6 7 色谱聚焦 亲和色谱8
9 亲和色谱
然后把含有目的物质的混合液作为流动相，在 有利于固定相配基与目的物质形成络合物的条 件下进入层析柱。
16
这时，混合液中只
有能与配基发生结合反
应形成络合物的目的物
质（图中· 分子）被吸附。
不能发生结合反应
的杂质分子（图中△分 子）直接流出。
17
经清洗后，选择适当的洗脱液或 改变洗脱条件进行洗脱（图中c），
22
配体的选择：
一对可逆结合的生物分子中与载体相偶 联的一方称配体。如抑制剂，底物，抗体， 辅酶等。
优良配体须具备的条件：
1）与待纯化的物质有较强的亲和力。 2）具有与基质共价结合的基团。
23
目的产物与相应的配基
所要分离的目 的产物
酶 抗体 凝集素 激素
相应的配基
底物、抑制剂、辅酶（辅因子） 抗原、病毒、细胞 多糖、糖蛋白、细胞受体 受体、载体蛋白
亲和配基选择（很困难）：
组合化学肽库：小肽亲和配基。
噬菌体展示技术筛选：目标蛋白与噬菌体结合。
SELEX技术筛选：：与蛋白质相匹配的寡核苷酸 6
9.1 生物亲和作用
9.1.2 影响亲和作用的因素
离子强度 pH值
抑制氢键形成的物质
温度 螯合剂
7
9.1 生物亲和作用
9.1.3 亲和作用体系
8
9.2 亲和色谱原理
使被分离物质与固定相配基解离，
即可将目标产物分离纯化。
18
9.3 亲和色谱介质
一般情况下，需根据目标产物选择合适 的亲和配基来修饰固体粒子，以制备所需的
亲和吸附介质（固定相）。 固体粒子称为配基的载体。
19
作为载体的物质应具有（6点）： ①不溶性的多孔网状结构，渗透性好； ②物理和化学稳定性高，有较高的机械强度， 使用寿命长； ③具有亲水性，无非特异性吸附； ④含有可活化的反应基团，利于亲和配基的固
分析化学第十章_亲和色谱
分析化学第十章_亲和色谱亲和色谱(affinity chromatography)是一种利用生物分子之间的特异性相互作用来分离和纯化目标分子的分析方法。
它是一种分子识别性较强的分离技术，广泛应用于生物医药领域。
亲和色谱的基本原理是利用配体（ligand）与目标分子之间的特异性结合，实现目标分子的选择性吸附和洗脱。
配体可以是抗体、酶、受体、亲和剂等，通过共价或非共价的化学方法与固定在色谱填料上，形成亲和色谱填料。
目标分子与配体之间根据亲和性或特异性结合，而非目标分子则快速洗脱。
亲和色谱的步骤包括样品加载、洗脱条件优化和目标分子收集。
首先将样品加载到亲和色谱柱中，目标分子与亲和填料的配体结合。
随后，通过改变洗脱液的条件，如pH、温度、离子强度等，以破坏目标分子和配体之间的结合，实现目标分子的洗脱。
最后，收集目标分子的洗脱液，得到纯化目标分子的样品。
亲和色谱具有高选择性、高灵敏度、易操作等优点，适用于分离和纯化复杂混合物中的目标分子。
它被广泛应用于蛋白质、核酸、糖类等生物大分子的纯化和分析。
亲和色谱的应用领域包括药物研发、生命科学研究、生物工程等。
例如，在药物研发中，可以利用亲和色谱分离和纯化药物靶标蛋白，以研究药物的作用机制。
在生命科学研究中，亲和色谱可以用于蛋白质相互作用的研究，如蛋白质结构和功能的研究。
在生物工程中，亲和色谱可以实现重组蛋白的纯化和分析。
亲和色谱还可以与其他色谱技术相结合，形成多维色谱系统，提高分离的选择性和分辨率。
例如，结合亲和色谱与离子交换色谱，可以实现对混合物中多种目标分子的同时纯化和分析。
近年来，亲和色谱技术不断发展，涌现出更多新的亲和填料和新的亲和配体。
例如，金属亲和色谱、核酸亲和色谱、抗体亲和色谱等，拓宽了亲和色谱的应用范围。
