血凝抑制试验
血凝及血凝抑制试验的应用
血凝及血凝抑制试验的应用血凝现象是指血液由流动的液体状态变成不能流动的凝胶状态的过程。
这种现象在医学领域具有重要意义，可用于血液凝固机制的研究、血液疾病和血栓性疾病的检测和诊断等。
而血凝抑制试验则是一种通过检测血凝因子的抗凝活性，评估血液抗凝系统功能的一种方法。
血凝现象在医学中应用广泛。
血凝机制的研究可以帮助人们更好地了解血液凝固的生理过程，从而对止血和血栓性疾病的发病机制有更深入的认识。
血凝检测在医学诊断中具有重要价值，例如在手术前对患者的凝血功能进行评估，以避免手术中大出血的风险。
血液疾病如凝血障碍、血小板减少等以及血栓性疾病如心肌梗死、脑血栓等均可通过血凝检测进行诊断和病情监测。
血凝抑制试验是一种检测血凝因子抗凝活性的方法。
该方法的基本原理是当血液中存在某种物质（如抗体）时，会抑制血凝因子的活性，从而阻止血液凝固。
通过检测这种物质的含量，可以评估血液抗凝系统的功能。
血凝抑制试验在临床上应用广泛，可用于检测和诊断各种凝血性疾病和免疫系统疾病，如血友病、系统性红斑狼疮等。
血凝及血凝抑制试验在医学领域中具有广泛的应用价值。
对于医生来说，了解血凝现象和血凝抑制试验的原理和应用，可以更准确地诊断和治疗各种血液疾病和血栓性疾病。
随着科学技术的不断发展，血凝检测技术和方法的不断完善和提高，其在医学领域的应用也将越来越广泛和重要。
本文将探讨定向遗忘中提取抑制的机制，并分析其成功提取引起抑制的案例。
简要介绍定向遗忘和提取抑制的概念，然后介绍基础知识点，包括抑制遗忘和提取抑制的作用。
接下来，详细介绍定向遗忘中提取抑制的机制，最后分析一个实际案例，阐述该机制的成功应用。
当我们遇到一个新概念或事物时，通常需要对其进行记忆。
然而，记忆并不总是准确无误的，有时甚至会遗忘某些信息。
定向遗忘便是一种有目的地遗忘特定信息的记忆过程。
与此当我们试图回忆某些信息时，也会受到抑制的影响，导致信息无法成功提取。
提取抑制是一种自我保护机制，可以避免不必要的回忆，从而减轻大脑的负担。
血凝试验
血凝试验(HA)定义：某此病毒或病毒的血凝素，能选择性地使某种或某几种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝(hemagglutination，HA)，也称直接血凝反应，利用这种特性设计的试验称血凝试验(HA)血凝抑制试验(HI)定义：当病毒的悬液中先加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触。
这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制(hemagglutination inhibiion，HI)反应，也称血凝抑制反应，利用这种特性设计的试验称血凝试验(HI) 。
原理：特异性抗体与相应病毒结合，使病毒失去凝集红细胞的能力，从而抑制血凝现象。
用于禽流感、新城疫等具有血凝性病毒的鉴定根据抗原与相应抗体的特异性中和反应原理，给未知病毒悬液中加入已知的抗禽流感病毒阳性血清或已知的抗新城疫病毒阳性血清，相应病毒便丧失了其凝集红细胞的能力。
因此，可利用从发病的鸡、鸭、鹅体内分离的病毒作HA和HI试验。
病毒悬液能凝集红细胞，并且能被已知的抗血清（阳性血清）所抑制，那么该病毒即是已知阳性血清相对应的病毒。
如用新城疫阳性血清完全抑制了未知病毒培养物的血凝性，那么，这个未知病毒培养物就是新城疫病毒；如果病毒悬液虽然能凝集鸡红细胞，但不能被鸡新城疫血清所抑制，说明不是鸡新城疫病毒，可能是其他有血凝性的病毒。
