结核分枝杆菌最新检测技术
肺结核实验室检测方法金标准
肺结核实验室检测方法金标准
肺结核实验室检测的金标准是基于培养和鉴定结核分枝杆菌。
以下是具体步骤：
1.痰液样本收集：患者需要提供早晨醒来时的深咳痰液样本，
以获得有效的细菌数量。
2.痰液预处理：痰液样本经过预处理，包括离心和去除杂质。
这一步通常包括液体化和浓缩痰液。
3.痰液培养：将预处理后的痰液接种到培养基上，通常是液体
培养基。
培养基中的结核分枝杆菌将逐渐增殖形成菌落。
4.鉴定：通过常规培养、染色和生化试验等方法，鉴定已培养
的菌落是否为结核分枝杆菌。
5.药敏试验：对已鉴定的结核分枝杆菌进行药敏试验，以确定
哪些药物对其具有抗菌作用，从而为治疗方案的选择提供依据。
此方法被认为是金标准，因为它能够准确检测到结核分枝杆菌，并且可以确定其对药物的敏感性，为结核病的诊断和治疗提供可靠的结果。
但是，该方法需要相对较长的时间（通常需要几周）来进行培养和鉴定，因此在临床实践中可能需要其他更快速的检测方法来尽早确诊结核病。
结核分枝杆菌快速检测中的新技术
结核分枝杆菌快速检测中的新技术
江苏省盐城市卫生防疫站 厦门大学肿瘤和细胞工程国家专业实验室 汤 权 夏宁邵 综述 审校
摘要
结撮分枝杆 茵体外培养生长缓慢的特性和耐多药性给传统的实验室检测和薛物教瘩试验带来很
多麻烦， 从而培结撮病的诊 断和治疗增加 困 。随着现代实验技术的发展 ， 难 分子生物 学技术、 色谱技术 以及 计算机等技 术在谊茵中的研究和应用已显示出极大的优势， 不仅能够快速鍪定到算种和株 的水平， 还能够提 供快速的药教试验的结果和考棱抗结棱治疗的效果 ， 并可进行耐药基 因的分析及分子流行病学调查， 为人类 最终控制并战胜 培柱病提供 了有效的手段 。 结核病是一古老的传染性疾病 。据统计 ， 结核 病在过去 ２０ 中致使 ｌ 亿人死亡。据世界卫生 ０年 Ｏ 用， 包括插人 序列 Ｉ Ｉ 、 Ｓ １ 直接重复序列 Ｄ 富古 ￣０ Ｋ、 Ｇ 的多态性重复序列 、 Ｃ 主要多态性前后排列的重复 性序列以及（ 】 Ｇ ） 与寡核苷酸序列… ， 分子分型技
的水平【 ； ２ 另外一种被广泛应用的方法是采用高教 液相色谱 （ Ｐ Ｃ 测定分枝杆 菌细胞壁 中具有种特 ＨＬ） 异性的分枝菌酸 ， 根据峰高和峰相对保 留时 间鉴定
不 同的种 。
（ ）Ｎ － Ｄ Ａ指纹 技术
ＤＡ Ｎ 指纹技术是用来描述细菌基 因组 的一 个
或多个独特性 的技术。仅在结核杆菌染 色体 Ｄ Ａ Ｎ 中发现插人序列 Ｉ ６１０ 以此为基础 ， Ｓ ， ０ 根据插人序
（ ） Ｌ － ｍ＇Ｃ
读数， Ｂ Ｃ￣Ｃ 与 Ａ Ｉ 系统的符合率达 ９％【 ９ 。 Ｌ ｏｉ ｉ ｚ 等将一段 来源 于非 常保 守 的 １．ｒＮ ｇｚ ６ Ａ ＳＲ 基因区经惨饰过 Ｄ Ａ片段与野生型 Ｄ Ａ进行协同 Ｎ Ｎ 扩增 ， 扩增 后 的产物通过 凝胶 电泳分析 ， 光密度 计 用
ELIspot技术检测结核分枝杆菌感染检测原理
ELIspot技术检测结核分枝杆菌感染检测原理检测原理是：机体感染结核分枝杆菌后，存在于血液中的特异性效应T淋巴细胞会在再次接触结核分枝杆菌特异抗原时，产生和分泌IFN-γ，通过检测能够释放IFN-γ的T淋巴细胞数量，用于结核分枝杆菌感染及结核病的辅助诊断。
该检测方法相对于结核菌素试验，具有更高的特异性。
由于结核菌素试验中用的结核菌素是从结核分枝杆菌中提取的非种属特异的性分子，因此存在与卡介苗（BCG）的交叉，接种过BCG的人群即使没有感染结核也可能会出现结核菌素试验阳性。
而ELIspot检测所用的结核分枝杆菌特异抗原与BCG抗原无交叉，不受BCG接种的影响，未接种BCG和接种BCG的人群均可用该法进行结核病感染的筛查和结核病的辅助诊断。
