霍乱弧菌的检验程序
传染病检测SOP工作手册-霍乱弧菌[2]
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霍乱弧菌实验室检测SOP手册1.标本的采集和送检1.1.标本的采集：采集标本的好坏，对检验工作的质量影响很大。
为尽快获得细检查结果，应在发病早期、在服用抗菌药物之前尽快采集标本和及时送到检验室。
标本以病人大便为主。
采便方法用灭菌的棉拭采集排出的新鲜大便，亦可用直肠棉拭或用采便管由肛门插入3㎝～5㎝采集。
一般要求水样便采集1ml～3ml，固形便采取蚕豆大小粪量。
有时病人的呕吐物、沾染大便的衣物和尸体的肠内容物亦可作为检材。
带菌者的大便可用棉拭或直肠棉拭采取。
1.2.标本的送检：采取的标本应立即接种培养基，典型病人的水样便含有大量病菌（106/ml～109/ml），可直接做分离培养并同时增菌培养。
不需做直接分离的均可接种碱性蛋白胨水增菌。
并立即送检验室。
1.3.标本运送途中较远，也可将标本放入文腊氏保存液或卡里—布莱尔运送培养基。
标本与保存液的比例为8ml～10ml保存液加1ml～3ml水样便或蚕豆大的固形便。
也可用厚吸墨纸条吸饱水样便放入小塑料袋内封好送检。
送检标本时，必须认真填写送检单，标本必须妥善包装，专人送检，并防止污染，注意安全，送检箱用后要严密消毒。
2.检验方法2.1.培养方法2.1.1.增菌培养：所有标本都应经过增菌，尤其是恢复期病人、带菌者或用过抗生素的病人标本，需增菌后再分离。
碱胨水接种后放37℃6～8小时，夏日可将运送时间计算在内。
保存液内的标本取1ml种入碱胨水中。
培养后慢慢地从碱胨水生长的菌膜下，取一接种环表层培养物接种于4号或庆大霉素琼脂平板。
标本含菌少时，可实行二次增菌。
取第一次碱胨水增菌后的表层液0.1～0.2ml，接种于另一碱胨水中，37℃6～8小时再做分离。
2.1.2.分离培养：急性典型病人标本在增菌的同时直接做分离培养，这样既可缩短检出的时间，还可避免标本中如有不凝集弧菌经增菌后大量繁殖，影响霍乱弧菌的分离。
其它标本均应增菌后再做分离培养。
当前的习惯多为碱性蛋白胨水增菌，再用强选择性培养基分离，37℃12～16小时长出的菌落，可供做玻片凝集用。
霍乱弧菌实验室检验技术
一、霍乱概述 二、霍乱病原学 三、霍乱弧菌常规检验 四、霍乱弧菌的快速诊断 五、霍乱弧菌的噬菌体-生物分型 六、霍乱菌株的管理、保存与上送
2024/1/3
一、霍乱概述
霍乱是由01群和0139群霍乱弧菌 （V．cholerae）引起的急性肠道传染 病，发病急、传播速度快、波及范 围广、危害严重的甲类传染病。
2024/1/3
必须注意同一样品中O1、O139群霍乱弧 菌可能同时存在，有必要对所有选出的 菌落都进行凝集试验。
提倡所选菌落先经纯培养后再作相关鉴 定，除非情况特殊，一般不提倡直接使 用疑似菌落作玻片凝集。尤其对于TCBS.
