微生物细胞的破碎
常用的几种细胞破碎方法介绍
随着重组DNA技术得到广泛应用以来，生物技术发生了质的飞跃。很多基因工程产物都是胞内物质，必须将细胞破壁，使产物得以释放，才能进一步提取，因此细胞破碎是提取胞内产物的关键步骤，破碎方法的得当与否，直接影响到所提取产品的产量、质量和生产成本。现将近年来常用的几种细胞破碎方法介绍一下。 1. 高压匀浆法 设备是高压匀浆器，它由高压泵和匀浆间组成，美国Microfluidics公司和ATS公司均有产品出售。其破碎机理：细胞在一系列过程中经历了高速造成的剪刀，碰撞以及由高压到常压的变化从而造成细胞的破碎。 存在的问题；较易造成堵塞的团状或丝状真菌，较小的革兰氏阳性首以及有些亚细胞器，质地坚硬，易损伤匀浆阀，也不适合用该法处理。 2. 高速珠磨法 设备是珠后机，瑞士WBC公司和德国西门子机械公司均制造各种型号的珠磨机，其破碎机下：微生物细胞悬浮液与极细的研磨剂在搅拌浆作用下充分混合，珠子之间以及珠子和细胞之间和互相剪切、碰撞，促使细胞壁破碎，释出内含物，在珠波分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出，从而实现连续操作，破碎中，生的热量由夹套中的冷却液带走。 存在的问题：操作参数多，一般赁经验估计并且珠子之间的液体损失30％左右。 3. 超声破碎 频高于15-20KHz的超声波在高强度声能输入下可以进行细胞破碎。其破碎机理：可能与空化现象引起的冲击波和剪切力有关。超声破碎的效率与声频、声能、处理时间、细胞浓度及首种类型等因素有关。 存在问题；超声波破碎在实验室规模应用较普遍，处理少量样品时操作简便，液量损失少，但是超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质变性失活。而且大容量装置声能传递，散热均有困难。 4. 酶溶法 就是用生物酶将细胞壁和细胞腊消化溶解的方法。常用的溶酶有溶菌酶β-1．3-葡聚糖酶、蛋白酶等。 存在的问题；易造成产物抑制作用，这可能是导致胞内物质释放率低的一个重要因素。而且溶酶价格高，限制了大规模利用。若回收溶酶，则又增加百分离纯化溶酶的操作。另外酶港法通用性差，不同菌种需选择不同的酶。 5. 化学渗透法 某些有机溶剂（如苯、甲苯）、抗生素、表面活性剂、金属螯合剂、变性剂等化学药品都可以改变细胞壁或膜的通透性从而使内合物有选择地渗透出来。其作用机理；化学渗透取决于化学试剂的类型以及细胞壁和膜的结构与组成。 存在的问题；时间长，效率低；化学试剂毒性较强，同时对产物也有毒害作用，进一步分离时需要用透析等方法除去这些试剂；通用性差：某种试剂只能作用于某些特定类型的微生物细胞。 本文介绍了几种细胞破碎的方法，可谓各有千秋，在实际应用中，应尽量考虑全面，选择最科学、有效的方法。
实验室常用的细胞破碎方法
实验室常用的细胞破碎方法
实验室常用的细胞破碎方法有物理法和化学法。
1、物理法
（1）反复冻融：将细胞反复放置于-20℃冷冻以及25-30℃环境下，反复冷冻溶解10次-20次。
适用于例如血细胞等大部分哺乳动物细胞。
（2）煮沸法：与冻融法相反，将细胞放置于100℃沸水煮沸5-10分钟，适用于大部分微生物细胞。
（3）超声法：将细胞放置于超声破碎仪中，以一定频率的超声破碎细胞，适用于绝大部分微生物细胞。
（4）渗透压法：将血细胞等细胞膜较为薄弱的细胞放置于纯水等低渗溶液，细胞吸收大量水分破解。
（5）液氮法：植物细胞一般采用液氮捻磨的方法破解细胞。
2、化学法
（1）强酸、强碱溶液：一般应用0.5N NaOH溶液可以裂解绝大部分动物细胞和微生物细胞。
（2）生物酶：一般用溶菌酶、蛋白酶K等酶裂解微生物细胞。
藻类细胞壁破碎方法
藻类细胞壁破碎方法《藻类细胞壁破碎方法》藻类是一类重要的微生物，广泛存在于淡水和海洋环境中。