阿氏（Alsevers）液配制称量葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.42g，加蒸馏水至100mL，散热溶解后调pH值至6.1，69kPa 15min高压灭菌，4℃保存备用1%鸡红细胞液的制备2.1采血用注射器吸取阿氏液约1mL，取至少2只SPF鸡（如果没有SPF鸡，可用常规试验证明体内无禽流感和新城疫抗体的鸡），采血约2～4mL，与阿氏液混合，放入装10mL 阿氏液的离心管中混匀。
2.2 洗涤鸡红细胞将离心管中的血液经1500～1800 r/min 离心8分钟，弃上清液，沉淀物加入阿氏液，轻轻混合，再经1500～1800 r/min离心8分钟，用吸管移去上清液及沉淀红细胞上层的白细胞薄膜，再重复2次以上过程后，加入阿氏液20 mL，轻轻混合成红细胞悬液，4℃保存备用，不超过5天。
血凝HA和血凝抑制试验HI
HA值可用于评估血液凝固功能和血栓形成风险
试验方法
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试验材料：抗凝剂、试管、离心机、凝血因子活性检测试剂等。
试验原理：通过观察血液凝固过程，检测血浆中凝血因子的活性。
试验步骤：采集血液样本，加入抗凝剂，离心分离血浆，加入凝血因子活性检测试剂，观察血液凝固时间并记录结果。
不同点：血凝HA试验只能判断是否存在凝血功能障碍或血栓前状态，而血凝抑制试验HI不仅可以判断是否存在凝血功能障碍或血栓前状态，还可以检测抗凝物质的具体类型和浓度。
试验方法的比较
血凝HA试验：通过观察血凝块的形成和溶解过程，检测抗凝物质的存在和含量
操作简便性：血凝HA试验操作相对简单，而血凝抑制试验HI需要更多的样本和操作步骤
参考值：血凝HA试验结果的参考值一般为阴性或阳性，具体参考值因不同病毒而异。
临床意义
用于诊断血栓栓塞性疾病
评估血液高凝状态的风险
辅助诊断易栓症等血栓前状态
监测抗凝治疗的效果
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血凝抑制试验HI
试验原理
血凝抑制试验HI是一种检测病毒抗体的方法，通过与特异性抗体结合，抑制病毒的凝集活性，从而检测出病毒抗体。
临床意义
用于诊断疾病：血凝抑制试验HI可以用于诊断多种疾病，如流感、麻疹等病毒感染性疾病，以及疟疾、血友病等出血性疾病。
监测治疗效果：通过血凝抑制试验HI，可以监测治疗效果，评估病情进展和预后。
指导治疗：血凝抑制试验HI的结果可以指导治疗，例如在输血时，通过血凝抑制试验HI可以确定最佳的输血量。
流行病学调查：血凝抑制试验HI还可以用于流行病学调查，了解疾病的流行趋势和分布情况。
试验意义：用于检测凝血因子活性，评估血液凝固功能，协助诊断凝血障碍相关疾病。
血凝及血凝抑制实验
1、在稀释移取混匀的操作过程中动作要慢，以免损坏红细胞（表现为分离是上清液为淡红色，正常情况第一次分离后上清液为淡黄色，之后直至清亮为清洗干净）。 2、在吸取过程中一定要将中间的白细胞层吸取干净。
血凝(HA)与血凝抑制(HI)试验
一、实验目的 二、实验内容 三、实验原理 四、实验材料 五、实验方法与结果判定 六、注意事项 七、红细胞制备
一、实验目的
1、掌握血凝和血凝抑制试验的基本原理、操 作方法和结果判定方法 2、了解新城疫有关背景知识
二、实验内容
1、血凝试验(HA)检测新城疫抗原的效价 2、血凝抑制试验(HI)检测新城疫抗体（疫苗注射后的抗体检测）
三、实验原理
1、血凝试验（HA）原理：某些病毒或病毒的血凝素能选择性地使某种动物地红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝（HA）,也称直接血凝反应。
病毒颗粒
红细胞