目前应用的ELIspot检测试剂盒是由英国Oxford Immunotec公司生产的T-SPOT®TB试剂盒。
其检测方法如下：1.抗体包被将适量人IFN-γ抗体预先包被于96孔ELIspot板上。
2.标本采集及准备采集8小时内的肝素抗凝血，用Ficol离心分离外周血单核细胞（PBMC），用细胞培养液洗涤2次后，重悬于细胞培养液中。
3.细胞计数及稀释用台盼蓝染色计数法对PBMC细胞悬液计数，将细胞悬液浓度调整至2.5×105个细胞/100μl。
4.抗原刺激及孵育每个待检样本均需设阳性对照孔、阴性对照孔和检测孔。
阳性对照孔加入植物血凝素（PHA）作为阳性刺激抗原，阴性对照孔不加任何抗原刺激，检测孔加入结核特异性抗原。
若有几个特异性抗原进行分别刺激，检测孔可根据需要设置多个孔。
向阳性、阴性对照孔及检测孔内各加入100μl的PBMC细胞悬液，将ELIspot板置于37℃5%CO2培养箱内静置孵育16～20小时。
孵育期间不能移动ELIspot板，必须保证板静置不动。
5.斑点显色及计数弃除板内的细胞培养液，每孔加入200μl的PBS缓冲液洗涤3～5次，弃净板内的液体，向每孔加入100μl稀释好的生物素标记抗体，37℃孵育1小时。
《结核分枝杆菌和人类免疫缺陷病毒感染双向筛查技术应用专家共识》(2024)要点
《结核分枝杆菌和人类免疫缺陷病毒感染双向筛查技术应用专家共识》（2024）要点1 TB/HIV双向筛查技术手段1.1 在HIV感染者/AIDS患者中开展活动性TB/结核感染筛查目前WHO推荐用于HIV感染者/AIDS患者活动性TB筛查的方法有TB症状筛查、CXR、C-反应蛋白（CRP）检查、尿脂阿拉伯甘露聚糖抗原侧流（LF-LAM）免疫检测以及MTB 分子快速诊断方法。
我国工作实施方案中还要求对于HIV感染者/AIDS患者定期进行TB 病原学检查。
1.1.1 TB症状筛查我国对于感染HIV病毒的人群（PLHIV）的TB症状筛查主要基于门诊随访时的问卷调查，筛查症状包括：咳嗽、咳痰持续2周以上；痰中带血、反复发热持续2周以上；反复夜间出汗、无法解释的体重明显下降、经常容易疲劳或呼吸短促、淋巴结肿大。
1.1.2 胸部影像学检查胸部影像学检查是筛查、诊断或排除活动性肺结核的重要手段之一。
胸部影像学检查包括CXR、胸部CT断层扫描等，是普及性较广的一种检测手段。
1.1.3 TB细菌学检查TB细菌学检查是诊断活动性肺结核的重要检测方法，主要包括痰涂片和痰培养，临床上广泛用于一般人群肺结核的诊断和鉴别诊断。
目前尚无其他检测手段能代替痰培养作为TB实验室确诊的“金标准”。
1.1.4 快速分子生物学检查随着核酸检测技术的迅速发展，快速分子生物学检测已广泛应用于TB诊断，国外研究显示其在HIV感染者/AIDS患者中开展结核筛查也具有较高的灵敏度和特异度。
1.1.5 CRP检查CRP是一种非特异性的炎性标志物，与机体的感染或应激状态相关。
CRP检测简便、价廉、易操作，是POCT的常用项目，普及性高。
1.1.6 LF-LAM免疫检测我国尚未引进该项技术。
1.1.7 结核感染检查WHO和我国推荐用于HIV感染者/AIDS患者LTBI筛查的方法有结核菌素皮肤试验（TST）、γ-干扰素释放试验（IGRA）和基于结核分枝杆菌抗原的皮肤试验（TBST）。
结核分枝杆菌耐药检测技术选择——分子线形探针方法
2
1、单耐药：结核病患者感染的结核杆菌体外被证实对 一种一线药物抗结核药物耐药。 2、多耐药：结核病患者感染的结核杆菌体外被证实对 不同时包括异烟肼、利福平在内的一种以上的一线抗 结核药物耐药。 3、耐多药（MDR－TB）：结核病患者感染的结核杆 菌体外被证实至少对异烟肼、利福平耐药。
2222
核酸DNA提取-痰