藻类细胞壁是藻类细胞的外部保护层，具有一定的稳定性和韧性。
然而，对于一些研究和应用方面，需要破碎藻类细胞壁来释放细胞内的物质。
破碎藻类细胞壁的方法对于藻类的研究和利用来说至关重要。
目前，有几种常见的藻类细胞壁破碎方法。
下面将介绍其中的几种方法。
1. 物理破碎法：物理破碎法是指通过力的作用来破碎藻类细胞壁。
常用的方法包括高压处理、超声波处理和机械破碎等。
高压处理是将藻类细胞置于高压容器中，在高压的作用下破碎细胞壁。
超声波处理则是通过超声波振荡的作用来破碎细胞壁。
机械破碎可采用研磨、研究等方法，将藻类细胞与研磨材料或研磨球一起放入容器中，通过摩擦和碰撞来破碎细胞壁。
2. 化学破碎法：化学破碎法是指利用化学药剂破坏细胞壁结构。
常用的化学方法包括酶解法和酸碱处理法。
酶解法采用纤维素酶、壁蛋白酶等酶类来破坏细胞壁的结构。
酸碱处理法则是利用酸或碱溶液来调节环境的pH值，使细胞壁产生变化从而破裂。
3. 生物破碎法：生物破碎法是指利用其他生物的作用来破碎细胞壁。
一种常用的生物方法是利用震荡破碎机中的珠子或足球破碎机中的足球，将藻类细胞与珠子或足球一起投放，通过震荡和摩擦的作用破碎细胞壁。
除了上述方法外，还有一些特殊的破碎方法，如电击破碎法、梯度离心法等。
电击破碎法是将细胞悬浮液置于电击装置中，通过电场的作用破碎细胞壁。
梯度离心法则是通过离心将细胞悬浮液与重质离心液进行层析分离，从而破碎细胞壁。
综上所述，破碎藻类细胞壁是藻类研究和应用中的重要步骤。
以上介绍的方法仅是常见的几种破碎方法，不同的研究和应用目的可能需要选择不同的方法。
未来，随着科学技术的不断发展，相信会有更多更高效的藻类细胞壁破碎方法被开发出来，为藻类研究和应用提供更多的可能性。
微生物细胞的破碎及破碎率测定1
（1） 研磨法
研磨：将细胞悬液与玻璃珠、石英砂或氧化铝一起快速 搅拌或研磨，使细胞破碎。
实验室设备：Mickle高速组织捣碎机和Braun匀浆器， 利用玻璃小珠撞击微生物细胞而破碎。
主要缺点：温度迅速升高，需冷却。 另外，较大量的细胞可用胶质磨来处理。
4. 超声波在液体中起空穴作用，使液体温度会快速 升高，可采用短时间的多次破碎，同时可补加冰 浴冷却。
思考题
1. 细胞破碎的方法有哪些？ 2. 超声波破碎细胞时应注意的问题是什么？ 3. 计算本次实验细胞破碎的破碎率。
实验步骤
1、研磨法
• 细胞培养和收集：将活化菌种接入肉汤液体培养基中， 37℃振荡培养。当到达对数少长期后(约18h)，用离心 机收集细胞，3500rpm离心20min。
• 菌体悬液的制备；取湿细胞5-10g悬浮于30ml细胞破碎 缓冲液中。
• 研磨：在研钵中加入适量石英砂，与菌悬液混合，研 磨10min。
• 超声波破碎： 800W，工作6s，间歇6s，破碎75次。 • 破碎率的测定：革兰氏染色法（初染1’、媒染1’、
脱色20-30’’、复染4’）、镜检计数。
3、酶解法
• 细胞培养和收集：将活化的巨大芽孢杆菌种接入肉汤 液体培养基中，37℃振荡培养。当到达对数少长期后 (约18h)，用离心机收集细胞，3500rpm离心20min。
例如，破碎的革兰氏阳性菌常可染色成阴性菌的颜 色，利用革兰氏染色法未受损害的酵母细胞呈现紫色， 而受损害的酵母细胞呈现亮红色。
（2）测定释放的蛋白质量或酶的活力
测定悬浮液中细胞内含物的增量来估算破碎率。 通常将破碎后的细胞悬浮液离心，测定上清液中 蛋白质的含量或酶的活力，并与100％破碎所获得的 标准数值比较。
生物分离工程 第4章-细胞的破碎-
细胞壁的组成与结构
微生物 壁厚/nm 层次 主要组成 革兰氏阳性 细菌 20~80 单层 肽聚糖（40 ％～90％）、 多糖、胞壁 酸、蛋白质、 脂多糖（1 ％～4％） 革兰氏阴性 细菌 10~13 多层 酵母菌 100~300 多层 霉菌 100~250 多层