如从分离培养基上直接挑取单个菌落进 行血清凝集试验，可能会有假阴性或假 阳性的出现，应谨慎判断结果，特别是 外环境样品。
挑取可疑菌落作玻片凝集
– 与O1群多价和单价血清作玻片凝集反应 – 与O139群抗血清做凝集反应
2024/1/3
血清鉴定：自分离培养基上挑取可疑菌 落与01群霍乱弧菌多价/单价诊断血清及 0139群霍乱弧菌诊断血清做玻片凝集试 验。玻片凝集用血清的效价一般应为 1∶40～1∶50。如可疑菌落在血清中很 快(一般在10s内)出现肉眼可见的明显凝 集，在生理盐水中不凝集者判为阳性。 可疑菌落较多时，应挑选5个以上的菌落 逐个进行玻片凝集检查，必要时，取原 划线菌落边缘透明部分再做玻片凝集， 均为阴性时方可报告未检出01群及0139 群霍乱弧菌。对首发病例菌株需送上一 级实验室做进一步鉴定或复查。
强调在选择培养上发现疑似菌后，首先 考虑进行01/0139群霍乱弧菌的玻片凝集 试验。必须从平板上各挑取5个以上的 （少于5个的全部挑取）疑似菌落进行 01/0139群霍乱弧菌玻片凝集试验。
不同类型的平板上，菌落形态有不同的 特征-----选择你最有把握的。
临床检验技师-微生物检验(2019)讲义第十五章_弧菌科及检验
第十五章弧菌科及检验本章内容一、弧菌属（一）霍乱弧菌（二） O139 型霍乱弧菌（三）副溶血性弧菌（四）其他弧菌二、气单胞菌属与邻单胞菌属（一）气单胞菌属（二）邻单胞茵属革兰阴性直杆菌或弧菌有极端鞭毛氧化酶阳性动力阳性发酵葡萄糖弧菌属——分类根据细菌的抗原性、生化特性、DNA同源性、致病性和耐盐性等将弧菌分为四类：① O1群霍乱弧菌；②不典型O1群霍乱弧菌 : 能被 O1群血清凝集但不产生致病毒素；③非 O1 群霍乱弧菌；④其他弧菌：包括副溶血性弧菌、溶藻弧菌、河弧菌、创伤弧菌、麦氏弧菌和拟态弧菌。
大多数为非病原菌，对人类致病的主要有霍乱弧菌和副溶血性弧菌，分别引起霍乱和食物中毒。
霍乱弧菌——生物学特性形态与结构形态：弧形或逗点状，“鱼群状”。
人工培养后呈杆状。
染色： G-。
特殊结构：有菌毛，无芽胞，部分有荚膜。
一端有一根粗而长的鞭毛，悬滴观察可见穿梭样或流星状运动。
·培养特性营养要求：不高，可无盐生长。
气体环境：兼性厌氧。
菌落特征：耐碱不耐酸。
pH8.5 的碱性蛋白胨水：培养6～ 9h，增菌形成菌膜。
碱性琼脂平板：较大圆形扁平、无色透明或半透明似水滴状菌落。
硫代硫酸盐 - 柠檬酸盐 - 胆盐 - 蔗糖琼脂平板（ TCBS）：较大黄色菌落。
亚碲酸钾琼脂平板：还原亚碲酸钾成金属碲，使菌落中心呈灰褐色。
庆大霉素琼脂：形成的菌落中心呈灰褐色。
·抗原·变异性：有形态变异、菌落变异、溶血性变异和毒力变异。
霍乱弧菌——微生物检验及鉴定·标本采集：以粪便（米泔水样便）为主，尽可能在用药之前采取。
及时接种适宜培养基。
常用的保存或运送培养基有碱性蛋白胨水、文- 腊二氏保存液和卡 - 布运送培养基等。
·形态学检查：①动力观察：米泔水样粪便悬滴观察可见流星或穿梭状运动的细菌。
②制动试验：加霍乱多价诊断血清后弧菌凝集，运动停止。
③涂片染色：革兰染色，观察革兰染色阴性呈鱼群状排列的弧菌。
弧菌科
不耐热的H抗原
为共同抗原
耐热的O抗原
具有群特异性和型特异性，是霍乱弧菌分群和 分型的基础
