胚胎干细胞及其培养建系
胚胎干细胞的培养
胚胎干细胞的体外培养胚胎干细胞(embryonic stem cell, ES cell)也称ES细胞,是一种存在于着床前早期胚胎中的具有全能性的细胞。
全能性即分化发育成三个胚层的组织细胞的能力。
胚胎干细胞能在体外进行培养传代,保持未分化二倍体状态以及其全能性，具有形成嵌合体动物(chimeric animal)的能力。
胚胎干细胞最早由Evans和Kaufman(1981)两人以及Martin(1981)分别从小鼠早期胚胎中分离培养成功并建立细胞系。
由于其具有全能性,故广泛用于胚胎发育及胚胎工程方面的研究。
例如在培养液中加入不同的分化因子,可定向诱导其分化发育成心肌细胞、淋巴细胞以及神经细胞,甚至可用它培养出器官；可用不同的外源性基因转染胚胎干细胞,或在胚胎干细胞水平上进行基因敲除或基因打靶,经体外筛选后建立带有目的基因的细胞系或将筛选后带有目的基因的胚胎干细胞注射到宿主着床前胚胎内,并移植到假孕母体子宫腔内使之发育成个体。
从而建立转基因动物、基因敲除动物和基因打靶动物，研究基因在分化发育过程中的表达与调控以及制备人类疾病动物模型等。
由于胚胎干细胞在体外培养过程中极易分化和失去正常二倍体核型，进而失去全能性和丧失形成嵌合体动物的能力，故需要特殊的培养条件。
目前, 由于小鼠胚胎干细胞体外培养技术最为成熟，本文将以此为例，较详细地介绍胚胎干细胞体外分离培养和鉴定等实验技术。
一、胚胎干细胞体外培养原理胚胎干细胞体外培养的原则是: 在促进胚胎干细胞增殖的同时，维持其未分化二倍体状态。
胚胎干细胞一旦分化即失去其全能性，失去二倍体正常核型的细胞则会大大降低形成嵌合体(chimera)的能力，特别是进入种系形成生殖细胞的能力。
目前体外培养胚胎干细胞的方法归纳起来有二大类：有饲养层培养法和无饲养层培养法。
有饲养层培养法主要应用小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）和SIM小鼠成纤维细胞耐硫代鸟嘌呤和耐乌苯苷亚系STO细胞作为饲养细胞；经丝裂霉素-C或γ-射线处理终止其分裂后制备成饲养单层(feeder layer)，将胚胎干细胞种植在这样的单层上。
大鼠胚胎干细胞的培养和分化
大鼠胚胎干细胞的培养和分化胚胎干细胞是一种具有不同能力的多能性干细胞，其可以自我更新并分化为各种细胞类型。
这种特性使胚胎干细胞成为治疗许多难治性疾病的前沿工具。
然而，胚胎干细胞的获取和使用也存在其固有问题。
使用胚胎干细胞的过程需要对胚胎进行捐赠并且会导致胚胎的破坏，这是一个道义和法律上都有争议的问题。
因此，对于胚胎干细胞的研究已逐渐趋向于使用成体细胞干细胞的技术。
成体细胞干细胞一种非胚胎来源的多能性干细胞，其原理是通过基因转换修改特定的成体细胞，使其转化为干细胞。
这个领域较早的工作是通过反向编程中介的重编程技术将成体细胞转化为干细胞，这一发现奠定了成体细胞干细胞培养的重要基础。
而大鼠胚胎干细胞也成为印证这方面工作成果的经典样例。
大鼠胚胎干细胞的培养成体细胞干细胞的培养过程，首先需要提取成体细胞。
成体细胞分化成为不同的组织，其细胞类型、种属、来源、年龄等特性都会影响干细胞的特性。
对于大鼠胚胎干细胞的培养，通常需要从大鼠胚胎中提取内囊泡、体细胞等明显的细胞，经过荷瘤病毒、转录因子等特定的转化方法，使其转化为干细胞。
在大鼠胚胎干细胞的培养过程中，最常见的是将培养基添加到细胞中。
培养基中有各种生长因子，有助于细胞的分化和扩增。
这些培养基还包含适当的营养物质、生长因子和化学物质，以确保大鼠胚胎干细胞在培养基中保持稳定地生长。
此外，对于大鼠胚胎干细胞的培养过程，需要特别注意调整培养基的配方、周期和条件以实现最佳培养效果。
大鼠胚胎干细胞的分化在胚胎干细胞的培养过程中，细胞必须分化成为不同的细胞类型。
大鼠在胚胎发育期间，产生许多不同种类的细胞。
在类似的方式下，大鼠胚胎干细胞造出来的也能够分化成为不同的细胞类型。
这些细胞类型包括神经元、心肌细胞等。
通过调整培养条件，发现对细胞的影响方式，使大鼠胚胎干细胞失去其多能性，也就是走向其性命。
