实验动物组织切片免疫组织化学染色方法
病理免疫相关实验报告
病理免疫相关实验报告引言病理免疫学是病理学的一个重要分支，通过研究机体的免疫反应与疾病的关系，可以深入了解疾病的发生机制和免疫系统的功能。
本实验旨在通过免疫组化和免疫荧光技术，观察组织中的免疫反应，并利用免疫组化技术定位疾病相关蛋白的表达情况。
实验方法1. 采集实验样本：从实验动物身上取得肝脏组织样本，并快速冻存。
2. 准备试剂：准备免疫组化试剂盒，包括抗体、抗原修复液、二抗、染色液等。
3. 免疫组化染色：将样本切片后，经过脱脂、脱水和抗原修复处理后，使用抗体与样本进行共孵育，形成抗原-抗体复合物。
4. 免疫荧光染色：将切片样本经过脱脂、脱水处理后，使用荧光标记的抗体与样本中的目标蛋白进行结合，形成荧光抗原-抗体复合物。
5. 免疫组织化学染色：将切片样本经过脱脂、脱水处理后，使用酶联二抗体与样本中的目标蛋白结合，形成酶标抗原-抗体复合物，经过染色显色后可观察到目标蛋白的存在情况。
实验结果免疫组化染色经过免疫组化染色观察，发现肝脏组织中出现了抗体与目标蛋白结合后的染色信号。
对比对照组和实验组，发现实验组的染色强度明显高于对照组，说明目标蛋白在疾病组织中表达增加。
免疫荧光染色通过免疫荧光染色观察，可以直接看到标记了荧光的抗体与目标蛋白在组织切片中的位置与分布情况。
发现目标蛋白主要在肝脏组织的细胞核周围分布，显示出明亮的荧光信号。
免疫组织化学染色免疫组织化学染色观察显示，经过染色显色后，在目标蛋白存在的部位出现明显的颜色反应。
对比对照组和实验组，发现实验组的染色强度明显高于对照组，说明目标蛋白在疾病组织中表达增加。
讨论本实验通过免疫组化、免疫荧光和免疫组织化学技术，成功地观察到了疾病组织中目标蛋白的表达情况。
结果显示，在疾病组织中，目标蛋白的表达明显增加，与对照组有显著差异。
这一结果提示了目标蛋白可能与该疾病的发生发展密切相关。
在本实验中，我们选择了肝脏组织作为疾病组织样本。
肝脏作为一个重要的免疫器官，它在免疫应答中起着关键的作用。
免疫组织化学及HE染色实验步骤
免疫组织化学及HE染色实验步骤免疫组织化学和HE（Hematoxylin and Eosin）染色是常用的组织学研究技术。
免疫组织化学用于检测组织中特定抗原的表达，可以帮助研究者了解细胞和组织的功能和性质。
HE染色则是常用的常规组织染色方法，用于观察组织的形态学特征。
下面将分别介绍免疫组织化学和HE染色的实验步骤。
1.获取组织标本：首先，需要获取要研究的组织标本，可以是活体组织或固定的组织。
固定的组织标本一般使用10%缓冲福尔马林进行固定。
2.制备标本切片：将标本切割成适合光镜观察的薄片。
切片厚度一般为3-5微米。
3.去蜡：将蜡包埋组织切片放入蜡溶液中，加热脱蜡，使组织切片恢复水化。
4.抗原修复处理：将切片放入抗原修复液中，通过高温或酶解方法进行抗原修复处理，使细胞或组织中的抗原保持完整。
修复液的选择和具体实验要求有关。
5.阻断非特异性结合：将切片浸入阻断液中，阻断非特异性结合位点，减少假阳性结果。
6.一抗孵育：将合适浓度的一抗溶液加到切片上，使其孵育一段时间。
根据要检测抗原的性质选择合适的一抗。
7.二抗孵育和信号增强：将与一抗结合的二抗溶液加到切片上，同时可以加入信号增强剂，提高检测灵敏度。
8.反应显色：将切片加入显色液中，使阳性细胞或组织部分显示出颜色反应。
常用的显色方法有原位杂交、过氧化物酶法和碱性磷酸酶法等。
9.脱水和封片：经过显色后，将切片在酒精中进行脱水处理，然后用透明介质嵌片，并保护封片，以便于观察。
