｖｒ （ Ｐ ｗ ｓｉ ａ ｄ ｆ ｌ ｙ ｆｃｓｏ ｎ ｉ ｕ ｐ ｕｐｃｅ ｏ ｒ ｒ ｕ ｏｔ ｏ ｏ ｌ ｄ ｐｒｏｉ ｓｉ ｅｔ ｎ ｅ ｉｇ ｈ ｔ ｉ，ｄｓ ｎｔｄａ Ｐ ａｖｖ ｕ ｆｃ ｏ ｓｉ Ｂ ｉｎ ．Ｔ ｅｓ ａ ｒ ｎ ｉ ｎ ｊ ｒ ｎ ｅｉ ａ ｓＣ Ｖ—Ｄ ｗ ｓｉ ｌ ｅ ｙｉｏｕａｉｇＣ Ｆ ｅ ｓ ｎ ｇ ｅ Ｄ， ａ ｏ ｔｄｂ ｃｌｔ Ｒ Ｋ ｃｌ ｓａ ｎ ｎ ｌｉ
ｓ ｎ ｈ ｏ ｉｍ ｎ ａ ｄ ｎ ｉ ｅ ｓ ｓ ｒ ｔｐ Ｐ 一２ ｙ Ｐ Ｒ ，ｔ ｅ ＨＡ ，Ｉ Ａ ， ｌｃ ｒ ｎ ｍｉｒ ｓ ｏ ｙ ｏ ｓ ｒ ａｉ ｎ ａ ｄ ｙ ｃ ｒ ｎ ｓ ａ ｄ ｗ ｓｉ ｅ ｔ ｄ ａ ｅｏ ｙ ｅ Ｃ Ｖ ｉ ｆ ａｂ Ｃ ｈ Ｆ ｅｅ ｔ ｃｏ ｃ ｐ ｂ ｅｖ ｔ ｎ ｏ ｏ
［ 关键词 ］ 犬细小病毒 ；Ｐ ； Ｖ ２ 分离； 鉴定
Ｉ ｏａ ｉｎ ｎ ｄ ｎ ｉ ｃ ｔｏ ｆ Ｃａ ｉ ｒ ｏ ｉｕｓＤＤ ｔ ａｎ ｎｄ ｓ ｌ ｔｏ ａ ｄ Ｉ ｅ ｔｆ ａ ｉ ｎ ｏ ｎ ｎｅ Ｐａ ｖ ｖｒ ｉ Ｓｒｉ ａ
Ｓ ｑ ｅ ｃ ａｙ ｉ ｆｔ ｅ ＶＰ ｎ ｅ ｕ ｎ ｅ Ａｎ ｌ ｓｓｏ ２ Ｇｅ ｅ ｈ
ｓｑ ｅ ｃｎ ｆ ２ｇ ｎ ．Ａ ｕ ｉｕ ｌ ｅ ｕ ｎ ｉｇｏ ＶＰ ｅ ｅ ｎｑ ｅＩ ｅ一３ ４ ｉ ２ ｏ ２ ｎＶＰ ｆＤＤ ｓ ａｎｗａ ｕ ｄ，ｃ ｎｒｓ ｎ ｒ ｔ ｉ ｓｆ ｎ ｒ ｏ ｏ ｔ ｔ ｇｔ ａＴ ｙ一３ ４ ｉ ｅＶＰ ａｉ ｏ ２ ｎｔ ２ ｈ
犬细小病毒VP2基因序列分析及BJ-1株的分离鉴定
本研究在对 ＶＰ２基因进 行 分 析 的 基 础 上，对 鉴 定为 Ｎｅｗ ＣＰＶ２ａ的北京毒株进行分离和病毒相 关 特性鉴定，有 助 于 了 解 和 掌 握 目 前 ＣＰＶ 的 流 行 情 况，为更好地防控 ＣＰＶ 提供参考。
１ 材 料 与 方 法
１．１ 材 料 １．１．１ 临床 样 本 临 床 样 品 来 自 北 京 和 山 东 两 地 的宠物医院，病 犬 临 床 症 状 为 呕 吐、腹 泻 等，临 床 疑
似为 ＣＰＶ 感染，同时采集病犬的粪便样品备用。 １．１．２ 细 胞 与 主 要 试 剂 Ｆ８１ 细 胞，本 实 验 室 保 存；ＣＰＶ 单 克 隆 抗 体，ＩＮＧＥＮＡＳＡ 公 司 产 品；Ｇｏａｔ ａｎｔｉＭｏｕｓｅＩｇＧ （Ｈ ＋Ｌ）Ｈｉｇｈｌｙ ＣｒｏｓｓＡｄｓｏｒｂｅｄ ＳｅｃｏｎｄａｒｙＡｎｔｉｂｏｄｙ，ＦＩＴＣ（货 号 Ａ１６０７９），英 潍 捷 基（上 海 ）贸 易 有 限 公 司 产 品；２×Ｅｓ犜犪狇 Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ，康为世纪生物 制 品 有 限 公 司 产 品；粪 便 基 因 组 提取试剂盒、质 粒 提 取 试 剂 盒、ＤＮＡ 片 段 回 收 试 剂 盒、Ｔｏｐ１０ 感 受 态 细 胞 和 细 菌 基 因 组 ＤＮＡ 提 取 试 剂盒，天 根 生 化 科 技 有 限 公 司 产 品；ＤＮＡ 标 准 ＤＬ２０００，ＴａＫａＲａ 有 限 公 司 产 品；ＤＭＥＭ、胎 牛 血
犬细小病毒VP2基因测序分析
与Ｐ Ｃ Ｒ检 测结果 符合 率达 ７ ６ ． ９ ； ３个试验 毒株之 间 ＶＰ ２基 因 同源性 达 ９ ６ ． ５ ～９ ７ ． ３ ， 与参 考毒株 同源
性为 ９ ５ ． ２ ～９ ６ ． ８ ； 由遗传进 化树 可见 ， 与 国 内分 离毒 株 的亲缘 性略 高于 国外分 离株 。结果表 明 ， Ｃ Ｐ Ｖ 抗 原 快速检 测试 剂盒 与 Ｐ Ｃ Ｒ 法符合 率较 高 ， ３个试验 毒株 与 国 内外流 行毒株 之 间差异性 不 大。 关键 词 ： 犬细 小病毒病 ； ＶＰ ２基 因； 聚合 酶链 反应 ； 序 列 分析
（ １ ． 贵 州 大 学 动 物科 学 学 院 ， 贵州贵阳 ５ ５ ０ ０ ２ ５ ； ２ ． 贵州省动物疫病研究室 ， 贵州贵 阳 ５ ５ ０ ０ ２ ５ ；
３ ． 贵阳市黔灵动物医院， 贵州贵阳 ５ ５ ０ ０ ０ ４ ）
摘 要 ： 为 了解 贵 阳市犬细 小病 毒 （ Ｃ Ｐ Ｖ） ＶＰ ２基 因的遗 传 变异 情 况 ， 从 贵 阳 市黔 灵动 物 医院采 集 经 试
Ｅ Ｉ Ｉ Ｓ Ａ 检测 方法 ， 具 有 良好 的 特 异 性 ， 与 常 见 的 犬