肽聚糖（5 葡聚糖（30 多聚糖（80 ％～10％） ％～40％） ％～90％） 脂类、蛋白质 脂蛋白、脂 甘露聚糖 多糖（11 （30％）、 ％～22％） 蛋白质（6 磷脂、蛋白 ％～8％）、 质 脂类（8.5 ％～13.5）
n
为了研究细胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解各种微 生物细胞壁的组成和结构。
8
第一节 细胞壁的组成与结构
微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞 壁里面是细胞膜，动物细胞没有细胞壁，仅有 细胞膜。 通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压 冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于 细胞壁。 不同细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞 壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就 不同。
在细胞内沉积。 脂类物质和一些抗生素包含在生物体中。
对于胞内产物需要收集菌体或细胞进行破碎。
5
细胞破碎的必要性
表1 胞内酶举例
酶 L-天冬酰氨酶 过氧化氢酶 胆固醇氧化酶 β-半乳糖苷酶 葡萄糖氧化酶 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 来源 Eruinia Caratovora Escherichia Coli Aspergillus niger Nocardia hodochrous Kluyveromyces fragilis Saccharomyces lactis Aspergillus niger Penicilluim notatum Yeast 应用范围 治疗急性淋巴癌 牛奶灭菌后H2O2的清除 胆固醇浆液分析 在牛奶/乳清中乳糖的水解 作用 葡萄糖浆液分析 食品中氧的清除 临床分析
酵母破碎方法
酵母破碎方法酵母是一种微生物，广泛应用于食品加工和酿造业中。
为了充分利用酵母的发酵能力，需要将酵母进行破碎，以释放其中的细胞内容物。
本文将介绍几种常见的酵母破碎方法。
一、机械破碎法机械破碎法是最常用的酵母破碎方法之一。
首先，将酵母培养液离心，将沉淀的酵母细胞收集起来。
然后，使用高速离心机将酵母细胞打碎，使其细胞壁破裂。
常用的设备有高压均质机和球磨机。
高压均质机通过高速旋转的刀片将酵母细胞剪切成小片，然后利用高压将细胞壁破裂。
球磨机则是利用钢球的冲击和摩擦力将酵母细胞破碎。
机械破碎法可以高效地破碎酵母细胞，但需要注意控制破碎时间和力度，避免过度破碎导致细胞内容物的损失。
二、超声波破碎法超声波破碎法是利用超声波的机械振动作用将酵母细胞破碎。
超声波具有高频振动和局部高温的特点，可以对酵母细胞产生剪切和冲击力，使其破裂。
超声波破碎法操作简单、无需添加任何试剂，对酵母细胞的细胞壁破裂效果较好。
但需要注意控制超声波的功率和时间，避免过度破碎。
三、酶解法酶解法是通过酶的作用将酵母细胞破碎。
常用的酶有蛋白酶和纤维素酶等。
首先，将酵母细胞经过离心收集沉淀，然后加入适量的酶溶液，控制温度和酶解时间，使酵母细胞的细胞壁破裂，释放出细胞内容物。
酶解法适用于破碎酵母细胞壁较为坚硬的情况，但需要注意酶的种类和浓度的选择，以及酶解条件的控制。
四、化学破碎法化学破碎法是利用化学试剂将酵母细胞破碎。
常用的试剂有酸、碱和酶解剂等。
首先，将酵母细胞沉淀后，加入适量的化学试剂，控制温度和反应时间，使酵母细胞的细胞壁破裂。