HE染色的实验步骤如下：1.获取组织标本：同样，首先需要获取组织标本，可以是活体组织或固定的组织。
2.制备标本切片：将标本切割成适合光镜观察的薄片。
切片厚度一般为3-5微米。
3.去蜡和水化：将蜡包埋组织切片放入蜡溶液中，加热脱蜡，然后用醇和水进行水化，使组织切片恢复水化。
4.酸性染料处理：将标本切片放入染色液中，使用血红素作为酸性染料，将细胞核染成蓝色。
5.碱性染料处理：将标本切片放入染色液中，使用溴化钡和噻唑蓝作为碱性染料，将细胞质和胞浆染成红色。
免疫组织化学染色实验步骤
免疫组织化学染色实验步骤1. 实验准备确保所有实验所需的试剂、器材和设备都已准备齐全。
主要试剂包括抗体、抗原、染色液、封闭液等。
器材包括显微镜、离心机、微量移液器、培养箱等。
设备应进行适当的清洁和消毒，保持实验环境的无菌状态。
2. 组织样本的准备选择合适的组织样本并进行固定处理。
通常使用10%中性缓冲福尔马林固定液进行组织固定，固定时间一般为24小时，固定后应将组织转移至PBS缓冲液中保存。
固定后的组织样本需经过脱水、透明化和浸蜡等步骤，进行切片。
切片厚度通常为46微米，将切片放置于玻片上，进行后续的处理。
3. 切片的脱蜡和再水化4. 抗原修复抗原修复是提高抗体特异性的重要步骤。
选择适当的抗原修复液（如柠檬酸缓冲液或EDTA缓冲液），将其加热至沸腾并保持一定时间（通常为1020分钟），以去除固定过程中可能产生的抗原遮蔽效应。
之后将切片转移至冷却缓冲液中，待其冷却至室温。
5. 封闭非特异性结合位点用封闭液（如含有5%牛血清白蛋白的PBS溶液）处理切片，以封闭组织中可能存在的非特异性结合位点。
封闭液通常需要在室温下孵育30分钟。
6. 加入一抗（初级抗体）将一抗稀释至适当浓度，滴加在切片上。
抗体稀释液的选择应根据抗体的说明书进行，常见的稀释液包括PBS或含有0.1% TritonX100的PBS。
覆盖切片后，置于湿箱中在4°C下孵育过夜，以保证抗体与抗原充分结合。
7. 洗涤切片用PBS洗涤切片，去除未结合的一抗。
洗涤液的选择应为无菌PBS，洗涤次数通常为3次，每次5分钟。
8. 加入二抗（次级抗体）将二抗稀释至适当浓度，滴加在切片上。
二抗应选择针对一抗的相应标记抗体，常用的标记物包括荧光素、酶（如HRP、AP）等。
孵育时间为30分钟，孵育条件为室温，避免光照。
9. 洗涤切片用PBS洗涤切片，去除未结合的二抗。
洗涤操作与步骤7相同。
10. 显色反应根据使用的标记物不同，选择相应的显色试剂进行显色反应。
HE染色与免疫组织化学染色实验报告[最新]
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HE染色与免疫组织化学染色实验报告1实验目的及意义1.1了解石蜡切片的制作过程1.2 掌握HE染色与免疫组织化学染色的基本原理以及染色方法1.3 熟悉HE染色与免疫组织化学染色后的读片知识2 实验方法及步骤2.1 石蜡切片制作及HE染色步骤2.1.1取材与固定：从人或动物新鲜尸体上取下组织块(一般厚度不超过0．5厘米)投入预先配好的固定液中(10％福尔马林)使组织、细胞的蛋白质变性凝固，以防止细胞死后的自溶或细菌的分解，从而保持细胞本来的形态结构。
2.1.2脱水透明：一般用由低浓度到高浓度酒精作脱水剂，逐渐脱去组织块中的水份。
再将组织块置于既溶于酒精，又溶于石蜡的透明剂二甲苯中透明，以二甲苯替换出组织块的中酒精，才能浸蜡包埋。
2.1.3浸蜡包埋：将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中，放入溶蜡箱保温。