此外，与质谱、光谱等分析技术相结合，可以进一步提高亲和色谱的灵敏度和分析能力。
综上所述，亲和色谱是一种利用生物分子间特异性相互作用的分离纯化方法，具有高选择性和灵敏度，广泛应用于生物医药领域。
色谱分析
1相对保留值：在相同操作条件下，组分与参比物质的调整保留值之比。
常用r2,1表示。
2.程序升温：即柱温按预定的加热速度，连续的随时间线性或非线性增长，使柱温与组分的沸点相对应。
3.分离度：又称分辨率，相邻两组的色谱峰保留值之差与峰底宽总和一半的比值。
4.裂解色谱法：高分子化合物在一定条件下热裂解成易挥发的小分子。
然后将裂解的产物由载气送入色谱柱中进行气相色谱分析。
5.衍生气相色谱法：欲测试样品在适当条件下与所选用的试剂作用，使其转化为满足色谱分析要求的既定物质后，再进行色谱分析的方法。
6.梯度洗脱：载液中含有两种（或更多）不同极性的溶剂，在分离过程中按一定的程序连续改变载液中溶剂的配比和极性，通过载液中极性的变化来改变被分离组分的分离因素，以提高分离效果。
7.正相色谱、反相色谱：正相色谱：流动相的极性比固定相小;反向色谱：流动相的极性比固定相大。
8.亲和色谱：利用生物大分子和固定相表面存在某种特异性吸附，而进行选择性分离的一种色谱分离方法。
9.相对比移值：指被分离组分与所选参比物质的比移值之比,用r i，S表示10.分离数（SN）：采用固定组成展开剂展开时，从样品原点到展开剂前沿之间能够容纳的完全分离开的峰个数。
11.超临界流体：是指在高于临界压力和临界温度时的一种物质状态。
它既不是气体，也不是液体，但它兼有气体的低粘度、液体的高密度以及介于气、液之间较高的扩散系数等特性。
12.淌度：带电离子在单位电场下的迁移速度。
淌度不同是电泳分离的基础。
13.电渗流：由于液固界面的双电层存在，在高压电场中溶液一侧的电荷会发生移动，移动的方向通常是从正极到负极，双电层的“滑动”，带动毛细管中溶液整体向负极流动，该现象称为电渗流。
14电泳：在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象。
15校正因子：其物理意义是单位峰面积所代表的被测组分的量。
用f i表示。
亲和色谱
过渡金属可形成螯合金属盐固定在固定相离子的 表面，用作亲和吸附的配基，这种利用金属离子 为配基的亲和色谱成为金属螯合亲和色谱或固定 化金属离子色谱
• 组氨酸：弱疏水性、咪唑环为弱电性
在盐浓度较低和pH约等于目标蛋白质等电点的溶 液中，固定化组氨酸的亲和吸附作用最强，随着 盐浓度的增大，吸附作用降低。 利用组氨酸为配基可亲和分离等电点相差较大的 蛋白质，洗脱则可采用增大盐浓度的梯度洗脱法
亲和色谱
• 利用生物亲和作用的原理纯化蛋白质的报道最早 见于1910年 • 有意识的利用生物亲和作用纯化蛋白质的研究始 于20世纪50年代初 • 1967年，亲和纯化技术从研究走向实用，出现了 亲和色谱这个名称 • 20世纪80年代以后，利用生物亲和作用的特异性 与其他分离技术相结合
定义
• 生物亲和作用：生物物质，特别是酶和抗 体等活性物质，具有识别特定物质并与该 物质的分子结合的能力。这种能力具有排 他性。生物分子间的这种 特异性相互作用 称为生物亲和作用。 • 亲和分离：利用生物分子间的特异性结合 作用的原理进行生物物质分离纯化的技术
• 肝素 与脂蛋白、脂肪酶、甾体受体等具有亲和作用。 其亲和作用在中性pH值和低浓度盐溶液中较强
亲和吸附剂及其制备 将亲和配基共价偶联在固体粒子的表面
（孔内）即可制备亲和吸附剂。