分型
根据O抗原的不同，现有155个血清群 O1群、O139群引起霍乱
O139血清群的抗原编码基因中出现了36kb的新基因 缺少了O1群高分子量的O抗原侧链 与O1群抗血清无交叉反应，但可与O22血清群和 O155血清群产生交叉反应，遗传学特征和毒力基因 与O1群相似。
培养特性
TCBS琼脂平板: 0.5~2.0mm大小，蔗糖不发酵而呈蓝绿色菌落 普通血平板: 不溶血或只产生α溶血 从腹泻患者中分离到的菌株95%以上在我妻（wagatsuma）琼脂上产生 β溶血现象，称为神奈川现象（Kanagawa phenomenon, KP） 嗜盐性选择平板: 较大，圆形，隆起，稍浑浊，半透明或不透 明，无粘性
（二）生物学特性
1. 形态
革兰阴性杆菌，有鞭毛（极单毛），无荚膜， 无芽胞
2. 抗原结构
耐热的菌体（O）抗原，具有群特征性，副溶 血性弧菌的O抗原有13种 鞭毛抗原，不耐热，无型特异性
3．培养特性
营养要求不高 在无盐培养基上不能生长，最适合生长的 氯化钠浓度为3.5%，超过8%不能生长 最适pH为7.7~8.0，但pH9.5时仍能生长， 最适生长温度为30~37℃ 在碱性胨水中经6~9h增菌可形成菌膜
用于霍乱弧菌的鉴别试验
霍乱红试验 霍乱弧菌有色氨酸酶和硝酸盐还原能力。 霍乱弧菌和其他弧菌均有此种反应 粘丝试验（String Test） 弧菌属细菌除副溶血性弧菌部分菌株外，均有此反应 O/129敏感试验 O/129 （2，4－Diamino－6，7－Diisopropylpteridine，2，4二氨基 －6，7－二异丙基喋啶） 10μg及150μg纸片周围出现任何大小的抑菌环均为敏感。 O1群和非O1群霍乱弧菌均敏感。 但已有对O/129耐药的菌株出现。用此试验作鉴定时，需特别谨 慎。需结合其他试验结果如耐盐生长试验等综合考虑
霍乱弧菌检测方法 文档
霍乱弧菌的检测霍乱弧菌相关知识：稻叶型（A、C）古典型小川型（A、B、C少量）O1群霍乱弧菌：彦岛型（A、B、C）稻叶型（A、C）艾尔托型小川型（A、B、C少量）彦岛型（A、B、C）实验室准备：1.培养基：碱性蛋白胨水、TCBS、4号或庆大霉素琼脂、营养平板、半固体菌种保存管。
2.试剂：拉丝实验用试剂（0.5%去氧胆酸钠水溶液）、氧化酶试剂（1%盐酸对氨基二甲基苯胺或盐酸对氨基四甲基苯胺水溶液。
3.诊断血清：O1群霍乱诊断血清、稻叶型霍乱血清、小川型霍乱血清、O139群霍乱血清。
4.快诊试剂：O1群霍乱胶体金标记快诊卡、O139群霍乱胶体金标记快诊卡。
霍乱弧菌检验流程图：标本37度6-8小时TCBS、4号或庆大霉素琼脂小时胶体金快诊卡/制动等试验血清学凝集试验氧化酶实验拉丝实验O/129敏感试验初步报告、菌种保存一、采样（一）水样便采取1-2毫升，成形便采取指甲大小的粪量。
病人呕吐物、沾染粪便的衣物、尸体的肠腔和口腔内容物亦可做为检材；（二）外坏境样本可采取病人的污染衣物、剩饭菜、可疑食品、抹布、污水、坑塘水、井水、公厕粪便、苍蝇等；（三）按1：10比例置入碱性蛋白胨水增菌液中，迅速送往实验室。
二、增菌、培养（一）所有粪便标本都应经过增菌，尤其是恢复期病人、带菌者或用过抗菌药物的病人标本含菌量少，单靠直接分离不易检出。