待石蜡完全浸入组织块后进行包埋：先制备好容器(如折叠一小纸盒)，倒入已溶化的石蜡，迅速夹取已浸透石蜡的组织块放入其中。
冷却凝固成块即成。
包埋好的组织块变硬，才能在切片机上切成很薄的切片。
2.1.4切片前的准备工作：先将包埋的每块组织周围过多的石蜡切去，四周留约2mm的石蜡块，块两边必须切成平行的直线。
将玻片擦洗干净后均匀涂抹薄薄的一层蛋白甘油，放置冰箱备用。
2.1.5切片与贴片：将预冷的蜡块固定于切片机上，调节切片厚度为6微米，切成薄片。
切下的薄片往往皱折，放到加热的水中烫平，再贴到载玻片上，放45℃恒温箱中烘干。
2.1.6 脱蜡至水二甲苯Ⅰ20分钟，二甲苯Ⅱ20分钟，无水乙醇3分钟，95％酒精3分钟，80％酒精3分钟，70％酒精3分钟，自来水洗5分钟，依次按上述顺序加入相应试剂并作用相应时间。
2.1.7染色：苏木素液7分钟，自来水洗5分钟，1％盐酸溶液分化30秒，自来水洗5分钟，1％氨水返蓝10秒，自来水洗20分钟，95％酒精3分钟，1％伊红酒精溶液2分钟，依次按上述顺序加入相应试剂并作用相应时间。
2.1.8脱水和透明：95％酒精2分钟，无水酒精Ⅰ2分钟，无水酒精Ⅱ2分钟，二甲苯Ⅰ5分钟，二甲苯Ⅱ5分钟，依次按上述顺序加入相应试剂并作用相应时间。
小鼠皮肤组织HE染色,免疫荧光染色
实验方案小鼠皮肤组织HE染色和免疫荧光染色HE染色一试剂及耗材小鼠皮肤细胞，固定液（4%多聚甲醛），PBS,不同浓度乙醇，透明剂（二甲苯），石蜡，包埋盒，苏木精伊红染色液，中性树胶等二实验步骤1.取小鼠皮肤组织去毛处理成合适的大小并置PBS或生理盐水中充分漂洗残余血液2.将漂洗干净的组织放入4%多聚甲醛中（1:5的比例浸泡）固定过夜3.将固定好的组织用PBS清洗两遍，每次30min4.组织脱水：30%乙醇→50%乙醇→75%乙醇（可4℃过夜）→85%乙醇→95%乙醇→100%乙醇（各30min）5.透明：二甲苯透明3×20min（具体时间根据透明程度来设定，小鼠皮肤10min即透明，透明时如发现组织有部分白雾状，则可能是脱水未脱净）6.浸蜡：4×30min（每30min换一次蜡，换四次以使石蜡浸入组织起支持作用）7.包埋（注意组织摆放及横切，纵切，记录标签），待石蜡充分凝固即可修片(刚包埋好的热蜡块不能立即冷冻)8.切片（5-7um），摊片（40-45℃），烘片（62℃左右，充分烘干）9.HE染色：二甲苯Ⅰ(10min) →二甲苯Ⅱ(5min) →二甲苯:乙醇=1:1(2min)→100%乙醇→95%乙醇(2min)→85%乙醇(1min)→70%乙醇(1min)→50%乙醇(1min)→水(1min)→苏木精染液(1min)→流动自来水(3min)→50%乙醇(1min)→70%乙醇(1min)→85%乙醇(1min)→95%乙醇(1min)→伊红染液(1min)→95%乙醇(1min)→100%乙醇(1min)→100%乙醇(1min)→二甲苯Ⅰ(2min)→二甲苯Ⅱ(2min)10.中性树胶封片(注意材料上的二甲苯不能干，尽量避免出现气泡)11.显微镜观察三实验样品四实验结果免疫荧光染色一试剂及耗材小鼠皮肤细胞石蜡切片，山羊血清，一抗，二抗，0.3%Triton x100，PBS等二实验步骤1.石蜡切片60℃烘片1小时2.脱蜡到水:二甲苯Ⅰ(10min) →二甲苯Ⅱ(5min) →二甲苯:乙醇=1:1(2min)→100%乙醇→95%乙醇(2min)→85%乙醇(1min)→70%乙醇(1min)→50%乙醇(1min)→水(1min)3.蒸馏水洗1min4.