细胞复苏与冻存

细胞冻存与复苏

原则：慢冻快融

在超低温的液氮中进行冻存（-196度）。在冻存过程中，随着温度的改变，细胞内部结构讲发生一系列的变化。细胞快速冻存时，将会受到很大的损伤，甚至导致细胞的死亡。温度急速下降时细胞脱水少，还会使细胞内结冰。细胞内冰晶的形成会造成蛋白质和酶的变性，以及细胞器的损伤，并最终导致细胞的死亡。因此，冰冻细胞时，应使温度缓慢下降，从而使细胞内水分渐渐脱出，使细胞内不结冰。由于冰冻细胞体中的冰晶体很小，融化时必须快，以防这些微小晶体转化为较大的冰晶体。因此，细胞的冻存和融化过程要在缓冰速融”下进行。一般冷冻时，在-30度之前药缓慢降温，速度控制在每分钟下降1度，—30度以下可快速冷冻，使温度降至—196度。

冰冻时还要加入5〜10 %的甘油或二甲基亚砜作为冷冻保护剂。因为二者分子量小，容易穿透细胞降低细胞内的冰点，并提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冻存，可使细胞内的水分渗出在细胞外形成冰晶，从而避免细胞损伤。

在细胞复苏过程中，必须快速溶解,否则容易造成细胞外溶解的水分进入细胞内重新形成冰晶，造成细胞死亡。

一、细胞复苏

如果冻存前细胞状态好，而且冻存时间长，复苏用的培养液没问题的话，复苏细胞出现问题最可能的原因是解冻时间过长和解冻后没

有及时稀释接种

KEY：

1．冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。

2．细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常（例如产生单株抗体或是其它蛋白质）。

Protocal

（以贴壁细胞系tsA201 为例）

1. •准备材料：37C〜40 C水浴，37 C预热培养液，离心管、血球计数盘与盖玻片

2. 细胞实验室进行常规消毒，紫外照射30 min 以上，超净台开启通风10 min。培养液孵温至于37 °C

3. 培养液回温后喷以70 % 酒精并擦拭，移入无菌操作台内。将7-10 ml 左右新鲜培养基移入离心管中，备用。

4. 带上厚手套用镊子将冻存管从液氮保存罐中取出（操作人员

应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害），检查盖子是否旋紧（由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉）。立即放入40 C水浴中，轻摇冷冻管使其在快速全部融化（如果冻存管封闭不严格,在水中出现气泡,那么细胞无法继续使用），以70 % 酒精擦拭冻存管外部，移入无菌操作台内。

5. 将细胞悬液移入已加培养基的离心管中，稍微吹打混匀，低速离心（1000rpm ，4min ）去除上清，加入适量培养液重悬，计数，调整细胞浓

度，37C 5%CO2培养。取0.1ml解冻细胞悬浮液作存活测试。

6. 24h 后观察细胞，视情况是否换液，继续培养

7. 记录复苏日期。

注意事项：

安全防护

1 ．液氮

取细胞的过程中注意带好防冻手套，护目镜。

2．冻存管爆裂

细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸。为防止冻存管在升温时爆裂等，可以在放入水浴前就实现在超净台里把盖子拧松一下然后再拧上。

从液氮罐里拿出来不是说一定要分秒必争地放入水浴。细胞从液氮的零下1 百多度升到比如负八十这个过程对细胞没有损害。有足够的时间handle 这些。只不过一旦细胞化了，就应该争分夺秒地把它放入培养液了，主要是为了稀释DMSO。常温下高浓度DMSO对细胞的损害比较大。

温度与速度

★37〜40 C。如果复苏温度太低，会造成细胞的损伤，水浴温

度40C 应该也没问题，但不能太高了。

★常温下二甲基亚砜（DMSO）对细胞的毒副作用较大，因此，必须在1-2 min 内使冻存液完全融化。

离心与换液与培养

★解冻后是否立即去除冷冻保护剂（例如DMSO 或glycerol），依

细胞种类而异。

目前主要有两种见解。

一种为标准流程。将解冻后的细胞悬液先进行离心，以去除冷冻保护液DMSO 对细胞的损伤，所以须将离心后的液体前倒净，且一定倒干净。但是离心也会对刚复苏的状态欠佳的细胞产生损伤。因为离心的目的是两个，去除DMSO，去除死细胞，但对一般人来说，把握不好离心转速和时间，转的不够活细胞沉底的少，细胞就全被扔掉了，转过了活细胞会受压过大，死亡。此外在操作过程中容易污染。

另一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养，第二天换液。但此种方法这可能使培养基中少量的DMSO 对细胞造成损伤。

★离心前须加入适量培养液。细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高，加入适量量培养液可稀释其浓度，以减少对细胞的损伤。

★如果不离心，加培养基的量放入问题：这个量的多少的把握主要涉及到的问题是DMSO 的浓度，从如果你加培养基的太少，那么DMSO 的浓度就会比较大，就会影响细胞生长，从以前的资料来看，DMSO 的浓度在小于0.5% 的时候对一般细胞没有什么影响，还有一个说法是1％。所以如果你的冻存液的浓度是10％DMSO 的话那么加10ml 以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度★ 细胞贴壁少的问题：教科书中说明冻存细胞解冻时1ml 细胞液要加

10ml －15m 培养液，但培养基加多会增加悬浮力，细胞不好贴壁，所以有时培养基越少细胞越容易贴附。

Troubleshoot （以Raji 为例）

1. 取错细胞：拿错冻存管。（快快快，匆忙之中，难免出错，况且－

170 多度，冻手！）

==> 核查记录册及冻存管上细胞的名称、时间是否一致。

==> 拿细胞时戴手套！

2. 水浴时间太长：2min 还没融化。（冻存管的壁较厚，隔热）

==> 适当提高水浴温度（37 度－40 度）

==> 要是冬天，就选用保温盒。

3. 冰盒内时间太长：复苏1h 后，还没有加入新的培养液。（高浓度

DMSO防止胞内形成冰晶，冻存时保护细胞，但复苏融解后，浸泡时间太久会，对细胞有毒性）

==> 提前预定超净台，减少复苏后插在冰盒里等待的时间。

4. 失去耐心：复苏三四天后，细胞没有任何动静，认为失败，倒掉所有细胞。（有些细胞复苏后一星期，才有起色）

==> 不要换液，耐心等待，两周后再做决定。

经验与讨论：

★ 不必等细胞全化了再从水浴里取出来。只要冰块浮起来了就差不多了。我一般最多水浴不超过1.5 分钟。然后经过喷酒精消毒什么的差不多又半分钟过去了。每次都还有没化的。先把已经融解的部分吸到培养瓶里，再从培养瓶里吸些培养液到冻存管里，余下的冰块瞬间就化了，再一起吸到培养瓶里。

★ 恒温水槽的温度最好在40 度左右（个人经验），冻存管内液体融化较快，温度又不至于太高损伤细胞。