ABI_3730xl测序仪简介-01
ABI3730xl型测序仪日常维护标准操作规程(SOP)
检查胶瓶中的胶以确认有足够的胶完成实验
每天或每次实验前
检查泵胶块和下胶块以确认其未松动
每天
清洁仪器表面、实验台表面
每天
检查毛细管旋钮，连接管螺帽和阀门以防止泄露
每天
每星期
维护工作
频率
使用Change Polymer向导换胶
每星期或需要时
检查旧毛细管的储存条件
每星期
使用注射器抽取20ml去离子水，清洗泵头的密封圈
每次实验前
更换溶液槽中的Buffer和水，确认槽的外围是干燥的
每48小时或每20个runs
更换water和waste溶液槽中的水，确认槽的外围是干燥的
每天或每20个runs
检查泵上下block、连接管、胶管和各通道中是否有气泡，使用Bubble Remove向导除去气泡
每天或每次实验前
检查毛细管的取样末端以确认其未损坏
每星期
使用去离子水浸泡胶垫，用自来水冲洗后再用去离子水洗一遍
每星期或需要时
每月
维护工作
频率
运行Water Wash向导，不管有无气泡，冲洗毛细管端口
每月或需要时
检查旧毛细管的储存条件
每月或需要时
每年
维护工作
频率
对机器内部进行除尘清洁，光路校正等整体保养
每年或需要时
需要时
维工作
频率
清洁漏液托盘
需要时
更换毛细管
需要时
去除毛细管末端已经干掉的胶，使用双蒸水湿润的无纤维布
需要时
使用无屑的棉球沾上无水乙醇轻轻擦拭毛细管检查窗口两端
每季度或空间、光谱校正时
ABI3730xl型测序仪日常维护标准操作规程(SOP)
3730测序结果说明
测序结果说明1.测序完成后，我们用对每个样品提供一份测序报告，其中包括：测出的序列彩色峰图（请用Chromas软件打开）序列文件拼接后结果（需要测通的样品）2.在进行DNA测序时，紧接引物的10~30碱基有时不一定能完全读清楚。
3.正常情况下，3730测序仪保证800bp的有效长度，但是有时由于DNA结构上的原因，有时会出现反应中断无法进行的情况。
如：G/C rich；G/C Cluster；Poly A/T/C/G的连续结构等。
此外，另一种情况为反应中途出现的套峰现象，此种情况一般为DNA结构中的重复序列，造成测序用引物和模板之间有两个以上结合位点。
以上情况是由于DNA结构原因造成了无法正常进行DNA测序，对这种情况，我们会根据具体测序结果进行相应收费。
出现以上情况后，我们提倡从另一端进行测序，或者用高级试剂盒进行测序。
4.备注说明一般正常的菌液和质粒自收样日至发送报告日周期为二--三天，PCR产物（纯化及未纯化）为三--四天。
对于三个工作日内无法得到满意测序结果的，我们会用E-mail或电话与客户或代理商联系。
并不是所有的样品都能得到满意的测序结果，对于测序结果不好的，我们会尽力找到可能的原因，以建议进一步如何操作。
测序常见问题解答Q1.为什么提供新鲜的菌液？如何提供新鲜的菌液？A1.首先，新鲜的菌液易于培养，可以获得更多的DNA，同时最大限度地保证菌种的纯度。
如果您提供新鲜菌液，用封口膜封口以免泄露；也可以将培养好的4~5ml菌液离心沉淀下来，倒去上清液以方便邮寄。
同时邮寄时最好用盒子以免邮寄过程中造成离心管挤压破裂。
Q2.DNA测序样品用什么溶液溶解比较好?A2.溶解DNA测序样品时，用灭菌蒸馏水溶解最好。
DNA的测序反应也是Taq酶的聚合反应，需要一个最佳的酶反应条件。
如果DNA用缓冲液溶解后，在进行测序反应时，DNA溶液中的缓冲液组份会影响测序反应的体系条件，造成Taq酶的聚合性能下降。
3730测序流程
能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；
蛋白质与染色体DNA不复性而呈絮状，通过离心可
沉淀下来
碱裂法提取质粒操作步骤
菌体的培养
（挑单克隆或加少量菌液在含抗生素的培养基中，37℃震荡过夜培养
菌体的收集
（13000rpm离心1min，使菌体充分沉淀，弃上清）