抗原修复：切片置于0.1mol/L且ph=6.0的柠檬酸钠修复液中，在水浴锅内（99℃）持续放10-15min，自然冷却20-30分钟（不能将切片拿出冷却）5.去除内源性酶：3%H2O2室温孵育5-10min6.PBS洗2-3次，每次5min7. 0.3%Triton x100室温孵育20min（增加细胞膜通透性）8.于室温湿盒内非特异血清封闭1h,(用DPBS稀释含10% goat FBS)9.孵育一抗(ITGB1)4℃过夜或37℃1h（一抗：DPBS(10% goat FBS)=1:200）,注意做空白对照（不加一抗，用DPBS(10% goat FBS)孵育）10. 孵育完成后PBS洗3次，每次5min11.滴加荧光二抗（IgG-FITC：DPBS(10% goat FBS)=1:200）室温置湿盒中避光孵育2小时或37℃30min，用PBS 3分钟×3次洗去二抗，用滤纸擦去标本外的PBS12.滴加DAPI 避光孵育2分钟（染核）。
免疫组织化学及HE染色实验步骤
免疫组织化学及HE染色实验步骤免疫组织化学（immunohistochemistry，简称IHC）是一种用于检测组织切片中特定蛋白质的方法，其原理是通过特异性抗体识别目标蛋白质并将其可视化。
本文将介绍IHC实验的基本步骤和HE染色实验的步骤。
IHC实验步骤：1.组织切片制备：从取材到固定、包埋和切片，保证组织样本的质量和完整性。
2.抗原修复：将组织切片放入含有钠胼胝土缓冲液或其它抗原修复液中进行抗原修复。
可以选择使用高温或酶解等方法。
3.阻断非特异性结合：将组织切片浸泡在阻断液中，如BSA、牛血清蛋白等，以防止抗体与非特异性的蛋白质结合。
4.一抗孵育：将含有一抗的抗体溶液滴在组织切片上，孵育一段时间，使一抗与目标蛋白质发生特异性结合。
5.二抗孵育：选择与一抗宿主不同的二抗标记物，如荧光素、过氧化物酶等，将含有二抗的溶液滴在组织切片上进行孵育。
6.吸附剂清洗：将组织切片用洗涤缓冲液洗去未与标记物结合的二抗。
7.标记物检测：根据所选择的标记物，可以进行荧光显微镜观察、酶反应等，将目标蛋白质可视化。
8.盖片封装：将组织切片用适当的缓冲液封装至玻璃盖片上。
HE染色实验步骤：1.组织切片制备：从取材到固定、包埋和切片，保证组织样本的质量和完整性。
2.脱蜡：将组织切片放入甲醇中脱去石蜡包埋。
3. 染剂处理：将组织切片依次浸泡在嗜铬酸钾溶液中，漂洗后浸泡在碱性染剂中，如伊红（Eosin）染料。
4. 酸性染剂处理：将组织切片浸泡在酸性染剂中，如苏木红（Hematoxylin）染料。
5.脱染：将组织切片用酒精和醋酸溶液进行脱染。
6.脱水：将组织切片依次浸泡在酒精梯度中，脱去水分。
7.透明化：将组织切片逐渐浸泡在透明剂中，如苯酚乙醇、二甲苯等，使组织切片透明。
8.盖片封装：将组织切片用适当的透明剂封装至玻璃盖片上。
以上是免疫组织化学和HE染色实验的基本步骤。
通过这些步骤，可以标记和可视化组织切片中的特定蛋白质，进而获得研究和诊断所需的信息。
免疫组化之组织处理、切片和染色实验技术步骤
免疫组化之组织处理、切片和染色实验技术步骤展开全文1.组织处理恰当的组织处理是做好免疫组化染色的先决条件，也是决定染色成败的内部因素，在组织细胞材料准备的过程中，不仅要求保持组织细胞形态完整，更要保持组织细胞的抗原性不受损或弥漫，防止组织自溶。
如果出现自溶坏死的组织，抗原已经丢失，即使用很灵敏的检测抗体和高超的技术，也很难检出所需的抗原，反而往往由于组织的坏死或制片时的刀痕挤压，在上述区域易出现假阳性结果。