制备方法：书 323--325
配基固定化密度：吸附容量、空间位阻 作用 最佳密度值范围
亲和色谱
-间隔臂的作用
生物亲和作用
亲和作用的本质
亲和作用是自然界普遍存在的现象，生物分子间 的亲和作用具有更高的选择性。 蛋白质参与亲和作用的机理还不完全清楚，一般 认为蛋白质的立体结构中含有某些参与亲和结合 的部位，这些结合部位呈凹陷或凸起的结构。
色谱分类及应用领域
Starting material
Peak 2
Mini Q PC 3.2/3: Glutathione synthetase
SDS-PAGE
操作 1st 恒定洗脱(Sephadex常用)
缺点：洗脱体积大,溶质洗脱不尽
2nd 线性梯度洗脱(linear gradient elution)
线性梯度洗脱的优缺点 优点：流动相I/pH 连续变化，不易出现干扰峰，操作范围广； 缺点：需要特殊的浓度梯度设备，如梯度混合器。
围。如， Sephadex G50的分级在1.5-30KD内。 溶胀率/吸水率：
如，Sephadex G50的溶胀率 = 500 ± 30%。
吸水 W 率 溶 胀 平后 衡g eW l干 ge1 l 0% 0 W 干gel
凝胶粒径：软gel粒径较大，在50-150m之间；硬gel较小，在5-50m之间。粒径越小， HETP越小，分离效率越高。
床体积(bed volume)：1g干燥gel溶胀后所占有的体积。如， Sephadex G50的床体积为 9-11 cm3/g干胶。
空隙体积(void volume)：凝胶之间的空隙体积，即V0。
空隙体积一般用平均分子量在2000KD水溶性蓝葡聚糖(blue dextran)测定。
V0 Vt
4)影响GFC分离特性的因素
降低急剧增大。这主要由于分子的扩散影
响。
H ( HETP ) A B Cu u
进样体积：
1st 在一定相对料液体积范围内，HETP为常数；
2nd 但一定时间之后，HETP随料液相对体积的增加而急剧增 大。
3rd 意义：为得到较高的分离度，料液体积需根据溶质的m 差别控制在适当的范围内，在不影响分离度的前提下取 最大值。
亲和色谱法
亲和色谱法亲和色谱法是一种用于分离、纯化生物大分子的技术，它利用生物分子之间的亲和作用来进行分离、纯化。
它的基本原理是：在柱子的表面放置一种可以与目标生物分子发生亲和作用的固定化剂，然后将待测样品通过柱子进行流动。
当目标生物分子与固定化剂发生亲和作用时，就会被吸附在柱子的表面；而其他的杂质分子则不会被吸附，经过柱子流出。
最后，再通过适当的方法将目标生物分子从柱子上解离出来，即可得到高纯度的目标生物分子。
亲和色谱法的优点是分离效率高，可以得到高纯度的生物分子；缺点是分离的速度较慢，而且对于某些生物分子可能难以得到较好的分离效果。
亲和色谱法主要应用在生物学、药学、食品工业、环境监测等领域，并在这些领域取得了巨大的成功。
在生物学领域，亲和色谱法常用于抗体分离、酶的纯化、抗原的分离等；在药学领域，亲和色谱法常用于药物的纯化、抗体药物的生产等；在食品工业中，亲和色谱法常用于食品添加剂的分离、蛋白质的纯化等；在环境监测领域，亲和色谱法常用于水质监测、空气监测等。
亲和色谱法的原理是基于生物分子之间的亲和作用，因此选择固定化剂时需要考虑到固定化剂与目标生物分子之间的亲和作用。
常用的固定化剂有抗体、酶、抗原、细胞表面蛋白等。
选择固定化剂时，需要考虑到固定化剂的稳定性、选择性、可交换性、可再生性等因素。
亲和色谱法的实验过程大致分为固定化、流动、洗脱、解离四个步骤。