6%NaOH和2.94%枸橼酸钠等体积混合，配制 1%NALC前处理液。 取2ml涂阳痰标本转移到50ml离心管，加1-2倍体积前 处理液，振荡30s,静置15分钟。 加PBS到45ml，3000g离心20min。 倒掉上清，加2ml PBS混匀沉淀，分别取1ml转移到 1.5ml离心管。 取1支管12000rpm离心5min，吸弃上清。
3
耐药结核分枝杆菌机制
基因突变
结核分枝杆菌产生耐药性的主要原因
药物外排泵的影响
结核分枝杆菌细胞壁结构的改变
4
耐药产生的主要原因
微生物上，耐药性是基因突变引起药物 对突变株的效力降低造成的。 临床及管理上，不足够的或不恰当的治 疗导致结核病患者体内的耐药突变株变 成优势株。
5
中国耐药流行情况
如果不能立即实验，-20度保存。
2525
PCR扩增
每个病例取5ul DNA样本到扩增混合液中
2626
PCR扩增
痰标本和菌株用不同程序
培养标本 15 min 95℃ 30 sec95℃ 2min58℃ 25 sec 95℃ 40 sec 53℃ 40 sec 70℃ 8 min 70℃ 4℃ 24 h 1 个循环 1 个循环 20 个循环 30 个循环 1 个循环 10 个循环 直接病人标本 1 个循环 10 个循环
结核分枝杆菌诊断技术的发展及目前临床应用的新型诊断技术产品分析
结核分枝杆菌诊断技术的发展及目前临床应用的新型诊断技术产品分析快速准确地诊断出结核分枝杆菌感染是控制和治疗结核病的前提和关键。
多年来，结核杆菌的诊断技术在不断地发展和创新，近年来，一些针对结核杆菌检测的新方法陆续被报道，一些新型的诊断技术产品也陆续上市。
本资料综述了结核杆菌的主要诊断方法，并对目前国际市场上广泛应用的商业化诊断技术产品进行了简要分析。
标签：结核分枝杆菌；诊断技术；分析Advance in diagnosis techniques of Mycobacterium tuberculosis and analysis of new diagnostic technologies and products in clinical applicationFENG?Meimei1??SU?Wenqin21.Haikou VTI Biological Institute,Haikou 570311,China;2.Department of Pharmacy,Hainan Medical College,Haikou 571199,China[Abstract] Fast and accurate diagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection is the key and prerequisite to control and treatment tuberculosis.For many years,the diagnostic techniques of Mycobacterium tuberculosis have been developing and innovating.In recent years,some new techniques for Mycobacterium tuberculosis detection were reported and some new diagnostic products have been listed.This paper reviewed the main diagnosis techniques of Mycobacterium tuberculosis,and analysed briefly the commercialized diagnostic products which are used widely in the international market now.[Key words] Mycobacterium tuberculosis;Diagnosis;Analysis结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）是引起结核病的病原菌，可侵犯全身各器官，以肺结核最多见。