1) 组织及时取材和固定组织标本及时的取材和固定是做好免疫组化染色的关键第一步，是有效防止组织自溶坏死，抗原丢失的开始，离体组织应尽快的进行取材，最好2h内，取材时所用的刀应锐利，要一刀下去切开组织，不可反复切拉组织，造成组织的挤压，组织块大小要适中，一般在2.5cm×2.5cm× 0.2cm，切记取材时组织块宁可面积大，千万不能厚的原则，(也就是说组织块的面积可以大到3cm×5cm，但组织块的厚度千万不能超过0.2cm，否则将不利于组织的均匀固定)。
固定液快速渗透到组织内部使组织蛋白能在一定时间内迅速凝固。
从而完好的保存抗原和组织细胞形态。
对于固定液的选择，原则上讲，应根据抗原的耐受性来选择相应的固定液，但除非是专项科研项目，在病理常规工作很难做到这一点，因为病理的诊断和鉴别诊断都是在常规HE病理诊断的基础上决定是否进行免疫组化的染色，而HE染色的常规组织处理是采用10%的中性缓冲福尔马林或4%缓冲多聚甲醛4倍于组织体积进行组织固定，利用其渗透性强，对组织的作用均匀进行固定，但组织固定时间最好在l2h 内，一般固定时间不应超过24小时。
随着固定时间的延长对组织抗原的检出强度将逐渐降低。
2) 组织脱水、透明、浸蜡组织经固定后进行脱水、透明、浸蜡和包埋。
掌握的原则是脱水透明要充分但不能过，浸蜡时间要够，温度不能高，否则造成组织的硬脆使组织切片困难，即使能切片，由于组织的硬脆，也使切片不能完好平整，染色过程中极易脱片，对免疫组化染色抗原的定位及背景都不利，所以无水酒精脱水和二甲苯透明的时间不宜过长，正常大小的组织无水酒精脱水lh×3次，二甲苯透明lh×2次即可，浸蜡及包埋石蜡温度不要超过65℃。
免疫组化染色步骤
免疫组织化[检验原理]生物素标记的山羊抗小鼠/兔lgG与结合在组织片上的一抗反应形成免疫复合物，辣根酶标记链霉卵白素与生物素免疫复合物结合进一步形成聚合物，聚合物上的HR催化底物过氧化氢与DAB (或AEC) 反应，最终形成棕褐色(或红色)不溶性色原，从而在显微镜下显示出组织片中的特定杭原的位点。
[试剂]1:内源性过氧化物酶阻断剂试剂2:封闭用正常山羊血清工作液试剂3:生物素标记山羊抗小鼠兔lgG试剂4:辣根酶标记链霉卵白素工作液[储存条件及有效期]2~ 8C避光保存，不得冻存:产品有效期为12个月。
使用时即拿即放，使用后应立即放回冰箱，开封后试剂有效期6个月。
[样本要求]1、标本类型:活检或手术切除标本。
2、标本固定:所有组织标本离体后(1小时内)尽快采用10%中性缓冲福尔马林固定，固定液与所浸泡组织的比例应足够。
固定时间以8~72小时为宜。
3、组织切片:未染色的切片置于室温不宜超过6周，以防抗原丢失。
切片厚度3~ 5μm 黏附在防脱玻片上，56~ 60摄氏度烤片2小时。
[检验方法]1、检验所需仪器、设备:移液器、恒温箱、修复仪、免疫组化笔、计时器、孵育盒、染色架、盖玻片、光学显微镜、洗瓶。
2、试剂准备:显色液需要在使用前配制。
3、操作程序:a) 脱蜡和水化石蜡切片置于新鲜二甲萃中，浸泡10分钟x3次:去除多余的液体后，置于无水乙醇中，浸泡3分钟x3次:去除多余的液体后，置于95%乙醇中,浸泡3分钟x2次:去除多余的液体后，置于75%乙醉中，浸泡3分钟x2次:蒸馏水冲洗1分钟，蹕于PBS缓冲液中。
b) 抗原修复，参见抗说明书。
c 阻断内源性过氧化物酶加入适量的内源性过氧化物酶阻断剂，室温孵育10分钟: PBS 缓冲液冲洗3分钟心3次。
d)滴加封闭用正常山羊血清工作液滴加100uL或适量的封闭用正常山羊血清工作液，室温孵育10-15分钟，倾去血清，勿洗。