病 毒性传 染病 阳性 血清无 交叉 反应 ， 重 复性 良好 ， 与
为了解贵 阳市 Ｃ Ｐ Ｖ ＶＰ ２基因 变异情 况 ， 本研 究 选择 Ｃ Ｐ Ｖ 的 ＶＰ ２ 基 因作 为研 究 对 象 ， 采用 Ｐ Ｃ Ｒ方
我国， Ｃ Ｐ Ｖ 一 ２曾 在 ２ ０世 纪 ８ Ｏ年 代 早 期 流 行 ， 但
ｌ ９ ８ ６年后全 国 范 围 内 主要 以 Ｃ Ｐ Ｖ 一 ２ ａ占优 势 地 位 。 ２ ０ ０ ９年杜强 等Ｌ ４ 用猫 肾（ Ｆ ８ １ ） 细胞 分 离鉴 定 出一 株 细小 病毒 为 Ｃ Ｐ Ｖ一 ２ ａ亚 型 。近 年 来 ， 该 病 的 诊 断 方 法层 出不穷 ， 姜 骞 等＿ ＿ ５ ］ 利 用 重 组 蛋 白建 立 了 间 接
犬科和猫科动物细小病毒分离株VP2基因的遗传进化分析研究的开题报告
犬科和猫科动物细小病毒分离株VP2基因的遗传进化分析研究的开题报告一、研究背景与意义犬科和猫科动物是人类近距离生活的宠物动物，对人类健康具有危害，比如犬瘟热、狂犬病等等。
而细小病毒是引起宠物疾病的重要病原体，犬和猫感染细小病毒后会引起消化道和呼吸道病症，严重时可导致犬、猫死亡。
因此，了解犬科和猫科动物细小病毒的遗传进化，对于防治犬、猫感染疾病具有重要意义。
二、研究目的本研究的目的是通过犬科和猫科动物细小病毒分离株VP2基因的遗传进化分析，探讨其基因型特征以及可能的起源及传播途径。
三、研究方法通过文献调研和实验室测序，收集、比对和分析犬科和猫科动物细小病毒分离株VP2基因序列数据，并使用生物信息学工具进行DNA序列的物系和进化树分析，得出遗传演化规律和基因型特征。
四、研究内容1. 犬科和猫科动物细小病毒分离株VP2基因的收集和比对；2. DNA序列的物系和进化树分析；3. 遗传演化规律分析；4. 基因型特征分析。
五、研究预期结果1. 收集到多个犬科和猫科动物细小病毒分离株VP2基因序列数据；2. 通过比对和分析数据，得到细小病毒的物系演化树；3. 发现和分析犬科和猫科动物细小病毒的遗传演化规律和基因型特征。
六、研究难点与解决方案1. 分离株VP2基因序列数据的获取和数据比对的准确性问题；解决方案：对数据源的准确性进行评估，对异常数据进行清理，使用比对软件进行多次比对提高数据的准确性。
2. 如何选择合适的生物信息学工具进行数据分析和处理；解决方案：参考已有研究文献，选择相应工具进行分析和处理，并结合实际情况锤炼。
3. 对犬科和猫科动物细小病毒的遗传进化机制理解不够深入；解决方案：广泛查阅相关研究文献和专家意见，研究原理机制，并创新性地提出自己的见解。
七、研究时间表1. 数据收集和比对（2个月）；2. 生物信息学分析和处理（3个月）；3. 遗传演化规律分析（1个月）；4. 基因型特征分析（1个月）；5. 论文撰写和提交（2个月）。
大理地区犬细小病毒VP2基因变异研究及进化分析
用 同步 法接种到 Ｆ ８ １ 细胞 中分 离、鉴定 、培养 。收毒后提取基 因组 ＤＮ Ａ，并以此为 Ｐ Ｃ Ｒ模板 ；根据 Ｇｅ ｎ ｅ Ｂ ａ ｎ ｋ
己发表 的犬细小病毒 ＶＰ ２ 基 因序 列设 计合 成一对 引物，进行 Ｐ Ｃ Ｒ扩增获得 Ｖ Ｐ ２全序 列基 因 ｌ ７ ５ ５ ｂ ｐ片段 ，并进 行序列 测定。利 用 ＤＮ ＡＳ ｔ ａ ｒ 软件 对 ４ 株 病毒的 Ｖ Ｐ ２ 基 因序 列以及氨 基酸序列进行分析 ，与 Ｇ ｅ ｎ ｅ Ｂ ａ ｎ ｋ上 已发表
ห้องสมุดไป่ตู้
的１ ６ 株 犬细小病毒 比 较， 发现病毒的核苷酸 同源性在 ９ ７ ． ９ ％ ～ ９ ９ ． ９ ％之 间，氨基酸 同源性在 ９ ６ ． ４ ％ ～ ９ ９ ． ９ ％之 间，
总体 同源性在 ９ ８ ％ 以上 ，进化树分析显 示没有 形成明显 的 Ｃ Ｐ Ｖ 中国进化分 枝，表 明 ＶＰ ２基 因变异相对较 少。 同时分 离到的 ４株 Ｃ Ｐ Ｖ病毒又遵循 ２ ａ 亚型 的进化 特征 ，因此确定 目前云南大理地 区犬细小病毒的流行情 况仍
＇ １ ｒ 锄 物幸 蠡 ｌ 设
大理地 区犬细小病毒 Ｖ Ｐ ２基 因 变异研 究及进化分析
李志敏 ，丁福先 ，何 秉宁 ，袁鸿 胜 ，施 瑞华 （ 云 南省 大理 州动物疫 病预 防控 制 中心 ，云 南大理 ６ ７ １ ０ ０ ０ ）
摘
要 ：从 云南大理地 区发病 的松狮 犬、德 国牧羊犬和博美 犬的粪便 内和 国产疫苗 中分 离到 ４株 犬细小病毒 ，
以 ＣＰＶ ＿ ２ ａ为 主 。