2、血凝抑制试验（HI）原理：当病毒的悬液中加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或血凝素直接接触。这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制（HI）反应，也称血凝抑制反应。
结果判定标准
1、＋＋＋＋：红细胞呈细沙样均匀铺于孔底，即100％凝集； 2、＋＋＋：红细胞均匀铺于孔底，当边缘不整齐而稍向孔底集中，即75％凝集； 3、 ＋＋ ：红细胞形成一个环状，四周有凝集块，即50％凝集； 4、 ＋ ：红细胞于孔底形成圆团，边缘不够光滑，四周稍有凝集块，即25％凝集； 5、－ ：红细胞于孔底形成圆团，边缘光滑整齐，即无凝集；
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血凝HA和血凝抑制试验课件
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3. 热灭活法
3.1鸡血清
取100µL血清样品放入一灭菌离心管中；
各取100µL阳性血清和阴性血清加入到另2个灭 菌离心管中；
56℃水浴30min。
3.2 其它禽类血清
血清用鸡的红细胞处理后，分别取100µL样品、 阳性血清、阴性血清放入灭菌离心管中，56℃水 浴30min。
4000转离心1min；
取出上清，进行HI试验；
用阳性对照血清和阴性对照血清验证处理的彻底性
用于消除除鸡以外的其它禽类的血清非特异性反应。
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2.RDE（受体裂解酶）消除法 2.1试剂： RDE：用20mL无菌PBS稀释，小量分装，-20℃保存一周，注
意避免反复冻融； PBS： pH7.5，4℃保存； 阳性对照血清； 阴性对照血清。 2.2方法： 2.2.1鸡血清 加3倍体积的RDE到1倍体积的血清中； 充分混合； 56℃水浴30-60min; 加入6倍体积于血清体积的PBS。 2.2.2其它禽类血清 依据用RDE处理鸡血清方法处理后，继续按下列方法进行：用
三、实验步骤 （以禽流感为例, 参照禽流感防治 技术规范）
1 阿氏（Alsevers）液配制 称量葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化
钠0.42g, 加蒸馏水至100mL, 散热溶解后调pH值至6.1, 69kPa 15min高压灭菌, 4℃保存备用。
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•2 1%鸡红细胞液的制备
Hale Waihona Puke 全不凝集能使红细胞完全凝集（100%凝集，++++）的抗原最高
稀释度为该抗原的血凝效价，此效价为1个血凝单位
血凝抑制试验结果判断 [血凝血凝抑制试验说明书]
![血凝抑制试验结果判断 [血凝血凝抑制试验说明书]](https://img.taocdn.com/s3/m/18bab48a7f1922791688e8f0.png)
血凝抑制试验结果判断 [血凝血凝抑制试验说明书]鸡新城疫血凝与血凝抑制实验鸡新城疫血凝(ha)及血凝抑制(h1)试验基本原理:许多病毒表面具血凝素,具有凝集某些动物或人红细胞的特性,称为血凝现象,可用于鉴定病毒。
血凝现象可以被特异性抗体所抑制,称为血凝抑制现象,利用这种特性可进行血清学试验,称为血凝抑制试验。
器材及试剂:待检病毒:鸡新城疫病毒鸡胚尿囊液;待检血清:抗鸡新城疫病病毒阳性血清;生理盐水/pbs、1%鸡红细胞、96孔v形微量血凝板、加样器等。