e)滴加一抗根据组织大小，滴加100pL或适量的抗，37*C孵育60分钟: PBS 缓冲液冲洗3分钟x3次f) 滴加生物素标记山羊抗小鼠/兔lgG滴加10uL或适量的生物素标记山羊抗小鼠/兔IgG,室温孵育10-15分钟: PBS 缓冲液冲洗3分钟x3次。
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ICS65.020.30
B44
中国实验动物学会团体标准
T/CALAS x-201x
实验动物组织切片免疫组织化学染色
方法
Laboratory animals-Immunohistochemical procedures for paraffin
embedded tissues
（征求意见稿）
201x-xx-xx发布201x-xx-xx实施中国实验动物学会发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则编写。
本标准由中国实验动物学会归口。
本标准由全国实验动物标准化技术委员会（SAC/TC281）技术审查。
本标准由中国实验动物学会实验动物标准化专业委员会提出并组织起草。
本标准主要起草单位：浙江大学动物科学学院、浙江省医学科学院。
本标准主要起草人：吴旧生、刘月环。
实验动物组织切片免疫组织化学染色方法
1范围
本标准规定了实验动物组织切片的免疫组织化学染色方法。
本标准适用于实验动物组织切片的免疫组织化学检测。
2术语和定义
以下术语和定义适用于本标准。
2.1
免疫组织化学immunohistochemistry,IHC
用已知的抗原或者抗体去检测待检组织中的抗原或抗体，根据其结合后经一系列方法的处理，呈色反应，在光镜下确定组织的来源属性和部位，对靶抗原进行定性、定位和定量的方法。
2.2
抗原antigen,Ag
一类可以刺激机体的免疫系统并促进其发生免疫应答，与免疫应答产物即抗体和效应细胞，在体内或体外发生特异性结合的物质。
2.3
抗体antibody
机体的免疫系统受到抗原刺激后，通过机体一系列的化合作用：即体液免疫应答、B 淋巴细胞活化、增殖、分化为浆细胞，由浆细胞合成并分泌的仅与该抗原发生特异性反应的球蛋白的物质称为抗体。
2.4
抗原修复antigen repair
利用化学试剂和热的作用将这些抗原重新暴露出来或修正过来的过程。
3主要试剂
3.10.01M 磷酸盐缓冲液（Phosphate buffer solution.PBS）
先配成A 液和B 液，其中A：0.2M Na H 2PO 4贮存液（PH7.6）：15.60g 磷酸二氢钠
（NaH 2PO 4﹒2H 2O）溶解于少量水，加蒸馏水定容至500ml，放于4℃冰箱保存。
B：0.2M Na 2HPO 4贮存液(HP7.6)：将35.82g 磷酸氢二钠（Na 2HPO 4﹒12H 2O）溶解并定容至500ml，贮存于4℃
冰箱备用。
用时取A 液13ml，B 液87ml，用1N 氢氧化钠或盐酸调pH 至7.6,加蒸馏水至2000ml。
3.20.05M Tris-HCL 缓冲液(PH7.6)
取三羟甲基氨基甲烷(Tris)6.57g，加入少许的蒸馏水搅拌，直至溶解，再加入1N 盐酸溶液42ml，定容至100ml，于4℃冰箱保存。
临用时，将上述溶液10稀释倍，即为0.05M 缓冲液。
3.3柠檬酸抗原修复液
称取柠檬酸2.1g，加水至1000mL,用1N 盐酸调pH 至6.0。
3.4显色液
称取DAB 6mg 溶于10mL 0.05M Tris 缓冲液（pH7.6)中，然后加入0.1mL 0.3%过氧化氢(H 2O 2),此液需要现配现用。
4免疫组织化学方法（间接法）