化学破碎法操作简单，但需要注意试剂浓度和反应条件的选择，以及试剂对酵母细胞内容物的影响。
总结：酵母破碎是释放酵母细胞内容物的重要步骤。
常见的酵母破碎方法有机械破碎法、超声波破碎法、酶解法和化学破碎法。
每种方法都有其特点和适用范围，具体选择方法需要根据实际情况进行综合考虑。
合理选择和控制酵母破碎方法，可以最大限度地释放酵母细胞的有用成分，提高酵母的利用效率。
利用离心使酵母菌破碎的方法
利用离心使酵母菌破碎的方法
离心是一种分离和富集生物样品的常用方法，而在微生物学中，离心也可以用来破碎酵母菌细胞。
下面是利用离心使酵母菌破碎的方法：
1.培养酵母菌，并收集到需要处理的细胞。
2.将酵母菌细胞悬浮液离心，一般建议采用低速离心，避免对细胞壁造成损伤。
离心速度一般为3000-5000rpm，离心时间视具体情况而定。
3.将离心后的上清液倒掉，保留下混浊的沉淀。
这个沉淀就是破碎后的酵母菌细胞。
4.将酵母细胞沉淀洗涤几次，可以用PBS缓冲液或其他无菌的盐水进行洗涤。
洗涤后将酵母细胞沉淀在离心管底部。
5.加入适量的破碎缓冲液，使用超声波或高压破碎器进行破碎。
破碎缓冲液的成分视研究目的而定，一般包括酶抑制剂、缓冲液和蛋白酶等。
6.破碎后的酵母细胞，可以用离心或过滤的方法除去残留的细胞壁和细胞碎片，得到纯的酵母菌细胞内部物质。
总之，利用离心使酵母菌破碎，是一种简单易行、高效快捷的方法，可以用于酵母菌内部物质的提取和纯化。
- 1 -。
4第四章 微生物细胞的破碎
三、破碎率的测定与破碎技术的研究方向
1. 破碎率的测定
1)直接测定法
采用染色的方法把破碎的细胞与未破碎的细胞区别开来。 如破碎的革兰氏阳性菌可染成革兰氏阴性菌的颜色； 采用革兰氏染色法染色酵母破碎液，完整的细胞呈紫色， 2)目的产物测定法 而受损害的细胞呈亮红色。 将破碎后的细胞悬浮液离心分离细胞碎片，测定上清液中目的 产物（如蛋白质或酶）的含量或活性，并与100%破碎率所获得 3)导电率测定法 的标准数值比较，计算其破碎率。 细胞破碎后，大量带电荷的内含物被释放到水相，使导电率上 升。导电率随着破碎率的增加而呈线性增加 。
转速、稀释率等）等因素都对细胞壁膜的结构与组成有一定的影响。细胞的破碎 细胞破碎与固液分离紧密相关。 同样条件下破碎率只有32%。 与上游培养过程有关。 用基因工程的方法对菌种进行改造，以提高胞内物质的提取率也是非常重要的 。 在生长后期，加入某些能抑制或阻止细胞壁物质合成的抑制剂（如青霉素、环 丝氨酸等），继续培养一段时间后，新分裂的细胞其细胞壁有缺陷，利于破碎； 选择较易破碎的菌种作为寄主细胞，如革兰氏阴性细菌； 在细胞内引进噬菌体基因，培养结束后，控制一定条件（如温度等），激活噬 菌体基因，使细胞自内向外溶解，释放出内含物。
作业:
1. 常用细胞破碎方法(珠磨法、高压匀浆法、 超声破碎法、酶溶法、化学渗透法)的原理、 特点及适用性。 2. 举例说明采用多种破碎方法相结合提高破碎 率的机理。
二常用破碎方法类作用机理分适应性机械法珠磨法固体剪切作用可达较高破碎率可较大规模操作大分子目的产物易失活浆液分离困难高压匀浆法液体剪切作用可达较高破碎率可大规模操作不适合丝状菌和含有包含体的基因工程菌超声破碎法液体剪切作用对酵母菌效果较差破碎过程升温剧烈不适合大规模操作xpress法固体剪切作用破碎率高活性保留率高对冷冻敏感目的产物不适合非机械法酶溶法酶分解作用具有高度专一性条件温和浆液易分离溶酶价格高通用性差化学渗透法改变细胞膜的渗透性具一定选择性浆液易分离但释放率较低通用性差渗透压法渗透压剧烈改变破碎率较低常与其他方法结合使用冻结融化法反复冻结融化破碎率较低不适合对冷冻敏感目的产物干燥法改变细胞膜渗透性条件变化剧烈易引起大分子物质失活细胞破碎机理图进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠石英砂氧化铝等研磨剂直径小于1mm一起快速搅拌或研磨研磨剂珠子与细胞之间的互相剪切剂珠子与细胞之间的互相剪切碰撞使细胞破碎释放出内含物