实验步骤pbs的配制:1%鸡红细胞的配制:(一)血凝试验(ha)取96孔板,按以下步骤操作:1、第一排1-12孔各加生理盐水50ul,第二排1-12孔加生理盐水50ul为红细胞对照;2、吸50ul病毒液于第一排第1孔,混匀后取50ul至第2孔,依次稀释至第12孔,弃去50ul,各孔经倍比稀释后稀释度依次为2-1~2-12。
3、第一排1-12孔及第二排1-12孔各加1%鸡红细胞50ul,微型震荡器震荡2min混匀。
4、室温静置10-30分,观察结果(见下表)。
5、结果判定:红细胞对照组红细胞完全沉降,以试验排中能使等量红细胞发生完全凝集的病毒最高稀释倍数,作为病毒的血凝价,即hi效价,用2n表示。
(二)四单位检测:(三)血凝抑制试验(hi)取一96孔板,按以下步骤操作:1、4个单位抗原的制备:按ha试验测出的病毒血凝价除以4即为4个单位血凝素的稀释度。
2、待检血清的稀释:第一、二、三排1-12孔各加生理盐水50ul,于第一排第1孔中加入50ul待检血清,反复吹吸3-5次混匀后,取50ul至第2孔混匀,吸取50ul至第3孔,依次稀释至第12孔,弃去50ul,经倍比稀释,血清的稀释倍数为21~212。
3、第一、二排1-12孔各加4个单位血凝素50ul,微量震荡器震荡2min混匀;4、室温静置20min;5、第一、二、三排1-12孔各加1%鸡红细胞50ul,微量震荡器震荡2min混匀混匀。
hi 血凝抑制试验原理
hi 血凝抑制试验原理血凝抑制试验原理血液是人体内非常重要的液态组织，起着运输氧气、营养物质、代谢产物等多种生理功能。
为了维持正常的生理功能和防止出血，血液中含有一种重要的物质——血小板。
血小板在血液凝固中起着至关重要的作用，能够聚集在出血创面，形成血栓，阻止出血。
然而，当血液中某些异常物质增多或凝血酶活性异常时，会导致血小板过度聚集，进而影响血液凝固的正常过程。
为了测试凝血抑制的功能，研究者发展出了一种被称为“血凝抑制试验”的实验，用来测量凝血抑制的能力。
这项试验主要通过观察某种物质的影响，来判断血液凝固过程中的各个环节是否正常。
在这个实验中，通常使用的是血小板功能阻抑试剂和凝血酶激动剂，来模拟凝血抑制和激动的环节，进而观察它们对血小板聚集的影响。
血凝抑制试验的原理主要有以下几个方面：1. 血小板聚集抑制试验：在这一步中，需要测试某种物质对血小板的聚集抑制能力。
通常，使用ADP、胶原蛋白和花生四烯酸等物质来刺激血小板的聚集。
通过添加阻抑试剂如抗凝剂和抗血小板聚集试剂，观察其对血小板聚集的影响。
比如，阻抑剂能够调节血小板膜上的G蛋白激活，从而减少血小板聚集。
2. 凝血酶抑制试验：在这一步中，需要测试某种物质对凝血酶生成的抑制能力。
凝血酶是血液凝固过程中的一个重要环节，它能够促进血小板聚集和纤维蛋白生成，从而形成血栓。
但是，在一些疾病或药物作用下，凝血酶生成过程受到抑制，阻碍了正常的血液凝固。
因此，在血凝抑制试验中，需要观察某种物质对凝血酶生成的抑制作用。
通常，使用抗凝剂和抗凝酶来抑制凝血酶的生成，然后观察其对血凝过程的影响。
血凝抑制试验在临床医学中具有重要的意义。
通过进行这项实验，可以判断血液凝固功能的异常，为临床医生提供治疗方案的指导。
例如，对于一些血小板聚集功能异常的患者，可以通过观察抑制试剂对其血小板的作用，来确定诊断和治疗的方案。
同时，通过测试凝血酶的生成抑制情况，也可以判断某些患者的凝血功能是否正常，为临床治疗提供指导。
血凝和血凝抑制试验
血清
生理盐水 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 50
被检血清 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 弃 25μl / /
病毒悬液 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 /