4.1切片经二甲苯5min*2、无水乙醇5min*2、95％乙醇5min*2、85％乙醇5min、70％乙醇5min 完成脱蜡。
脱蜡后自来水洗5min。
4.20.3%H 2O 2甲醇处理切片20min。
4.3水洗。
4.4抗原修复。
4.5PBS 洗3次，2min/次。
4,6加入血清于湿盒中孵育20min。
4.7倾去血清，加入一抗于湿盒中孵育60min。
4.8PBS 洗3次，2min/次。
4.9加入二抗于湿盒中孵育30min。
4.10PBS 洗3次，2min/次。
4.11用含0.5%DAB，0.02%H 2O 2显色液孵育切片5-10min。
4.12PBS 洗，水洗。
4.13Mayer’s 苏木素染核1min。
4.14水洗1min，蓝化10min。
4.15切片再经70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇各1min，经95％乙醇1min*2、无水乙醇2min*2快速脱水后用二甲苯透明5min，重复一次。
4.16根据盖玻片规格和载玻片上组织多少，滴加适量中性树胶，封片。
4.17以PBS 代替一抗为阴性对照。
5操作要求
5.1离体组织固定尽早固定，越新鲜越好，以防止组织自溶，抗原扩散。
5.2组织脱水应彻底干净。
组织块取材不宜太大过厚。
5.3切片应完整、均匀、平展、无皱褶。
5.4切片应烘烤附贴牢固。
5.5切片脱蜡应干净。
5.6应彻底抑制内源性过氧化物酶的活性。
5.7选择合适的抗体及对其作适当的保存和稀释才能取得较佳的实验效果。
一般使用与二抗相同动物来源的非免血清进行封闭。
5.8根据需要，在实验步骤中增加内源性生物素阻断步骤。
5.9正确冲洗PBS溶液。
6抗原修复方法
6.1微波抗原修复法：0.01M柠檬酸盐缓冲液（PH6.0），于微波炉内微波辐射10min。
待修复液降至室温后，PBS洗3次，随后按选好的免疫组织化学的染色方法进行染色。
6.2高压抗原修复法：切片放入抗原修复液中，边同容器放入高压锅中加热至沸腾。
盖上压力阀至喷汽后持续3min,待修复液恢复至室温后，PBS洗3次，随后按选好的免疫组织化学染色方法进行染色。
6.3水浴抗原修复法：切片放入0.01M柠檬酸盐缓冲液（PH0.6）中，边同容器一起放入水溶锅中加热，其间应不断用温度计测其温度，待抗原修复液的温度达到有效温度后（92℃）。
即开始计时，持续40min。
待抗原修复液恢复至室温后，PBS洗3次，随后按选定好的免疫组化染色方法进行染色。
6.4煮沸抗原修复法：将切片放入抗原修复液中于电炉上加热，不时用温度计测量温度。
当达92℃后，即可拔离电源。
当温度低于92℃时，再插上电源。
如此反复持续至10min。
待抗原修复液降至室温后，PBS洗3次，随后按选定的免疫组化染色方法进行染色。
7结果判定
7.1阴性对照为阴性时，阳性反应产物呈淡黄色、棕黄色和褐黄色粗颗粒。
7.2依照细胞阳性着色程度（抗原含量），可分为弱阳性（+）┅1分；中等阳性（++）┅2分；强阳性（+++）┅3分。
依照阳性细胞数量，可分为：弱阳性（+，指阳性细胞总数在25%以下）；中等阳性（++,指阳性细胞总数在25%—49%)；强阳性（+++，指阳性细胞总数在50%以上)。
对于免疫组织化学后切片的评判，要做到准确、客观。
应容易分辨出主要阳性细胞。
7.3对于
阳性细胞的阳性物定位要准确。
每批检测的切片，均应设阴性或空白对照片，以确保检测病例的准确性和可靠性。
对于具有明确检测抗原，可利用自身设立阳性对照片。
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