关键词 ：犬细小病毒 ；ＶＰ ２基 因；变异研 究；进化分析
中 图 分 类号 ：￥ ８ ５ ２ ． ６ ５ ９ ． ２ 文献 标 识 码 ：Ａ 文 章编 号 ： １ ０ ０ ５ ． ９ ４ ４ Ｘ （ ２ ０ １ ３ ）１ ０ — ０ ０ ７ ０ — ０ ４ Ｒｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ ａ ｎｄ Ｅｖ ｏ ｌ ｕｔ ｉ ｏ ｎ Ａ ｎａ ｌ ｙｓ ｉ ｓ ｏ ｆ
犬细小病毒河南方城株分离及VP2_基因序列分析
·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报摘 要：为了解犬细小病毒的临床流行及变异情况，本研究于河南省方城县采集了8份疑似CPV 感染犬粪便样品，经过PCR 检测、CRFK 细胞增殖培养、透射电镜观察和病毒滴度测定后，对其VP2基因进行序列分析。
结果表明5株分离株为犬细小病毒，病毒滴度分别为10-4.22/0.1 mL （China-HN-01株）、10-3.56/0.1 mL （China-HN-02株）、10-3.78/0.1 mL （China-HN-05株）、10-4.47/0.1 mL （China-HN-06株）、10-4.4/0.1 mL （China-HN-07株）。
VP2基因序列比对和遗传进化树分析结果显示，4株分离株基因型为New CPV-2a ，1株分离株基因型为CPV-2c ，5株分离株与疫苗株的同源性为97.8%~98.7%，与国内外参考毒株的同源性为94.0%~99.0%，4株New CPV-2a 基因型毒株与四川的Canine/China/24/2017株亲缘关系最近，CPV-2c 基因型毒株与蒙古国5-MGL 分离株位于同一分支，与我国河南地区的3株CPV-2c 毒株亲缘关系较远。
对河南方城地区CPV 毒株的分析，为研究CPV 变异株在河南地区的传播和宠物疫病防控提供了理论依据。
关键词：犬细小病毒；分离；VP2基因；进化分析中图分类号：S852.65文献标志码： A文章编号：1674-6422（2023）03-0054-08Isolation and Sequence Analysis of VP2 Gene of Canine Parvovirus from Fangcheng, HenanLIN Yuting 1,2, ZHAI Qi 2, ZHAI Shaolun 2, LYU Dianhong 2, ZHOU Xiurong 2, JIA Chunling 2, HUO Wei 2,WEN Xiaohui 2, Wei Wenkang 1,2,3(1. College of Animal Science & Technology, Zhongkai University of Agriculture and Engineering, Guangzhou 510225, China; 2. Institute of Animal Health, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory of Livestock Disease Prevention of Guangdong Province, Scientific Observation and Experiment Station of Veterinary Drugs and Diagnostic Techniques of Guangdong Province, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Guangzhou 510640, China; 3. Agro-biological Gene Research Center, Guangdong Academy of AgriculturalSciences, Guangzhou 510640, China)收稿日期：2021-01-11基金项目：国家重点研发计划（2016YFD0501000）；广东省现代农业产业技术体系创新团队建设专项资金（2019KJ119）；广东省农业科学院学科团队建设（201634TD）；广东省农业科学院院长基金（202024）作者简介：林瑜婷，女，硕士研究生，预防兽医学专业；翟颀，男，助理研究员，主要从事动物疫病诊断技术研究 通信作者：温肖会，E-mail：*******************；魏文康，E-mail：**************犬细小病毒河南方城株分离及VP2基因序列分析林瑜婷1,2，翟 颀2，翟少伦2，吕殿红2，周秀蓉2，贾春玲2，霍 玮2，温肖会2，魏文康1,2,3（1.