在固定化步骤中，需要将固定化剂放在柱子中，然后将柱子浸泡在预处理溶液中，使固定化剂与柱子结合起来。
在流动步骤中，需要将待测样品通过柱子进行流动。
在洗脱步骤中，需要通过适当的洗脱溶液将非目标生物分子从柱子上洗脱出来。
在解离步骤中，需要通过适当的方法将目标生物分子从柱子上解离出来。
亲和色谱法的优点是分离效率高，可以得到高纯度的生物分子。
缺点是分离的速度较慢，而且对于某些生物分子可能难以得到较好的分离效果。
因此，在使用亲和色谱法时，需要根据实际情况来选择适当的固定化剂和洗脱溶液，并适当调整流速，以提高分离效率。
8 亲和色谱
4)．温度T T 使分子和原子的热运动，结合 中心的静电作用、氢键及金属配位 键，但可使疏水性作用。
5)．离子 SCN-，I-和ClO4-等半径较大的阴离 子能降低疏水相互作用。则这些离 子会降低Affinity。
6). 表面活性剂/乙二醇
7)．鳌合剂 如果Affinity源于亲和分子对与金属离子 形成的配位键，则加入乙二胺四乙酸 EDTA等鳌合剂除去金属离子，可使 Affinity消失。
Affinity。
许多亲和吸附的目标蛋白质可用高浓度盐溶液洗脱， 说明静电引力在Affinity中占有重要地位。
2)．pH 配体
配基
结合中心
在亲和分离操作中, 溶液pH值的选择是 非常重要的.
3).抑制氢键形成的物质
脲和盐酸胍的存在可抑制氢键的形成. 因此,如果Affinity中存在氢键,则加入脲或盐 酸胍可减弱Affinity。但他们为强烈变性剂。
是亲和技术与膜分离相结合的分离 纯化技术，是亲和层析的另一种变形.
优点(兼备亲和吸附与膜分离):
1st 亲和作用高选择性 + 不溶性微粒固定相的亲和配基，从而增 大目标分子与杂分子的尺寸差别，大大提高膜分离的选择性。 使亲和过滤的纯化水平可接近或达到亲和层析；
2nd 膜分离以压差为传质推动力，速度快，易于放大和实现连续 化操作;
吸附的影响因素
亲水性 目标产物
1st 离子强度
疏水性 目标产物
疏水性 杂蛋白
亲水性 杂蛋白
2nd 离子种类
3rd pH Value 4th 杂蛋白
亲和色谱洗脱
可控制的条件
1st 离子强度 2nd pH 3rd 抑制氢键形成的物质
4th 温度
5th 离子
亲和色谱
Chitin
Trypsin
A
B
C&D
以凝胶电泳检验亲和色谱 操作过程各步骤样品→
Ate 吸附剂：
羟基磷灰石
(Ca5(PO4)3OH)2
可选择 NaCl 或 磷酸 等不同洗脱条件
Bio-Rad CHT
●疏水性层析法：
●●●●● ●●●
-NH2
●● ● ●
硫醇基 -SH
X
■ 可与各种配体基团反应的载体：
配体基团 親 和 性 载体
CNBr-activated Sepharose 4B
Pharmacia
反应方式
直接反应 加 EDC*
反应基团
-C≡N -COOH N-OH-succinimide Oxirane环氧己烷
■ Hydrophobic interaction 色析法：
Ammonium sulfate (% sat.) 25
0 10
Protein concentration
20
15
20
10
5
30
40
50
100
200
300
400
Elution volume (mL)
Pharmacia HIC
Ethylene glycol (%)
亲和色谱(AC)
（Affinity chromatograph）