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
❖ KOLER gmbh
❖ 德国著名特制合金材料公司
ATS的技术合作伙伴－意大利FBF
ATS的合作伙伴FBF
❖ 成立于1987年，位于意 大利帕尔马
❖ 2002年来，每年生产近 300台高压均质机
❖ 设备销往全世界50多个 国家，有超过2000台设 备在各地运行。
ATS的合作伙伴FBF
可达较高破碎率，可大规模操作，对于少 量物料<100ml,难操作
超声破碎法
液体剪切作用
对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈， 不适合大规模操作
X-press法
固体剪切作用
破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感目 的产物不适合
非 酶溶法
酶分解作用
具有高度专一性，条件温和，浆液易分离，
机
溶酶价格高，通用性差
械 化学渗透法 改变细胞膜的渗透性 具一定选择性，浆液易分离，但释放率较
一、细胞壁的组成和结构
为了研究细胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解 各种微生物细胞壁的组成和结构（表1）：
微生物 壁厚/nm 层次
主要组 成
革兰氏阳性 革兰氏阴性 酵母菌
20-80
10-13
100-300
单层
多层
多层
肽聚糖
肽聚糖
葡聚糖
（40-90%） （5-10%） （30-40%）
多糖
脂蛋白
❖ 2002年开发了新的 TITAN系列大型高压均 质机，成为欧洲发展最 迅速的高压均质机制造 商。
高压细胞破碎机工作原理
❖ 电机驱动 ❖ 柱塞泵加压 ❖ 均质点破碎
❖ 空穴效应 ❖ 剪切效应 ❖ 撞击效应
破碎发生点
高压破碎的要点
❖ 压力：均质机的压力越高，空隙效应越大，破碎 率越高。ATS的机器压力达1500bar。
——大规模细胞破碎的常用方法
采用高压均质机（由高压泵和均质阀组成，ATS公司和APV公司, AVESTIN,GEA均有产品出售）。
原理：
利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲 击撞击环使细胞破碎，细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时， 每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环 上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动 过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化，从而造成 细胞破碎。
❖ 阀结构：ATS专业的破碎阀结构，细胞冲击的速 度远远高于其它均质机，撞击后破碎效率非常高。
❖ 温度控制：高压破碎会大量产热，ATS专利的在 位冷却系统，将瞬间降低物料温度。
技术要点－破碎阀
❖ 大肠杆菌破碎通过 空隙效应，和撞击 效应来实现。
❖ ATS破碎专用阀，使 细胞在速度最高点 撞击挡圈，可以实 现比普通阀高40% 的撞击力；在同等 压力下实现高破碎 率。
• 内腔为－5度的冷却水。 •冷却模块直接放入均质 机的发热核心，均质模块 内部。
•物料出口温度低于5度。 • ATS设计内置盘管，充 分保证物料的生物活性