仲恺农业工程学院动物科技学院，广州510225；2.广东省农业科学院动物卫生研究所 广东省畜禽疫病防治研究重点实验室 农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站，广州510640；3.广东省农业科学院农业生物基因研究中心，广州510640）2023,31(3):54-61Abstract: In order to investigate the prevalence and variation of Canine parvovirus, 8 fecal samples were collected from dogs suspected of CPV infection from Fangcheng county, Henan province. Five CPV isolates were obtained based on PCR amplifi cation, growth on CRFK cells, transmission electron microscopy and virus titration. The TCID 50 titers of these isolates were 10-4.22/0.1 mL (China-HN-01 strain), 10-3.56/0.1 mL (China-HN-02 strain), 10-3.78/0.1 mL (China-HN-05 strain), 10-4.47/0.1 mL (China-HN-06 strain) and 10-4.4/0.1 mL· 55 ·林瑜婷等：犬细小病毒河南方城株分离及VP2基因序列分析第31卷第3期犬细小病毒病是由细小病毒科（Parvoviridae）细小病毒属（Parvovirus ）的犬细小病毒（Canine parvovirus, CPV）感染犬只引起的致命性传染病[1]，该病常以出血性肠炎、白细胞含量显著减少、腥臭血便和严重脱水等为主要临床特征，部分表现为突然死亡的急性心肌炎型[2]。
一株犬细小病毒的分离及VP2基因序列分析
种优 势 ， 尽管不 如育肥性 能 明显 。商品 肉兔 半净膛 率和 全净膛率分别 为５ ． Ｉ ３４ ５６ ］ ． ％￣ ５ ％，后腿 比例 高达 ３ ． ９１ ％，显
示 出较 高 的产 肉 能 力 。 在 肉品 质 方 面 ，Ｉ 和 商 品 代 的 熟 Ｉ 系 肉率 高 于Ｉ ， 说 明 保 水 性好 ；剪 切力 值 较 小 ， 肉较 嫩 。 系
；＾：Ｊ：
ｍ
＾：Ｊ： ：Ｊ １
５７ 。Ｉ Ｉ 交 商 品 兔 在 产 肉性 能 上 也 有 一 定 程 度 的 杂 ． ％ ＸＩ杂
装 的加 工。而皮 板品质指标的变异系数均在 ｌ％以下 ，说 Ｏ 明不 同皮张质量 的一致性较高 。
表３ 商品 兔皮 板质 量评 定结 果 （ｍ、分 ） ｃ
６
２１ 年第 １ （ ０１ 期 总第 １８ ） ６期
毒 ，定名为Ｂ Ｙ２ ０ 。对其ＶＰ 基因进行 了扩增测序 ，初 Ｊ ０６ ２
步 确 定 为２ 亚 型 。 对 该 病 毒 的遗 传 特 性 与 演 化 进 行 了研 ａ
显 的细 胞病 变 ，病 变发 生 在接 种后 ５ｈ，表现 为细 胞 圆 ０
山
３ ２
一
株 犬细 小病毒 的分离及Ｖ ２ 因序 列分析 Ｐ基
杨龙峰① 李英 杰① 艾萍萍① 肖胜 南① 韩 柳② 焦万亮① 王建芬① 张延光① 刘月焕
（ 北京 市延 庆县 农业局 １２０ ② 北 京诚安 动物 医院 ① ０ １０
摘要
⑧ 北京 市农 林科 学 院畜牧 兽 医研 究所 ）
中图分类号 ：￥ ５ ． ８ ２ ５５ ６
１７ 年 ，犬 细小 病毒（ａ ｉｅ ｐｒｏ ｉ ｓ Ｐ 同 时从 ９８ ｃｎｎ ａｖ ｖｒ ， ｖ） ｕｃ 加拿大（ ｈｍｓｎ 、澳 大利亚（ ｌ ） Ｔ ｏ ｏ 等） Ｋｅｙ 患肠炎 的病犬 中分 ｌ 离获得【。Ｃ Ｖ可 引起 犬的出血性肠 胃炎和心肌 炎，并使 ‘ Ｐ 】 白细胞 大量减 少 ，在 幼犬 中的发病 率和死 亡率 都很高 ， 症 状 与猫 泛 白细 胞 减少 症 相似 。本 病 虽 出现 的时 间不