原理：利用生物大分子和固定相表面存在的 某种特异性亲和力，进行选择性分离。 先在载体表面键合上一种具有一般反应 性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接 上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将 只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作 用而被保留。改变淋洗液后洗脱。 亲和洗提 酶与其它化合物一起吸附到一种离子交换剂 上，然后用适当的底物特异地洗提。
第八章 亲和色谱
第八章亲和色谱( Affinity chromatography)第一节生物亲和作用•生物分子能够区分结构和性质非常相近的其他分子，选择性地与其中某一种分子相结合——生物分子间的这种特异性相互作用称生物亲和作用，通过亲和作用发生的结合称为特异性结合或亲和结合。
一、生物亲和作用的概念•亲和作用是分子之间的结合作用，自然界普遍存在的现象，生物分子间的亲和作用具有更高的选择性二、亲和作用的本质必要条件：钥匙和锁孔的关系此外，还需要具备相互作用：静电作用；氢键；疏水性相互作用；配位键；弱共价键•(1) 离子强度三、影响亲和作用的因素静电引力减弱或完全破坏亲和作用氢键疏水相互作用亲和作用增大静电引力在亲和作用中占重要地位，所以一般可以用高盐洗脱•蛋白质为多价两性电解质，含有许多解离基团，不同解离基团的解离常数不同。
•(2) pH 值如果，静电引力对亲和作用的贡献最大，pH 就会严重影响亲和作用。
溶液pH 值选择非常重要。
•(3) 抑制氢键形成的物质•(4) 温度•(5) 离液离子•(6) 螯合剂四、亲和作用体系第二节亲和色谱原理•将具有亲和作用的两种分子中的一种分子与固定粒子共价偶联，可以特异性吸附或结合另一种分子，使另一种分子容易从混合物中得到选择性分离纯化。
•亲和作用分子对中被固定的分子称为其亲和结合对象的配基，亲和色谱的固定相是键合亲和配基的亲和吸附介质。
•操作一般分为进料、杂质清洗、目标产物洗脱和色谱柱再生等4个步骤。
配基不溶性母体载体或担体当用小分子化合为作为配基时，由于空间位阻作用，难于与配对的大分子亲和吻合，常在母体与间隔臂以增大配基与载体之间的距离，使其与生物大分子发生有效的亲和结合。
第三节亲和色谱介质•①酶的抑制剂与酶的活性部位结合•生物大分子或小分子化合物•②抗体单抗和多克隆抗体免疫亲和色谱•③A蛋白相对分子量约42000,与抗体结合,但不影响抗体与抗原结合可用于分离抗体-抗原复合体•④凝集素与糖特异结合的蛋白质的总称,如刀豆蛋白可用作糖蛋白、多糖、糖脂等的亲和配基。
亲和色谱的原理及应用
亲和色谱的原理及应用1. 亲和色谱的基本原理亲和色谱（Affinity chromatography）是一种常用的分离和纯化生物大分子的方法，基于物质在特定条件下与特异性的配体之间的亲和力相互作用。
它利用生物大分子与某种特定配体之间的选择性相互作用，将目标分子从复杂的混合物中分离出来。
2. 亲和色谱的工作原理亲和色谱的工作原理基于目标分子与固定相上的配体之间的特异性亲和作用。
以下是亲和色谱的基本步骤：1.固定相制备：在某种合适的固定相上固定配体，通常使用大孔吸附树脂、高分子凝胶或亲和层析介质。
2.样品处理：将含有目标分子的混合物与固定相接触，使得目标分子与配体结合。
3.非特异结合物洗脱：通过洗脱步骤，去除与固定相上的配体无关的非特异结合物，以提高目标分子的纯度。
4.目标分子洗脱：利用改变条件的方式打断目标分子与配体的结合，使目标分子从固定相上洗脱出来。