质粒提取步骤一： 加入200ul I液 ，充分振荡,直到管底无沉菌为止 • 溶液I的组分：1.0M Tris-HCl / 0.5M EDTA， pH8.0，用前按比例加入RNase酶 • 溶液I的作用：菌体悬浮 • EDTA是在溶液I中主要起抑制DNase的作用 。 • 如果缺了溶液I，我们也可以用等体积的水或 LB培养基来悬浮菌体。 • 特别注意：菌体一定要悬浮均匀，不能有结 块。
五 上机操作
ABI 3730xl 自动测序仪外观图
胶泵
废液槽 POP7胶瓶 阳极缓冲液瓶 CCD检测窗口 缓冲液槽 水槽
96个样品自动进样及一体化16板自动进样样品架
已跑完板子放这 待上机样品放这
六 测序结果的分析处理
3730xl Sequence Map
测序结果峰图文件
Thanks!
ABI BigDye 3.1的组成成分
• • • • • • 测序酶 脱氧的dNTP 双脱氧的dNTP(荧光标记) Mg2+ ddH2O buffter
DNA测序模板用量
PCR产物
100-200 bp 200-500 bp 500-1000 bp 1000-2000 bp 2000 bp 1- 3 ng 3-10 ng 5-20 ng 10-40 ng 20-50 ng
RNase酶未加或失活
质粒提取步骤二： 加入300ul II液， 轻柔颠倒5~10次。 • 溶液II的组分： 0.4 N NaOH / 2% SDS； 两种溶 液等体积混合后使用 ，必须现用现配 • 溶液II的作用：裂解作用 • 溶液II在天气冷时会产生絮状沉淀，可温水预热 至沉淀消除。 • SDS是离子型表面活性剂。它主要作用是： a.溶解细胞膜上的脂质与蛋 白，从而破坏细胞膜。 b.解聚细胞中的核蛋白。 c.能使蛋白质变性而沉淀下来。
ABI公司相关仪器简介
• 触摸屏
• 多种规格：
样品基座升降温速度3.9℃5 ℃ /s
见微知著 去伪存真
60-Well 96-Well & 96-Well Fast 384-Well
Genetic Analyzer
• 1986年全球第一台测序仪370 373 377 310（1996年，第一台毛细管） 3100-avant, 3100 3130, 3130xl （中、高通量） 3730， 3730xl（生产规模）
见微知著 去伪存真
7500 Real-Time PCR System
见微知著 去伪存真
• 五色荧光技术 • 新型光路设计检测更
多荧光标记FAM™/SYBR®
Green I, VIC®/JOE, NED™/ TAMRA™/ Cy3®, ROX™/Texas
Red®,和Cy5®
• 96-well • Standard-小于2hs
降温速度4.1℃/s
• 9700技术
• 2h 25min • 26*52*30，12kg • GeneAmp 快速PCR
通用试剂&96孔快速 反应板
见微知著 去伪存真
Veriti TM Thermal Cycler
• PCR仪的革新
• 9700 & VeriFlex TM Blocks——6个独立的温 度模块
见微知著 去伪存真
Thank You！
见微知著 去伪存真
见微知著 去伪存真
2720 Thermal Cycler
样品基座升降温速度 2.7℃/s
• 9700技术
• 价格优惠
• 小巧21*36*22，6.1kg， 散热装置在仪器后面
• 可计算Tm值，确定引物 的退火温度
DNA第一代,第二代,第三代测序的介绍
原理是：核酸模板在DNA聚合酶、引物、4 种单脱氧核苷三磷酸 ( d NTP，其中的一种用放射性P32标记 )存在条件下复制时，在四管反应系统中分别按比例引入4种双脱氧核苷三磷酸 ( dd NTP )，因为双脱氧核苷没有3’-O H，所以只要双脱氧核苷掺入链的末端，该链就停止延长，若链端掺入单脱氧核苷，链就可以继续延长。
如此每管反应体系中便合成以各自的双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。
反应终止后，分4个泳道进行凝胶电泳，分离长短不一的核酸片段，长度相邻的片段相差一个碱基。