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分类号：单位代码：10019 密级：学号：S0*******硕士学位论文北京地区犬细小病毒VP2基因序列分析和流行病学调查Sequence analysis of VP2 gene and epidemiological survey ofcanine parvovirus in Beijing研究生：宋永奇指导教师：吕艳丽副教授合作指导教师：申请学位门类级别：农学硕士专业名称：预防兽医学研究方向：兽医微生物学与免疫学所在学院：动物医学院2008年 5 月独 创 性 声 明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。
尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。
与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。
研究生签名：时间：年月日关于论文使用授权的说明本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。
同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。
(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月摘 要犬细小病毒（Canine parvovirus，CPV）感染是目前危害养犬业的最严重传染病之一。
为了了解CPV的变异情况，本研究在2006-2007年间不同时间采集CPV感染患犬粪便样本20份，经PCR方法从中扩增出了CPV VP2基因，并对该基因进行了序列测定与分析；为了了解本病的流行状况，本研究对临床上常用的CPV检测方法的可靠性进行了评估，并在此基础上对2005-2007年到中国农业大学动物医院诊治的所有有呕吐、腹泻和呕吐或腹泻症状的犬粪便样本的CPV检测结果进行了统计分析，获得如下结果：VP2基因全长1755bp，编码585个氨基酸。
经核苷酸及推导的氨基酸序分析显示，20个样本中，有19个属于CPV-2a，1个为CPV-2b；所有病毒样本VP2的297氨基酸残基位点均发生Ser→Ala的置换；基因型为CPV-2a样本的555氨基酸残基位点均发生IIe→Val的置换。
与经典的CPV-2a/2b参考毒株比较，80.0%（16/20）的样本在324位有Tyr→Ile的置换；样本CPV/BJ005/07和CPV/BJ008/07的139位氨基酸残基由Val置换为Ile；样本CPV/BJ004/07和CPV/BJ050/07分别在226与382位发生置换（Ser→Asn，和Arg→Lys)。
应用DNAStar软件对Ile-139、Asn-226、Ile-324和Lys-382置换进行的抗原表位变化分析表明，这4处氨基酸残基置换都不会改变病毒的抗原表位。
将犬细小病毒抗原检测试剂盒与HA-HI和PCR方法进行了比较：犬细小病毒抗原检测试剂盒与HA-HI法比较，其敏感性、特异性和总符合率分别为100.0%、84.5%、90.8%；与PCR法比较，其敏感性、特异性和总符合率分别为85.3%、96.2%、90.0%。
这表明该试剂盒可以用于CPV 的流行病学调查。
CPV检测数据统计分析显示，2005、2006和2007年度CPV年检出率分别为24.14%、35.73%和25.52%；该病一年均可发生，但以第一和第四季度发病率较高；各年龄犬均可感染，但1-3月龄幼犬易感性最高。
关键词：犬细小病毒（CPV），VP2基因，序列分析，诊断方法，流行病学调查AbstractAt present, canine parvovirus (CPV) infection is one of most severe infectious diseases of domestic dogs. In order to understand the variation of CPV, we in this study amplified by PCR, sequenced and analyzed the VP2 gene of twenty faecal samples collected from dogs infected with CPV at different time from the year 2006 to 