3. 亲和色谱的应用领域亲和色谱广泛应用于生物科学的各个领域，以下是一些常见的应用领域：•蛋白质纯化：亲和色谱是蛋白质纯化中最常用的方法之一。
可以利用靶蛋白与配体的特异性结合进行纯化。
•抗体纯化：亲和色谱也常用于抗体的制备和纯化，通过抗原与抗体的特异性结合来实现。
•肽片段分离：亲和色谱可以用于肽段的富集和分离，通过将特定的配体固定在固定相上，然后与目标肽段进行亲和结合。
•糖类分析：亲和色谱也可用于糖类分析，通过固定配体选择性地结合特定的糖类。
•核酸纯化：亲和色谱也被广泛应用于核酸纯化，通过将亲和分子（如亲和标签等）引入目标核酸或特定的配体与核酸结合，进行纯化。
4. 亲和色谱的优势和局限性亲和色谱具有以下优势：•高选择性：亲和色谱利用特异性的亲和分子与目标分子之间的相互作用力，具有很高的选择性。
•高纯度：亲和色谱可以将目标分子高效地分离纯化，得到高纯度的产物。
•广泛适用性：亲和色谱可以应用于各种生物大分子的分离和纯化。
然而，亲和色谱也存在一些局限性：•结合条件：亲和色谱需要优化和控制结合条件，以确保目标分子与配体之间的结合。
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四、由氨基-Sep或羧基- Sep制备 Sep-(CH2)6-NH2 L-COOH AH-Sep Sep-(CH2)6-COOH L-NH2 CH-Sep 碳二亚胺法（配基偶联的一种方法）：
还有多种方法可以完成琼脂糖多糖载体活化 和配体偶联过程 , 如: 双环氧法等 p140-145
双环氧法制备亲和吸附剂的原理
㈢ 配体的浓度
一般使用较高的固定化配体浓度 配体亲和力高，且本身带电则浓度须降低 配体浓度过高引起色谱畸变。(与很多物质发生 非特异性结合)
㈣ 配体的选择
1. 考虑亲和势 L+S LS Kl= [L][S]/[LS] 要求Kl在10-4～10-8mol/L之间 2. 与L的偶联不破坏L与S的结合 3. 需了解L-S的作用机制 如……
亲和层析的必要条件: 合适的配体（配基、ligand) 合适的载体（Matrix) 合适的吸附和洗脱条件
第二节 亲和色谱配基 (ligand L) ㈠ 作为配体的条件
亲和力大;具有解离平衡;与载体偶联不失活
㈡常用系统
酶: 底物或类似物、辅助因子、可逆抑制剂、效应物 核酸: 互补顺序、组蛋白、结合蛋白、核酸多聚物 激素: 受体、运载蛋白 抗体: 抗原、病毒、细胞 外源凝集素: 多糖、糖蛋白、细胞
表7.3 接有连接臂的亲和层析用载体
载体
连接臂 3-氨基丙基和琥珀酰氨基丙基 3,3’-二氨基丙基和琥珀酰二氨基丙基
供应商 Bio-Rad Bio-Rad ICN Pharmacia Serva Miles IBF Merck
琼脂糖
1,2-二氨基乙烷, 1-二氨基己烷, 3,3’-二氨基二丙胺 1,6-己二胺, 6-氨基己酸 3,3’-二氨基丙基胺, 对苯甲酰基-3,3’-二氨基丙基 胺 氨基烷基(2,4,6,8,10)
三、 由CNBr活化型Sep.4B制备 商品名：CNBr-Sepharose
一般步骤：
冻干粉
溶胀洗涤 溶解L ①
混合反应 ②
掩蔽 ③
洗去L（未结合）
成品
亲和吸附剂的制备过程
㈠. 溶胀和洗涤 用1mol/L HCl 溶胀洗涤除细碎粒子 ㈡. 偶联条件 注意： 前处理、偶联密度、缓冲液种类及pH ㈢. 掩蔽 偶联后有部分氰酸酯未偶联上L，常利用 含-NH2的缓冲液或含-NH2的分子处理，将其 掩蔽。 ㈣. 洗去未结合L 用高-低交叉pH来洗（4～5次）