经过放射自显影后，根据片段3’端的双脱氧核苷，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。
Sanger法因操作简便，得到广泛的应用。
后来在此基础上发展出多种DNA 测序技术，其中最重要的是荧光自动测序技术。
荧光自动测序技术荧光自动测序技术基于Sanger 原理，用荧光标记代替同位素标记，并用成像系统自动检测，从而大大提高了D NA测序的速度和准确性。
20世纪80 年代初Jorgenson 和 Lukacs提出了毛细管电泳技术( c a p il l ar y el ect r ophor es i s )。
1992 年美国的Mathies实验室首先提出阵列毛细管电泳 ( c a p il l ar y ar r a y el ectr ophor es i s ) 新方法，并采用激光聚焦荧光扫描检测装置，25只毛细管并列电泳，每只毛细管在内可读出350 bp，DNA 序列,分析效率可达6 000 bp/h。
1995年Woolley研究组用该技术进行测序研究，使用四色荧光标记法，每个毛细管长，在9min内可读取150个碱基，准确率约 97 % 。
目前, 应用最广泛的应用生物系统公司 ( ABI ) 37 30 系列自动测序仪即是基于毛细管电泳和荧光标记技术的D NA测序仪。
如ABI3730XL 测序仪拥有 96 道毛细管, 4 种双脱氧核苷酸的碱基分别用不同的荧光标记, 在通过毛细管时不同长度的 DNA 片段上的 4 种荧光基团被激光激发, 发出不同颜色的荧光, 被 CCD 检测系统识别, 并直接翻译成 DNA 序列。
Sanger测序流程
③测序反应板离心后，每个反应孔加入EDTA-Na2溶液2.5μl，85%乙醇40μl，充分震荡3min，离心3000g，4℃，30min（EDTA作为金属离子螯合剂, 能与测序PCR反应体系中的离子结合从而去除离子）。
④离心结束后将测序反应板倒置于吸水纸上，倒离心至离心力达到185g（或900rpm）时立即停止。
⑤每孔加入70%乙醇50μl，充分震荡1min，离心3000g，4℃，15min（DNA片段在70%的乙醇中溶解度低, 能通过离心沉淀下来）。
⑥重复4步骤。
⑦避光风干15~30min，每孔加入10μl HIDI（变性处理，生物安全柜中进行），离心后在PCR仪中96℃反应2min，降温至4℃后取出。
6、上机测序变性结束后，上测序仪（ABI 3730）进行测序。
1.创建样品板程序①选择GA Instruments > ga3730 > Plate Manager；②点击New按钮，弹出的New Plate Dialog窗口中填写相应的内容（在ID和Name空白栏中输入样品板的名字; 在Application中选择相应的测序程序; 在Plate Type中选择96或者384孔板; 在Scheduling中定义取样顺序; 在Plate Sealing中选择Septa; 在Owner Name、Operator Name中输入操作者。
③点击“OK”按钮; 在弹出的Sequencing Analysis Plate Editor窗口中, 填入相关的内容（在Sample Name中填入样品名, 96孔板在A01行填写“1”，384孔板依次在A01、B01、A02、B02行写1、2、3、4；在Results Group 1栏中选择数据上传路径; 在Instrument Protocol 1栏中选择测序程序; 在Analysis Protocol 1栏中选择数据分析程序）。
④然后全选A01行，点击Edit > Fill Down Special, 选中Fill Down Special (96 Cap), 将自动生成96行; 如果是384孔板, 依次全选A01、A02、B01、B02行，重复4次操作, 点击“OK”。
3730中文说明书
指示灯 绿灯长亮
操作 继续实验
绿灯闪烁 仪器与电脑无法联机
黄灯长亮