2007. In order to understand the epidemic situations of CPV infection, we on the base of evaluation of CPV Ag Test Kit, collected and analyzed the results of CPV detection of all dogs sent to China Agricultural University Animal Hospital from the year of 2005 to 2007, and whose clinical symptoms were vomiting and diarrhea, and vomiting or diarrhea. the results of these tests were as follow:The complete VP2 gene sequence was 1755bp encoding 585 amino acids. Sequence analysis of nucleotide and deduced amino acid residues revealed that nineteen samples were CPV-2a and one CPV-2b among the twenty canine parvovirus. All the samples had an amino acid substitution of residue 297 in VP2, Ser to Ala. nineteen CPV-2a samples studied in this study had substitution (IIe→Val) at residue 555 in VP2. Compared with classical CPV-2a/2b isolates, some samples had new amino acid substitutions: CPV/BJ005/07 and CPV/BJ008/07 at amino acid residue 139 in VP2 was Ile instead of Val; Ile-324 mutants accounted to 80% (16/20). Amino acid substitutions (Ser→Asn and Arg→Lys) of residue 226 and 382 were found in samples of CPV/BJ004/07 and CPV/BJ050/07, respectively. Four radical amino acid substitutions (Ile-139, Asn-226, Ile-324 and Lys-382 ) of VP2 did not change viral epitopes by DNAStar software analysis.The result of CPV detection of CPV Ag Test Kit was compared with those of HA-HI and PCR tests: It showed 100.0%, 84.5% and 90.8%, respectively in relative sensitivity, specificity and overall agreement between CPV Ag Test Kit and HA-HI, and 85.3%, 96.2% and 90.0 %, respectively as in comparison with PCR. The results indicated that CPV Ag Test Kit was a suitable test using in clinic and epidemiological survey.The results of CPV epidemiological survey displayed that the positive ratio of CPV infection was 24.14%, 35.73% and 25.52% in the year of 2005, 2006 and 2007 respectively. CPV infection of domestic