需经碱胨水37度增菌6-8小时后分离(夏日可将运送时间计算在内)；（二）标本含菌量少时，为提高检出率可实行2次增菌，取第一次碱胨水增菌后的培养物表层液0.1-0.2毫升，接种于8-10毫升的碱胨水中，37度培养6-8小时后再做分离。
（三）霍乱弧菌好氧，易形成菌膜，故在取出增菌管时动作要轻，接种环于菌膜下取一满环，划线接种于TCBS或4号琼脂平板37℃10~14h孵育培养。
三、快速诊断（一）、直接镜检：为争取最快速度作出诊断，采取病人“米泔水样”大便或呕吐物，悬滴法镜检（最好用暗视野），可见具有流星状动力的细菌。
霍乱弧菌的微生物学诊断检查方法
霍乱弧菌的微生物学诊断检查方法微生物学诊断由于霍乱流行迅速，且在流行期间发病率及死亡率均高，危害极大，因此早期迅速和正确的诊断，对治疗和预防本病的蔓延有重大意义。
直接镜检采取病人“米泔水样”大便或呕吐物。
镜检（涂片染色及悬滴法检查）观察细菌形态，动力特征。
细菌分离培养可将材料接种至碱性蛋白胨水37℃培养6～8小时后，取生长物作形态观察，并转种于碱性平板作分离培养，取可疑菌落作玻片凝集，阳性者再作生化反应及生物型别鉴定试验。
特异性制动试验取检材或新鲜碱性蛋白胨水培养物一滴，置于载玻片上，再加霍乱弧菌多价诊断血清，加盖玻片，用暗视野镜观察，3分钟内运动被抑制的即为阳性，此法优点是快速而特异操作简便，但必须有数量较多的弧菌才检出。
免疫荧光试验除一般免疫荧光法外，还可用荧光菌球法检查。
1.标本采集和运送:霍乱是烈性传染病,凡在流行季节和地区有腹泻症状的患者均应快速准确作出病原学诊断.在发病早期,尽量在使用抗菌药物之前采集标本.可取患者”米泔水”样便,也可采取呕吐物或尸体肠内容物,或采取肛门试子.标本应避免接触消毒液,采取的标本最好就地接种碱性胨水增菌,不能及时接种者可用棉签挑取标本或将肛门试子直接插入卡-布运送培养基中.送检标本装在密封,不易破碎的容器中,置室温由专人输送.甘油盐水保存液不适合于弧菌的运送.2．标本直接检查:荚膜肿胀试验：特异性抗血清与相应细菌的荚膜抗原特异性结合形成复合物时，可使细菌荚膜显著增大出现肿胀的试验常用于肺炎链球菌、流感嗜血杆菌等的检测革兰染色：革兰染色过程所用四种不同溶液和作用：1、碱性染料这在简单染色中已讨论过，此处用结晶紫。
2、媒染剂其作用是增强染料与细菌的亲和力，更好地加强染料与细胞的结合。
常用的媒染剂是碘液。
3、脱色剂帮助染料从被染色的细胞中脱色。
利用细菌对染料脱色的难易程度不同，而将细菌加以区分。
革兰阳性细菌不易被脱色剂脱色，而革兰阴性细菌则易被脱色。
常用的脱色剂是丙酮或乙醇，这里所用的是95%的乙醇。
霍乱弧菌的检验程序
霍乱弧菌的检验程序临床细菌实验室接到高度疑似患者标本，应尽快地进行检验。
具体处理方法如下。
1.临床标本（患者排泄物、呕吐物、肛拭、肛管内容物及残留、剩余食物等）直接涂片，观察动力，再做制动试验以及革兰染色，镜检发现革兰阴性、细小、直的、微弯、逗号状的杆菌。
疑似者即予电话报告2.标本直接接种：①血琼脂平板；②弧菌鉴别性平板（4号琼脂平板、碱性琼脂平板）；③接种碱性胨水3.保留原始标本（不可置于冰箱冷藏）4.35℃孵育上述所有平板及胨水5.6~8h后：①取碱性胨水培养物涂片（直接观察动力、做制动试验）染色镜检；②移种鉴别性琼脂平板和血琼脂平板；③霍乱红试验；④观察血琼脂平板，见有微小菌落生长。