仪器下载 firmware 仪器自检 加热炉门打开 前门打开 缓冲液槽未安装 毛细管未安装 开门状态下进行向导 操作 故障
黄灯闪烁
红灯长亮
确认已进入 WIN2000 界面 确认网线连接正确 确认前门关闭 确认各溶液槽位置正确 确认 3730User 的帐号和密码正确 确认前门，加热炉门已关闭 确认毛细管和缓冲液槽已安装
如果有胶冲入阳极缓冲 液杯中请更换缓冲液
ABI Prism® 3730 简明使用手册
用无纤维纸擦干
2.毛细管空间定位 ( Spatial Calibration )
什么是毛细管空间定位？
毛细管空间定位程序把每道毛细管的荧光信号落在CCD上的位置标记出来，从而使DC软件能 够找到这些信号。
何时作毛细管空间定位？
5.激发和检测
当标记有荧光素的DNA片断移动到检测窗口时，荧光素受到激光束的激发而产生荧光信号， 此荧光信号被CCD检测器所检测并被转化为电信号传递到计算机。
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ABI Prism® 3730 简明使用手册
6.数据采集和处理
CCD检测器把检测到的荧光信号转换为电信号，并把它传送给安装了Data Collection软件 的计算机工站。工作站接收到信号后，用预先设置好的方式进行初步处理，并把这些数据 存贮在计算机的数据库里。
固定器 橡胶垫 槽盖 溶液槽 基座 电源线 （仅限于缓冲液槽）
注意： 溶液槽组装好后，请仔 细检查，橡胶垫是否平 整；槽盖的橡皮垫圈安 装正确；固定器和橡胶 垫的孔已对齐 1X缓冲液在2～8度可放 置1个月，室温可放置1 星期 每48小时请更换缓冲液
法医DNA实验室及仪器简介
驱动电机、调速器、 定时系统 制冷系统 速度辅助 密度成型器 抽真空系统
铝合金——甩平式& 铝合金&钛合金—— 高强度钛合金
角式
角式
硬质玻璃、硬塑料、 具盖聚乙烯硬塑料制 具盖聚乙烯硬塑料制
不锈钢
品
品
各式离心管
玻璃离心管 PA管 PP管 PC管 CN管
微型离心机
微型低速离心机 —— 4,000rpm-6,000rpm —— 6×1.5ml、0.5ml、0.2ml
分析超速离心机
70,000rpm 具有紫外、干涉光两种检测器 绝对/相对分子量测定、样品纯度/浓度测定，分子的聚合/解离分析，
热动力学和流体力学参数确定，核酸/蛋白/病毒测定与分析
制备超速离心机
40,000rpm-100,000rpm
容量大
用于分离制备线粒体、溶酶体， 病毒，具有生物活性的核酸、 酶等生物大分子。
Pop4&Pop6 96-& 384- 两支注射器
Pop4&Pop6 96-& 384- 两支注射器
Pop4 &6 &7
Pop4 &6 &7
Pop7
96-& 384- 胶瓶 96-& 384- 胶瓶 96-& 384- 胶瓶
Pop7
96-& 384- 胶瓶
移液器
德国Eppendrof
法国Gilson
法医DNA实验室及仪器简介
于丹
法医物证学任务 ——个体识别 ——亲权鉴定
法医物证学研究方法：化学、物理、形态学、免疫血清学、 生物化学、分子生物学、遗传学等等。
法医DNA实验室中的重要仪器 ——离心机 ——PCR仪 ——遗传分析仪 ——移液器
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基因分型
2008年基因分型样本量为30000个； STR,SNP,CNV遗传标记
ABI 3730xl测பைடு நூலகம்仪简介
生物医学研究院 5楼 联系电话：54237651 联系人：夏明英，李士林
主要特性（一）
- 内置一体化自动进样器及样品孔打孔装置； - 内置样品板条形码自动识别； - 100次（9600个样品）运行试剂一次上机； - 自动碱基识别与质量评分判定； - 动态铂金内镀毛细管壁；
12406G
4833T 10646G 4491C
7028T
12705T 14569G
5301T 15607A 9824A 5178A