目前，大鼠胚胎干细胞的分化应用在医疗方面的作用还相对有限，但这个领域的不断发展为研究其实际意义提供了更多的机会和潜力。
干细胞提取和培养的实用技巧和建议
干细胞提取和培养的实用技巧和建议干细胞是一类具有自我更新和多分化潜能的特殊细胞，对于生命科学研究和医学应用具有重大意义。
干细胞的提取和培养是干细胞研究的基础工作，在实验室中有着重要的地位。
本文将给出一些关于干细胞提取和培养的实用技巧和建议，希望能对正在进行相关研究的科研工作者有所帮助。
一、干细胞提取的技巧和建议1.选择合适的样本：干细胞的来源多种多样，可以从胚胎、成体组织以及体液等多个渠道获取。
在选择样本时，需要根据自己的研究方向和实验要求来确定合适的来源。
同时，注意样本的获取方式需要符合伦理规范，尽量避免伤害动物或人体。
2.有效的细胞分离方法：干细胞通常以混合细胞群的形式存在于样本中，为了提取纯度较高的干细胞，需要采用有效的细胞分离方法。
常见的方法包括流式细胞术、磁珠分离和显微操纵等，选择合适的方法可以提高细胞分离的效率和纯度。
3.培养条件的优化：提取到的干细胞需要在体外培养中继续生长和扩增，为此，需要针对不同类型的干细胞优化培养条件。
确保培养基的成分和浓度适宜，相应的生长因子和细胞因子能够为干细胞提供必要的生长和分化信号。
4.维持干细胞的干性特性：干细胞的一个特点是具有自我更新和多向分化的能力。
在培养过程中，需要采取一系列措施来维持干细胞的干性特性。
例如，添加适量的抑制剂，调整培养基中的成分，以及维持细胞接触的方式等。
二、干细胞培养的技巧和建议1.培养器具和环境的准备：在进行干细胞培养前，需要对培养器具和环境进行彻底的清洁和消毒。
确保培养皿、培养箱和其他实验室设备无菌，避免细菌和霉菌等污染对干细胞生长的影响。
2.细胞传代的控制：在干细胞的长期培养中，细胞传代是不可避免的。
然而，过多的细胞传代会导致细胞老化和凋亡，影响干细胞的生理状态和功能。
因此，需要控制细胞传代的次数，同时选择合适的传代方法，以保持干细胞的长期稳定生长。
3.培养基的配制和补充：培养基的成分和浓度对干细胞的生长和分化起着重要的作用。
胚胎干细胞的培养和调控
胚胎干细胞的培养和调控胚胎干细胞是一种具有极高生物学价值的细胞。
它的特点是可以无限制地自我复制，并能够分化成人体内的各种细胞类型，包括心脏细胞、神经细胞、肌肉细胞等。
这使得胚胎干细胞成为了治疗许多疾病的有力工具，例如肌萎缩侧索硬化症、帕金森病、白血病等。
为了能够将胚胎干细胞应用于实际医疗中，必须先要掌握胚胎干细胞的培养和调控方法。
第一部分培养胚胎干细胞胚胎干细胞的培养需要一定的条件，其中最重要的是营养基质和生长因子。
营养基质是指提供细胞培养所需营养物质的培养基，生长因子则是刺激细胞增殖、分化和细胞功能发挥的非细胞因子分子。
经过多年的研究，科学家们已经掌握了许多优化的胚胎干细胞培养方法，不断改进和创新。
胚胎干细胞的培养主要分为两种方式：一种是使用人类免疫缺陷病毒（HIV）携带的重编程因子，使成人普通细胞重新向胚胎干细胞转化，这种方法的优点在于可以避免使用和浪费胚胎，并且可以根据患者自身的细胞进行个性化治疗；另一种是从人类胚胎中提取胚胎干细胞，这种方法的优点在于可以获得自体造血干细胞以及每一个器官的种子细胞，但在实际应用中受到较多的道德和法律争议。
无论哪种方式，胚胎干细胞的培养本质相同，主要包括以下几个步骤：1. 种植选取营养基质，并将干细胞种植在营养基质中。
营养基质需要包含必需氨基酸、维生素和其他生命所需营养元素。
2. 培养维持培养基的稳定状态，将培养器置于恒温室内，控制培养环境的温度、湿度和CO2浓度等。
3. 复制控制胚胎干细胞的倍数，使其以匀速增长的状态进行培养。
此过程中，应将胚胎干细胞分离至新的培养基中，以保证细胞的数量和干细胞的稳定性。
4. 检测定期检测胚胎干细胞的状态，包括细胞分裂速率、分化程度和遗传特征等，以确保其基态的维持和无突变状态的可能。
第二部分调控胚胎干细胞胚胎干细胞的应用广泛，不仅包含了生物学研究的范畴，还拥有丰富的临床应用前景。
在这个方向上，胚胎干细胞的调控成为了必不可少的一环。
小鼠胚胎干细胞培养