立即涂片染色，霍乱多价血清凝集，氧化酶试验。
如符合霍乱弧菌的推断性鉴定，可作出早期初步报告。
6.继续孵育过夜后，做玻片凝集试验。
自分离平板上挑取可疑菌落与霍乱多价诊断血清做玻片凝集试验，所用血清的效价应在1：80～1：160，如过浓，则稀释后再做凝集。
将稀释血清滴加在洁净的载玻片上，挑取可疑菌落混悬于血清内，即刻（一般不超过10s）出现肉眼可见的明显凝集者为阳性。
菌落应以生理盐水作对照，不发生凝集。
为了提高阳性检出率，应多挑可疑菌落进行玻片凝集。
将O1群霍乱多价血清凝集阳性菌落再做氧化酶、涂片染色镜检，初步推断性鉴定，将此高度疑似菌株，报告当地疾病控制中心做最后鉴定。
霍乱弧菌的检测1.涂片检查：取新鲜送检标本涂片2张，干燥后，用乙醇或甲醇固定，分别用革兰染色剂1：10稀释的石碳酸复红染色，用油镜检查，观察有无革兰阴性呈鱼群排列的弧菌。
悬滴检查：取患者粪便，制成悬滴标本或圧滴标本，检查细菌的动力，霍乱弧菌古典型和EL-Tor型常呈穿梭状及活泼的活动，在悬滴涂片中加O1群霍乱弧菌诊断血清后，在显微镜下观察，若原运动活泼的现象停止，为制动试验阳性。
2.培养：取疑似患者粪便直接接种于碱性蛋白胨水中，进行增菌，同时划线接种于碱性琼脂平板或TCBS平板及血液琼脂平板，孵育于35℃。
霍乱弧菌实验室检测
分离培养（两管两板法）：
接种后的碱性蛋白胨水37℃培养过夜，取菌膜下表层培养物接种选择性培养 基（庆大／四号／ＴＣＢＳ平板）．同时吸0.1～0.2 ml表层培养物转种于 10ml碱性胨水管中作二次增菌，37℃培养6～8h再划线接种于选择性培养基
平板分离及可疑菌落挑取
平板分离
选择性分离平板应采用9cm分离平板（不建议采用7cm平板），一个平 板分离一个样品（严禁一个平板分离2份或以上样品！！ ）。 样品平板分离时应进行分区划线分离，平板分离的单个菌落数量应该达到 50个以落挑取
经典的鉴定步骤要求每个平板应挑取5个以上可疑菌落,转种于克氏双糖斜 面或者普通琼脂斜面待分纯培养后,再进行O1、O139群血清玻片凝集试验， 鉴于对霍乱疫情应急处理的考虑,现大多数监测实验室一般采用将血清玻片 凝集试验前置的做法,作为快速筛查的手段,直接对平板上生长的单个可疑菌 落进行玻片凝集试验,出现明显凝集时可做初步报告,对平板上出现可疑凝集 的菌株必须马上转种于克氏双糖斜面或者普通琼脂斜面,待纯培养物生长良 好后再次进行玻片凝集试验加以确证。 庆大霉素平板和4号琼脂：多呈半透明状，菌落中央常呈灰色或灰黑色，并 随培养时间的延长而加深（由于这类培养基均含有亚碲酸盐成份）。 TCBS（硫代硫酸盐枸櫞酸盐胆盐琼脂）：菌落生长呈黄色发亮、表面光滑、 润湿、稍凸起、边缘整齐。 （TCBS平板生长的菌落不能直挑取进行玻片凝 集试验，需按经典方法进行纯培养后再进行玻片凝集试验）
分离培养要点（两管三板法）：
挑取粪便，直接接种于碱性蛋白胨水（第一管）中，同时划线分离选择 性平板（庆大／四号／ＴＣＢＳ平板，第一板）。 第一管碱性蛋白胨水在３７ ℃增菌６－８小时，沾取菌膜下表层液体， 划线分离选择性平板（庆大／四号／ＴＣＢＳ平板，第二板），同时吸取 0.1～0.2 ml表层培养物，接种碱性蛋白胨水（第二管）。 第二管碱性蛋白胨水增菌１８小时后划线分离选择性平板（庆大／四号 ／ＴＣＢＳ平板，第三板）。