结核分枝杆菌的微生物学诊断方法
结核分枝杆菌的微生物学诊断方法
1.痰液涂片染色：这是最常用的方法之一、将痰液制备成涂片，进行
酸性染色，如抗酸杆菌染色和耐酸染色。
结核分枝杆菌是抗酸杆菌，其细
胞壁富含脂质，可以抵抗酸性染料的脱色作用。
这种方法可以快速检测出
结核分枝杆菌的存在。
2.结核分枝杆菌的培养：这是鉴定结核分枝杆菌的“金标准”。
痰样
品通常会涂在含有富含营养物质的培养基上，并在适当的温度和湿度条件
下孵育。
结核分枝杆菌需要一个相对较长的孵育时间（通常需要数周）才
能生长和生成可见的菌落。
分枝杆菌的培养是确诊结核病的关键步骤，同
时还可以进行对特定抗结核药物的药敏试验。
3.伊红染色：这种方法旨在鉴定酸酒杆菌属分枝杆菌和其他酸杆菌的
超微结构。
伊红染色可使细胞壁和细胞内储存的色素显现为红色或粉红色。
该方法可以帮助确定分枝杆菌的类属。
4.PCR检测：聚合酶链反应（PCR）能够通过扩增目标基因片段来检
测和诊断结核分枝杆菌。
这种方法具有高度特异性和灵敏度，并可以通过
荧光标记的探针来定量检测。
5.蛋白质组学：蛋白质组学技术通过检测和分析结核分枝杆菌内部蛋
白质的组成和变化，可以为诊断和治疗提供信息。
质谱法是一种常用的蛋
白质组学技术，可以通过检测菌落样品中的特定蛋白质来鉴定结核分枝杆菌。
总的来说，微生物学诊断方法在结核分枝杆菌检测和鉴定中起着至关
重要的作用。
这些方法可以帮助医生确定结核病的诊断和治疗方案，并对
结核分枝杆菌的流行病学研究和控制提供重要的科学依据。
最新结核分枝杆菌实验室检测方法
最新结核分枝杆菌实验室检测方法
麻风分枝杆菌
• 麻风分枝杆菌（M.leprae）是麻风病的病原 体，也是抗酸杆菌，但较结核分枝杆菌短 而粗，两端尖细，抗酸染色着色均匀，呈 束状或团状排列，结核分枝杆菌多散在， 偶有聚集。为典型的胞内寄生菌，有麻风 杆菌存在的细胞胞浆呈泡沫状，称麻风细 胞。
最新结核分枝杆菌实验室检测方法
分枝杆菌分子诊断系统（协和医院）
实时荧光PCR
基因芯片快速检测平台
筛查、鉴别诊断
菌种鉴定
MDR早期诊断
最新结核分枝杆NTM鉴别诊断
➢ 高 效： 一个样本可同时检测结核分枝杆菌和NTM ➢ 快 速： 4周（菌培） 3 小时 ➢ 灵 敏： 10 个菌/反应（TB）；102 个菌/反应（NTM）
• 结核菌培养仍是目前诊断的金标准．尤其是药敏 试验结果在指导临床用药及耐药性检测等方面具 有重要作用, 是鉴定是否为活菌的可靠方法．
• 1、传统的固态培养法 需要4～6周才能检测到结核菌的生长．而且阳
性率也只有30％-40％；特异性差．各种分枝杆菌 均可生长。要确定是否为结核菌．需结合分枝杆 菌菌种鉴定和药物敏感性试验。
• 不能区分结核和非结核分枝杆菌 • 不能区分活菌和死菌 • 敏感性差，一般1mL痰中有5000-10000条
菌时可检出，而培养可检出>10-100条菌.
最新结核分枝杆菌实验室检测方法
发光二极管荧光显微镜（LED）
• 荧光显微镜成本高、易损坏、耗电量大、 光源寿命短、显微镜价格昂贵且需要在暗 室内工作等，荧光染色法一直没有在结核 病痰涂片诊断中得到广泛的应用。
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中的包被抗体和胶体金, 导致错误結果.
试剂盒中的样品缓冲液可以破坏菌体的蛋白酶, 使菌体失活, 但是不影响 试验結果及检测.