1%RBC 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50
实验八 血凝和血凝抑制试验
（Hemagglutination and Hemagglutination Inhibition, HA and HI）
2013.12.11
能凝集红细胞的病原
禽流感病毒 新城疫病毒 传传染性支气管炎病毒（胰酶，磷脂酶C） EDS76 副鸡嗜血杆菌 鸡毒支原体
＝1:23为可疑
六、思考题
血凝和血凝抑制试验在兽医学中的应用。
细胞对照
HA HI
孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 RBC RBC
稀释倍数 1:21 1:22 1:23 1:24 1:25 1:26 1:27 1:28 1:29 1:210
生理盐水 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 病毒悬液 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 弃 5/0μl / 1%红细胞 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50
3. 0.85%生理盐水。 4. 被检血清，采自被检鸡的健康血清。
四、实验步骤
（一）血凝试验（HA）
1. 1~12孔加入50μl生理盐水; 2. 第1孔加50μl病毒悬液，倍比稀释到第10孔； 3. 1~12孔中加入1%的红细胞50μl； 4. 震荡后置37℃25~30min观察结果。 5. 病毒液的血凝价是1:2？。
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影响禽流感血凝抑制试验因素的分析
及解决方法
摘要：在试验过程中，存在很多的因素会直接影响禽流感血凝抑制试验，从而导致试验结果不正确等现象出现，
禽流感病毒能够与鸡红细胞发生凝集现象，这种红细胞凝集现象可被特异性免疫血清所抑制，即红细胞凝集抑制实验（HI）。
基层工作中常用于新城疫、禽流感等免疫抗体的检测，辅助诊断病毒性疾病等，此方法操作简便、快速、准确、实用，但在实践中也常常由于某些因素的影响，从而使试验结果不精确，有时甚至无法判定结果。
1血凝试验原理和方法
血凝(直接血凝)反应(HA)：利用病毒或病毒的血凝素，能选择性凝集动物红细胞及病毒浓度与红细胞凝集程度呈正相关的特性，采集敏感的动物红细胞配制成1%红细胞悬液与待测定的病毒液在微量血凝板上进行红细胞凝集实验，根据红细胞的凝集程度间接测定病毒中的病毒浓度。
方法是用鸡红细胞与标准抗原作用，检测出标准抗原血凝单位,为血凝抑制试验作准备。
2影响血凝试验的主要因素
2.1被检血清腐败变性
被检血清腐败变性严重影响免疫抗体检测。
因此，血样采集后要及时分离血清，分离后及时测定或放臵在4℃冰箱内保存，要力求新鲜，如暂时不测定可冷冻保存。
血清使用前要充分摇匀。
2.2不同来源、不同浓度的红细胞
不同来源、不同浓度的红细胞会使结果差异很大，所以红细胞来源一定要相同。
一般需要3只或3只以上公鸡来提供红细胞，将3只以上公鸡红细胞混合在一起。
也可由1只公鸡来提供红细胞，但必须经多次试验证明是可行的。
有抗体鸡提供的红细胞需要更多次数洗涤。
但要注意有时不同的公鸡提供的红细胞对禽流感H5亚型抗体测定，效价差异很大。
不同浓度的红细胞对抗体测定也有影响。
2.3病毒悬液和红细胞悬液在使用前没有摇匀
病毒悬液和红细胞悬液如没有摇匀，加入时浓度高低不一，会人为造成误差。
因此抗原和红细胞使用前一定要摇匀，保证每一孔中加入的浓度准确一致。
2.4 4个血凝单位(HAU)抗原配制不准确