E = 乳糖合成酶A蛋白 B = α- 乳清蛋白 E + A EA + B A = N – 乙酰 – D – 氨基葡萄糖
负洗脱
EAB
两元专一性实例
三元专一性实例
正洗脱 A = NAD+ B = AMP C = Py E = LDH
第六节 其它亲和色谱简介
一、 共价色谱 利用形成和破坏共价键能力的差异分离 其共价键常为二硫键—S-S— 主要用于分离分子中含巯基的Pr、多肽
基本层析过程……
二、 疏水色谱
将疏水的L连到Gel上
作用力—蛋白质的疏水区与疏水性配基间 形成疏水键
可高盐上柱，低盐洗脱或高温上，低温洗。
Байду номын сангаас
三、螯合色谱 原 原理 理 His Cys Trp能与某些金属离子形成复合 物，若将金属离子固定，可将含这些外露 AA的Pr吸附。
固定方法： 将环氧活化型Sepharose6B与金属螯合剂偶 联成配基，再用金属离子处理。如… 洗脱：采用增加I或降低pH或加入EDTA
聚丙烯酰胺-琼脂糖 多孔玻璃
1,6-己二胺, 6-氨基己酸 氨基丙基, 氨基己基
四、 偶联用Gel
㈠. CNBr活化型 Sepharose
溴化氰对多糖类载体的活化反应
溴化氰活化多糖的配体偶联反应
溴化氰法的特点：
活化效率高，速度快，配体结合量大，毒性大。 （废液可用碱性硫酸亚铁中和） 主要影响因素： 活化： CNBr的用量，pH，温度，时间 偶联：配体的用量，pH，温度，时间，封闭
第四节
步骤
实验要点
样品pI的查阅或测定
选PBE，PB和起始缓冲液 装柱，平衡 安装仪器（增pH计）
加PB少量入柱
加样
加PB洗脱 再生 PBE 洗脱液 脱PB
一、PBE，PB和起始缓冲液的选择 ⑴. 查pI或测定 ⑵. 由pI确定pH梯度范围 最大范围 3～3.5
为提高Rs,选择的pH范围应含要分离样品pI， 并使其有2/3～1/2的柱长的吸附解吸时间。
㈠. ㈡. ㈢.
二、 加样吸附 样品平衡（透析或SephadexG-25） 样品体积Vs（一般＜5%） 若结合紧密，Vs可较大；不紧，Vs要小 洗去非吸附物（10Vt始缓洗）
三、洗脱（以S不变性为前提） 类专一：选择性洗脱、有分级分离要求、 梯度或阶式洗脱。
高专一： 专一洗脱、无分级分离要求、单成分洗脱 ㈠. pH变化（破坏静电引力） ㈡. I变化 （减弱静电引力、范德华力） ㈢. 亲和洗脱 L的类似物L′，S的类似物S′ *采用酶促反应的多元专一性洗脱 ㈣. 表面活性剂 减少疏水作用、范德华力 种类常有：曲通X100 1%（V/V）、乙二醇等
㈢.由产品性能表选择 ⑴. PBE94 ⑵.选始缓冲液pH9.4，乙醇胺-HAC （0.025） ⑶.选PB96 用HCl调pH7.0
二、装柱
㈠.PBE量
由样品量确定PBE量 一般100mgpr/10ml床体积、每pH单位 ㈡.柱选择 H/D=30～60 ㈢.充填（同前） ㈣.平衡 用始缓平衡，要求： ⑴.缓冲液使用前应先脱气，以除去其中CO2 ⑵.需平衡到进出液pH、I、电导都一样。 ㈤.校验 柱装好坏，用有色的牛细胞色素C检查。
造成滞后洗脱 pI时S ，往往需更低pH时， 其S ，才被洗
第五节
技术的应用
1. 蛋白质类（包括酶）的分离 2. 蛋白质类（包括酶）等电点测定
P175-177
第七章
亲和色谱
Affinity Chromatography, AC 第一节 概述
原理 利用生物体中许多高分子化合物具有和 某些相对应的分子可逆结合的特性建立的 色谱法。 一、特点 高效、高收率、有浓缩效应，使用局限性