以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。
不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol和培养基。
一般培养－－维持ES细胞处于未分化状态ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。
为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。
建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。
将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。
如果在Feed细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。
下文中暂不提及Feed细胞。
Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。
培养基ES:配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基－－见下文）。
分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。
通过将21ml该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。
贮存于4℃，时间不要超过2周。
贮存液DMEM（高糖）马血清（HS）L-谷氨酰胺（200mM）MEM NEAA（10mM）HEPES（1M）β-巯基乙醇（55Mm）PESTLIF复苏细胞细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。
然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。
步骤：1．从液氮中取出一管细胞；2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；3．将细胞转移到一15ml Falcon管中；4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；5．离心3分钟；6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；8．孵育。
胚胎干细胞的培养与应用
胚胎干细胞的培养与应用随着科学技术的不断进步，胚胎干细胞已经成为了当今医学研究的热门话题。
那么，什么是胚胎干细胞呢？胚胎干细胞是从受精卵发育而来的一类全能分化干细胞，具有极高的发展潜能和可塑性，能够不断分化为各种不同类型的细胞。
在医学上，胚胎干细胞被广泛应用于组织修复、疾病治疗等方面。
一、胚胎干细胞的培养1. 胚胎干细胞的提取胚胎干细胞的来源主要是人类受精卵和早期胚胎组织。
实际上，胚胎干细胞的提取违反了一些伦理原则，因为需要拆卸一个活生生的胚胎。
因此，在国际上，提取胚胎干细胞的过程和规范都有非常严格的要求。
2. 胚胎干细胞的培养和分化提取到的胚胎干细胞需要进行培养，以维持其生长和发育。
目前，利用培养基、小鼠胚胎等条件进行体外培养的方法比较常见。
培养基中含有不同浓度的各种细胞因子，可以促进胚胎干细胞不断分化为不同类型的细胞。
目前，科学家们已经成功培育出一些实验用的胚胎干细胞系，并利用这些细胞系进行了一些基础研究和实验。
二、胚胎干细胞的应用1. 组织修复胚胎干细胞具有不同类型的分化潜能，能够分化为各种类型的细胞，如心肌细胞、神经细胞、肝细胞等。
这些细胞可以重新修复和再生人体各种组织和器官，包括心脏、脑部、肝脏等。
因此，利用胚胎干细胞实现组织修复已成为医学领域的重要研究方向。
2. 疾病治疗利用胚胎干细胞进行疾病治疗是另一个重要的应用领域。
某些细胞如神经细胞等无法自我修复，其损伤导致的疾病无法治愈。
此时，胚胎干细胞通过分化成相应类型的细胞，能够重新修复并替代受损细胞，从而实现治疗。