dogs could take place through the year, but the highest infection rate was the first and fourth quarters. Domestic dogs of every years of age could be infected with CPV but puppies between 1-3 moths were more susceptivity than others.Key words:Canine parvovirus(CPV), VP2 gene, sequence analysis, diagnostic method, epidemiological survey目录第一章引言 (1)1.1 CPV感染研究进展 (1)1.1.1 病原学 (1)1.1.2 流行病学 (7)1.1.3 诊断方法 (7)1.1.4 预防 (14)1.2 研究意义与研究目标 (16)第二章北京地区犬细小病毒VP2基因序列分析 (17)2.1 材料 (17)2.2 方法 (17)2.3 结果 (19)2.4 讨论 (28)2.5 小结 (29)第三章犬细小病毒流行病学调查 (30)3.1 CPV抗原检测试剂盒临床应用评估 (30)3.1.1 材料 (30)3.1.2 方法 (31)3.1.3 结果 (33)3.1.4 讨论 (35)3.2 犬细小病毒流行病学调查 (37)3.2.1 材料 (37)3.2.2 方法 (37)3.2.3 结果 (37)3.2.4 讨论 (39)3.3 小结 (40)第四章结论 (41)参考文献 (42)致谢 (48)作者简介 (49)缩略词表缩写 英文名称 中文名称MVC Minute virus of canine 犬极细小病毒CDV Canine distemper virus 犬瘟热病毒DNA Deoxyribonucleicacid 脱氧核糖核酸pair 碱基对bp baseNS Non-structural-proteins 非结构蛋白protein 衣壳蛋白VP Capsidunit (基因)图距单位mu mapORFs open reading frames 开放阅读框g gram 克mRNA messenger ribonucleic acid 信使核糖核酸acid 多聚腺苷酸Poly(A) PolyadenylicÅ Å长度计量单位（1m=1010 Å） kDa kilodalton 千道尔顿CPV-2 Canine parvovirus type 2 犬细小病毒2型CPV-2a Canine parvovirus type 2a 犬细小病毒2a亚型CPV-2b Canine parvovirus type 2b 犬细小病毒2b亚型CPV-2c Canine parvovirus type 2c 犬细小病毒2c亚型virus 猫泛白细胞减少症病毒 FPV Felinepanleukopeniamin minute 分钟ml milliliter 毫升h hour 小时μL microliter 微升M mole/liter 摩尔/升CA V-2 Canine adenovirus type 2 犬腺病毒2型CPIV-2 Canine parainfluenza type 2 犬副流感病毒2型saline 磷酸盐缓冲盐水PBS phosphate-buffereds second 秒kidney(cell line)马-达二氏犬肾(细胞系)canineMDCK Madin-Darbyng nanogram 纳克minutes 转/分钟perr/min revolutionsnm nanometer 纳米MEV Mink enteritis virus 水貂肠炎病毒parvovirus 牛细小病毒BPV BovinePFU plaque forming unit 蚀斑形成单位triphosphates 三磷酸脱氧核苷dNTPs deoxy-ribonucleosideMcAbs monoclonalantibodies 单克隆抗体liter 微摩尔/升μM micromole/liter 毫摩尔/升mM millimole/第一章 引言1.1 CPV感染研究进展1978年，澳大利亚的Kelly和加拿大的Thomson等[1]同时从患肠炎的病犬粪便中分离获得的犬细小病毒（Canine parvovirus，CPV）。