典型应用－大肠杆菌1
❖ 革兰氏阴性短杆菌 ❖ 发酵后，离心得到菌体 ❖ 按15%~20%的菌体浓度，加
入磷酸盐缓冲溶液。 ❖ 开冷水机，将整机的温度降低。 ❖ 加入物料，加压到800～
法
低，通用性差
渗透压法 渗透压剧烈改变 破碎率较低，常与其他方法结合使用
冻结融化法 反复冻结-融化 破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产物
干燥法 改变细胞膜渗透性 条件变化剧烈，易引起大分子物质失活
高压均质法是大规模细胞破壁的首选 特别适合生物工程企业
高压均质法（High-pressure homogenization）
专业的医药类高压均质机供应商
国人厚德载物 国货自强不息
ATS 业绩
❖ 2008年1月ATS品牌的AH100系列和AHPILOT系列通过欧盟CE认证。
❖ 2008年6月ATS品牌的高压均质机销量超过 100台。
❖ 2008年4月ATS的生产型高压均质机AH08100通过客户验收。
ATS 的定位
❖ ATS 是专业的生物医药类高压均质机供应商 ❖ ATS 是国内市场上质量最好，服务最优的高
高压均质的特点
❖ 效率高：最大有10吨/小时的流量，可以每 天处理近100吨的发酵液。
❖ 破碎率高：大肠杆菌可以达100%，酵母及 其它厚壁菌可达90%。
❖ 使用方便：高压均质机设备简单，单机操作， 简单方便。
❖ SIP和CIP：高压均质机是管路结构，可通 过高压蒸汽灭菌及在为清洗。
ATS ENGINEERING INC
压均质机供应商 ❖ ATS 是国内市场上技术最领先的高压均质机
供应商
ATS 的合作伙伴
❖ FBF ITLILA 意大利最大的高压均质机生产商 ❖ NORTHER LIPIDS
❖ 著名脂质体公司，世界唯一的高压挤出器公司
❖ HARDMETAL GMBH 瑞士特制合金材料公司 ❖ TECHNO CERAMIC CO,.LTD
技术要点－在位冷却
P
T = 9.9 x c x (o C)
T = Increase in temperature (o C) P = Pressure in the liquid ( BAR ) c = Specific Heat ( J x g-1 x o C-1) = Density ( g x cm-3 )
Ex. Water (c=4.18, = 1) : P = 100 BAR T 2.4 o C
• 通过以上公式可知，水性体系压力升高100bar，温度升高2.4度 • 压力在均质点释放，转化为热能，物料在均质点停留时间约3秒钟 • ATS设计了带夹套冷却的均质模块，充分保证物料的生物活性
最新内置盘管
甘露聚糖
胞壁酸
脂多糖
（30%）
蛋白质
（11-22%） 蛋白质
脂多糖
磷脂
（6-8%）
（1-4%） 蛋白质
脂类
大肠杆菌 （8.5-13.5%
）
霉菌
100-250
多层
多聚糖 （80-90% ） 脂类 蛋白质
细菌破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，网状结 构越致密，破碎的难度越大，革兰氏阴性细菌网状结构不 及革兰氏阳性细菌的坚固；
酵母细胞壁破碎的阻力也主要决定于壁结构交联的紧密 程度和它的厚度；
由于霉菌细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构， 其强度比细菌和酵母菌的细胞壁有所提高。
二、常用破碎方法
分ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
类 作用机理
适应性
机 珠磨法
械 法 高压均质法
固体剪切作用 液体剪切作用
可达较高破碎率，可较大规模操作，大分 子目的产物易失活，浆液分离困难