例如，利用胚胎干细胞治疗糖尿病、帕金森病等疾病的研究已经有了一些初步进展。
三、胚胎干细胞研究面临的挑战和展望1. 伦理问题胚胎的提取和胚胎干细胞的研究一直是一个伦理和道德问题争议的焦点。
因此，正确认识和解决这些问题，将有助于推动胚胎干细胞研究的发展。
2. 法律法规目前，国际上对胚胎干细胞培育和应用的法律法规比较不一致，这也给胚胎干细胞研究和应用带来了一定的不确定性和局限性。
人naive胚胎干细胞培养体系总结
人naive胚胎干细胞培养体系总结
人naive胚胎干细胞（hESCs）是一种具有多能性的干细胞，具有无限增殖和自我更新的能力，可以分化成各种细胞类型。
以下是关于人naive胚胎干细胞培养体系的总结：
1. 培养基：人naive胚胎干细胞培养体系需要特殊的培养基，包括维生素C、维生素E、谷氨酰胺、非必需氨基酸、糖、脂肪酸、胰岛素、生长因子等。
其中，维生素C和维生素E是维持hESCs多能性的关键因子。
2. 细胞附着：人naive胚胎干细胞需要在特定的细胞附着物质上生长，这些物质包括胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白等。
这些物质可以在培养基中添加或者在培养皿表面涂布。
3. 温度和气体：人naive胚胎干细胞需要在37℃恒温下培养，并且需要5％的CO2和95％的空气（细胞代谢必需的O2）以维持培养基的pH值。
4. 传代：当人naive胚胎干细胞在培养过程中密度过高时，需要进行传代以维持细胞的生长和多能性。
传代过程中需要用胰蛋白酶或EDTA处理细胞，以使其从附着物质上分离下来，然后进行稀释和重种。
5. 分化：人naive胚胎干细胞可以分化成各种细胞类型，包括神经细胞、心肌细胞、胰岛细胞等。
这些细胞可用于治疗各种疾病，如帕金森病、糖尿病等。
总之，人naive胚胎干细胞培养体系需要特殊的条件和技巧，但它们在医学研究和治疗中具有巨大的潜力。
胚胎干细胞和多能诱导干细胞培养方法
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干细胞 (stem cells, SC)
是一类具有多向分化潜能和 2 自我复制能力的原始的未分化细 胞，是形成哺乳类动物的各组织 器官的原始细胞。
3
按分化潜能： 全能干细胞 多能干细胞 单能干细胞
→
按发育状态： 胚胎干细胞 成体干细胞。
当受精卵分裂发育成囊胚时， 内层细胞团（Inner Cell Mass） 的细胞即为胚胎干细胞。
无饲养层培养体系
饲养层细胞分泌的因子难以支持某些ES 细胞的增。ES 细胞 也可在无饲养层细胞的环境中建立和维持 ,培养液中添加L
IF 因子或使用能分泌L IF 的细胞制备条件培养液均可
胚胎干细胞系不 仅是研究细胞分化 的模型,也是研究某 些前体细胞起源和 细胞谱系演变较理 想的实验体系。
胚胎干细胞具有全能性，可以自我 更新并具有分化为体内所有组织的 能力。
胚胎干细胞的特点
全能性
无限扩增性 遗传稳定性
1.是生产转基因动物的高效载体
2.用于疾病治疗
胚胎干细胞用来克隆治疗技术路线
1.胚胎采集
分离具有发育全能性的ES 细胞, 要求选择合适阶段的胚胎。采卵时一 般取囊胚。
2.ICM的获取
从着床前的胚泡中分离内细胞团,是从 早期胚胎建立ES 细胞系的先决条件
直接分离法 免疫外科法 延迟着床法
3.内胚团的离散
分离ICM 时可用吸管将其 从滋养层细胞上转移到胰蛋白 酶微滴中,大约3～5 分钟ICM 细胞彼此解离。
4.胚胎干细胞的鉴定
常用的检测指标有碱性磷酸酶、 OCT24 、细胞特异性表面抗原 (SSEA2l) 等。 测定胚胎干细胞的体内分化能力 是通过制备嵌合体来完成的。
5.培养
有饲养层培养体系
胚胎干细胞是动物个体发生过程中具有全能性的原始细胞,维 持ES 细胞的不分化状态由细胞内一些结构蛋白和多肽因子进 行内源性调控。体外培养的ES 细胞,接种在饲养层细胞上培养 时可以长时间保持ES 细胞的原初特性。用作饲养层的细胞多 数是具有贴附能力的细胞(如成纤维细胞、子宫内皮细胞等)