4715T 5417G 3010T 4216T 663A 11719A
3730xl的总结
基因检测：
2008年对4万个样本进行测序
检测碱基数达到2千4百万个
现可检测的PCR产物长度为600-1000bp
- 氩离子激光光源； 实现实时的、空间连续的测量；可以保证返回的光信息能够达到探测的量级。 激发波长为488nm和514.5nm
毛细管规格: 96道毛细管 毛细管长度: 50cm 凝胶的规格: POP-7液体分离胶
配套的试剂: 基因测序(BigDye3.1v和5×Sequence buffer)
1000样本
10小时
测序的原理
DNA测序的双脱氧链末端合成终止法. Sanger法测序的原理：
用DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物，直到掺入一种链终 止核苷酸为止。 每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱 氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸 (ddNTP)。 由于ddNTP缺乏延伸所需要的3‘-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地 在G、A、T或C处终止，终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种 dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱 基的链终止产物。 它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率 变性凝胶电泳分离大小不同的片段进行检测。
SNP遗传标记在SnapSHot反应的结果
原理： 单碱基延伸,单碱基测序.利用延伸引物对PCR产物进行单个碱基的延伸,并引 入尾部的荧光.其荧光的颜色及其荧光出现的位置进行区分其基因型 SnapSHot技术优点： 可以研究样本量少,snp位点多,位点间物理距离较远的SNP检测.
13010G
13263A
主要用途（三）
1、原始数据分析 数据收集软件 （随机配置） Data Collection v3.0 Auto-analysis with GeneMapper® v4.0
Seqencing analysing® v5.2
2、基因测序及分型的运行时间 96样本 1小时40分钟 (3130xl需要6个小时)
基因分型(Liz120, Liz500, ROX500)
主要特性（二）
- 高质量测序结果 • 电泳温度70°，去除二级结构的影响； • 新型Pop-7分离胶，可测900-1100碱基测序长度; • 新型碱基识别与质量评分软件，提高测序准确性; - 最高灵敏度的光路系统 • 毛细管内荧光检测 • 后置超薄CCD检测系统 • 双光束双侧激光激发，荧光信号强度高度均一 • 高灵敏度提高检测DNA的浓度范围 - 超低成本测序平台 • 高灵敏度减少DNA和测序试剂的使用量。 • 胶使用量比3700少30倍 • 高成功率及长读结果减少非电泳相关的整体项目成本 • 更高的自动化减少劳力成本及人为失误的成本
Liz500：FAM(蓝色), VIC (绿色), NED (红色), HEX(黑色) Liz120；ROX500(FAM,JOE,NED,PET) 2、目的片断的大小. Liz500(35-500bp), Liz120(15-120bp)
STR遗传标记基因分型
CNV遗传标记在MLPA反应的结果
不同测序片段分析
200-250bp（36cm）
300-350bp（36cm）
500-650bp(36cm)
不同测序片段分析
150bp-300bp(50cm)
STR遗传标记的测序结果
AC
具有Ploy-A的片段序列
A
基因分型
原理:在一端引物上标记特定的荧光,通过PCR产物长度大小， 检测基因型. 内标选择: 1、荧光.(引物上物加的荧光的类型)