4个HAU抗原要现用现配，混悬液要混匀，配好的抗原室温下放臵不得超过4个小时，不可反复冻融。
为防止4个HAU抗原配制不准确.在作HI试验前必须做4单位抗原校正。
用微量移液器向反应板的第二孔至第五孔加生理盐水各25微升，第一孔不加。
用微量移液器吸取4单位抗原25微升分别加入第一孔、第二孔中，从第二孔开始挤压4-6次混合，然后吸出25微升至第3孔，依次倍比稀释到第4孔，弃去25微升，第五空为对照空。
用微量移液器再吸取1%红细胞悬液依次加入1-5孔，每孔25微升。
于微量振荡器上振荡1分钟。
室温静臵20-30分钟后观察结果。
若第一、二、三孔为完全凝集，第四孔红细胞为50%沉淀，第五孔为对照完全沉淀，如果出现以上结果，表明所配4单位抗原准确，校正成立。
否则，需重新测定抗原效价，重新配制4个HAU抗原，并作4单位抗原校正，直至结果准确。
2.5 适量配制4单位抗原和1﹪红细胞
配制好的4单位抗原在2-8℃保存条件下，3天内效价基本无变化，1﹪红细胞在2-8℃保存条件下，3天内不会发生溶血。
超过3天，4单位抗原和1﹪红细胞会因自身效价降低和溶血而影响实验结果。
因此，每次实验前要根据待测样品数量计算一下本次实验需要多少的4单位抗原和1﹪红细胞，适当配臵，避免因多配而引起浪费。
2.6温度
温度对实验结果也有影响，一般要求在室温25-37℃进行实验，当温度过高，超过37℃以上时，会使反应结果解脱加快，易发生病毒解离，这样，反而阻止反应；当实验温度低于4℃时红细胞有时会发生自凝现象。
2.7微量血凝板的清洁
微量血凝板的清洁度对试验结果有很大的影响。
微量血凝板清洁的正确程序为首先用自来水反复冲洗，然后于1%-2%的稀盐酸中浸泡24h以上，再用自来水反复冲洗2-3次，最后经蒸馏水浸泡24h后37℃烘干备用。
3常见结果现象分析
3.1对照孔凝集现象
3.1.1盐类凝集：所谓盐类凝集即稀释液中氯化钠达至一定高浓度时，即使没有血清抗体也能发生凝集反应。
3.1.2当生理盐水被细菌污染时也可出现对照孔凝集。
3.1.3血清变质或受细菌污染时也可以出现对照孔凝集。
3.2.全部凝集
3.2.1 当红细胞受细菌污染或保存时间过长可出现此现象。
3.2.2 抗原滴加时出现失误，工作抗原效价过高。
3.2.3生理盐水受细菌污染或其它因素。
3.3红细胞全部下滑
3.3.1当配制抗原时，配制工作抗原效价过低，不足以凝集鸡红细胞。
3.3.2加样时所有孔全部加成生理盐水亦出现全部下滑现象。
4 HA-HI试验操作中应注意的问题
4.1可根据待检样品的多少和操作者的熟练程度来选定移液器。
血凝抑制试验中最常见的是跳孔现象（如第3孔和第5孔均出现血凝抑制，而第4孔却出现凝集），使结果无法判定。
微量法的特点是节省抗原，测样多，如用多头移液器可同时检测几个血样，但要求操作者认真熟练，否则会有一定误差。
4.2在微量法中移液工具的准确度直接影响试验结果。
若移液枪使用不当对试验结果有较大影响，应用这种器具前每次都应校准吸液量并将刻度固定好，注意把每个吸头安装牢固密封，操作时手压下的力度均匀，否则移液量偏差，造成结果不准确。
4.2.1移液枪下压时有二个阻力位臵，压下时第一个即为标准刻度的量值，再加力压的第二个阻力位臵为放液时用的位臵。
因此，不要在吸取时将移液枪重力压入第二个阻力位臵，特别是在V型孔中稀释时，有时重压有时轻压,使试验用液吸入不准造成试验结果不准确。
现在都使用多头微量移液器代替单道移液器进行实验操作，以提高工作效率，但应用这种器具前每次都应校准吸液量并将刻度固定好。
注意把每个吸头安装牢固密封，操作时手压下的力度均匀，否则移液量偏差，造成结果不准确
4.2.2移液枪在96孔V型板的试验使用中，不要紧靠V孔底部,可能会影响液体正常吸入，造成试验液量偏少。