例：酶 有单底物反应、双底物反应
单 E
A EA
P
E
EP
底物A、产物P或它们的类似物都可以
双底物依次
E
A
B
P Q
E EPQ EQ
EA EAB
须选择A、若选B则吸附时须加A
双底物随机
A（B） B（A） P（Q） Q（P） E E EA EA（B） EPQ
A、B都可选择 对A、B的选择仅取决于它们亲和势的 大小和固定化的难易程度。
㈡.流速 一般线速在30～40cm/hr ㈢.检测 主要是目的物浓度、pH 五、PB的除去 1.沉淀法：加硫铵，再透析 2.凝胶过滤：常用Sephadex G-75
六、再生 一般：①.先除去吸附的杂质 对pI＜6，在柱顶，可用1mol/LNaCl 对pI很小，可用0.1mol/LHCl ②.用起始缓冲液平衡 七、保存 24%乙醇
装柱
安装仪器
平衡（2～3Vt） 加样吸附 洗去非吸附物
亲和柱
再生
洗脱液
脱盐
一、亲和吸附柱的预备
㈠. 亲和吸附剂选择或制备 效能小试： 据资料等先选择始缓冲液种类、I、pH、t ①. 用10Vt始缓洗，若目的物未流出，说明吸 附性能好，α＞0.9 ②. 不断加样到目的物流出，确定吸附容量 ㈡. 柱 H/D 高度专一 短 类专一 长 平衡 一般2～3Vt始缓
第三节 亲和层析载体
一、作为载体的条件 1.亲水 2.惰性 3.具有活化基团 4.大网孔 5.机械性能好
二、载体的选择
1.琼脂糖凝胶： 亲水性强，理化性质稳定 （商品名：Sepharose） 2.聚丙烯酰胺凝胶： 理化性质稳定，耐有机溶剂及去污 剂， 抗微生物能力强， 特别适应用配基与提取物亲和力 比较弱的物质。 3.葡聚糖凝胶： 有良好的化学及物理性质，孔径小。 4.纤维素： 非特异吸附严重，廉价，易得。 5.多孔玻璃 ：物理性能好，有非特异性吸附。
其他亲和吸附剂
聚丙烯酰胺载体的亲和吸附剂可用戊二醛 法和肼解法活化,然后再将含氨基的配体固 定到其活化基团上;
硅胶和多孔玻璃载体的亲和吸附剂最常用 的修饰方法就是进行硅烷化处理,从而给载 体引入氨基或环氧基团.
第五节 一般实验方法
是否有类专一吸附剂 有 溶胀Gel 无 选L
选偶联Gel 偶联L
第六章 色谱(层析）聚焦 Chromatofocusing
第一节 概述 据生物分子pI的不同，在动相中动速不同 进行分离（适于水溶性的两性分子）
特点：
⑴.自动形成pH梯度，不需特殊实验装置； ⑵.蛋白质聚焦自身pI范围，有浓缩效应， 峰宽达0.04-0.05pH单位，分辨率很高。
第三节
PB与PBE
㈡
环氧活化型Sepharose
环氧氯丙烷法的特点： 活化效率低，速度慢，重复性较差 毒性低，可引入亲水手臂，易操作
㈢
氨基琼脂糖
㈣ 羧基琼脂糖
五、类专一性亲和吸附剂
固定化凝集素（本质是蛋白质） 可用来分离糖、糖蛋白 如…… ㈡. 固定化多聚核苷酸 可用来分离NA、核蛋白 如…… ㈢. 染料亲和吸附剂 以染料为配基，用来分离酶类、干扰素等 ㈠.
㈤. 解离试剂 主要破坏氢键，如尿素、盐酸胍等 ㈥. 降低温度t 较高t吸附、较低t洗脱、减少疏水力 ㈦. 电泳解吸 + 在柱两端连上电极进行电泳
四、脱盐 五、再生
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*采用酶促反应的多元专一性洗脱
1. 三元复合物 两元专一性 负洗脱 E + A EA + B EAB A AE A -A洗脱 A 2. 三元复合物 三元专一性 正洗脱 E + A EA + B EAB + A +C洗脱 C AE A EAC A C EAC