胶体金免疫数字测试卡
HR201全自动金标分析仪
特点： 定性和模拟定量检测 触控界面、操作简单 体积小、便于携带 快速精确（10秒出判读结果） 数据储存量大 内置热敏打印机 可实时打印检测结果 支持LIS系统
• 据北京京煤集团总医院结核病科孔冬青主任调查，肺结核 科住院治疗的611例煤工尘肺合并肺结核患者，经筛查， 检出痰菌阳性223例。即三分之一的人均患有肺结核。该 数据逐年递增。
危害
WHO对结核个案定义
• 疑似结核个案 –有呈现结核病征与症状（低烧、全身乏力或消瘦、夜 间盗汗、女性可导致月经不调或停经）
2.Y-干扰素
原理：利用T细胞对结核菌的记憶,加入结核菌抗原,产
生干扰素的多寡.判定是否为潜伏感染者.
检测标本：血液（目前WTO已禁止使用 血液标本检测）
缺 点
收费标准：500-800元
适用于高危险人群检测. 不宜用于普 查. 操作复雜.需要专业人员及设备.
3.T-SPOT.TB（体外酶联免疫斑点技术）
特异性
85.9%
痰液检测结核杆菌 染色与TB抗原快速检测试剂之比较
痰液耐酸性染色
濟南杏恩 結核菌檢測試劑盒
痰液(未經處理)
樣品緩衝液
結核分枝桿菌 +
非結核分枝桿菌 +
非結核分枝桿菌 -
結核分枝桿菌+
培養確認
濟南杏恩 結核菌檢測試劑盒 固態觀看 PCR 全自動化培養非結核分枝桿菌 -
我国流行概况
是全球22结核病高负担国家之一 活动性肺结核病人数居世界第二，仅次于印度 是我国重点控制疾病之一 目前估算全国活动性肺结核病人450多万，每年新发传 染性肺结核患者150多万 全国约45%的人受过结核菌的感染，明显高于全球水平
2014年全国法定法定传染病发病率
煤矿行业结核比率
–长期咳嗽超过2周
• 确诊结核个案 –结核菌培养阳性的病人 –不能有例行培养结核菌的国家，痰涂片耐酸染色结果 两次都呈阳性,亦可考虑为确诊病人
一般临床结核检测方法
• 1.结核的常规检测 • 2.Y-干扰素 检测技术
• 3.T-SPOT.TB检测技术
• 4.GeneXpert检测技术
1.常规检测检测
谢谢！
优势
可做非肺部结核病检验 建立一个快速且精确的检验方法（5-15分钟判读 结果） 广泛用于一般人群普查（早期诊断，早期治疗） 可做为培养确认试剂是否为结核分枝杆菌(MTB)或 非结核分枝杆菌(NTM)之区别 评价结核临床疗效及治疗方案
定位：筛查
注意事項
服药治疗的结核病人, 可能会因为药物抑制蛋白分泌, 所以成阴性結果. 若是药物治疗的結核病人,进行疗程中追踪检测,成阳性反应. 应考虑可能 为抗药性病患. 对于痰液的检测, 必須使用未处理的原痰, 加入试剂盒中的样品缓冲液后 方可检测. 若是使用高浓度及高碱性的 NaOH 软化痰液, 则将破坏试纸条
三甲大型实 验室操作
操作复杂 繁琐
缺点
收费价格： 500-800元
4.GeneXpert检测技术
• 原理：分子生物检测技术
收费标准：约500元
缺 点
配合仪器使用，仪器需约100万元 目前普及范围小
检出率低、费用低
检出率高、费用高
费用低、检出率高
原 理
敏感性
81%
是利用重组基因的技术制造结核菌的特异 性蛋 白（抗体），纯 化后包被吸附于胶体 金上，检测时，当样品有结核菌分泌性蛋 白时，先和包被的胶体金标记物结合，产 生反应。由于层析作用，其反应复合物会 沿着硝酸纤维膜向前移动。
非結核分枝桿菌 -
結核分枝桿菌 +
結核菌快速金標檢測試劑盒 簡易操作步驟
优势
检测结核菌分枝杆菌之特异性分泌性抗原 (Secreted specific protein ) 可取代耐酸染色无法区别分枝(MTB)或非分枝结核(NTM)杆 菌之困扰. 取代现行的非特异性纯化蛋白抗原 (PPD, purified protein derivative). 无交叉反应 ，故也适用于BCG接种的病人或感染非结核之 病人. 高特异性及敏感度.(>80%)