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霍乱弧菌的检验程序
临床细菌实验室接到高度疑似患者标本，应尽快地进行检验。
具体处理方法如下。
1.临床标本（患者排泄物、呕吐物、肛拭、肛管内容物及残留、
剩余食物等）直接涂片，观察动力，再做制动试验以及革兰染色，镜检发现革兰阴性、细小、直的、微弯、逗号状的杆菌。
疑似者即予电话报告
2.标本直接接种：①血琼脂平板；②弧菌鉴别性平板（4号琼脂
平板、碱性琼脂平板）；③接种碱性胨水
3.保留原始标本（不可置于冰箱冷藏）
4.35℃孵育上述所有平板及胨水
5.6~8h后：①取碱性胨水培养物涂片（直接观察动力、做制动
试验）染色镜检；②移种鉴别性琼脂平板和血琼脂平板；③霍乱红试验；④观察血琼脂平板，见有微小菌落生长。
立即涂片染色，霍乱多价血清凝集，氧化酶试验。
如符合霍乱弧菌的推断性鉴定，可作出早期初步报告。
6.继续孵育过夜后，做玻片凝集试验。
自分离平板上挑取可疑
菌落与霍乱多价诊断血清做玻片凝集试验，所用血清的效价应在1：80～1：160，如过浓，则稀释后再做凝集。
将稀释血清滴加在洁净的载玻片上，挑取可疑菌落混悬于血清内，即刻（一般不超过10s）出现肉眼可见的明显凝集者为阳性。
菌落应以生理盐水作对照，不发生凝集。
为了提高阳性检出率，
应多挑可疑菌落进行玻片凝集。
将O1群霍乱多价血清凝集阳性菌落再做氧化酶、涂片染色镜检，初步推断性鉴定，将此高度疑似菌株，报告当地疾病控制中心做最后鉴定。
霍乱弧菌的检测
1.涂片检查：取新鲜送检标本涂片2张，干燥后，用乙醇或甲醇固定，分别用革兰染色剂1：10稀释的石碳酸复红染色，用油镜检查，观察有无革兰阴性呈鱼群排列的弧菌。
悬滴检查：取患者粪便，制成悬滴标本或圧滴标本，检查细菌的动力，霍乱弧菌古典型和EL-Tor型常呈穿梭状及活泼的活动，在悬滴涂片中加O1群霍乱弧菌诊断血清后，在显微镜下观察，若原运动活泼的现象停止，为制动试验阳性。
2.培养：取疑似患者粪便直接接种于碱性蛋白胨水中，进行增菌，同时划线接种于碱性琼脂平板或TCBS平板及血液琼脂平板，孵育于35℃。
增菌培养孵育6h后，取表面菌膜移种于上述平板上，进行分离培养，并同时涂片，革兰染色和悬滴标本，检查形态及活动力。
各种分离培养的平板在孵育18~24h后观察菌落，挑取可疑菌落，先与生理盐水混匀，观察有无自凝现象。
再用O1群霍乱多价血清做玻片凝集试验，立即出现明显凝集者为阳性，有条件者再做血清分型。
如在选择培养基生长典型菌落，运动活泼呈穿梭状，氧化酶
阳性的革兰阴性弧形菌并与霍乱多价诊断血清凝集者，可判定为O1群霍乱弧菌。
在霍乱流行期间，根据上述结果并结合临床即可对病人作出霍乱病的早期诊断。
并立即向当地疾控部门报告信息。
注：霍乱弧菌诊断血清试剂的使用方法
于洁净玻片上滴1滴血清，然后取少量被检菌落与血清混匀，轻轻摇动玻片，1分钟内肉眼判断结果，试验应以生理盐水做阴性对照。
检验结果的解释：于1分钟内呈明显凝集者为阳性，呈均匀浑浊者为阴性。