病原生物学与免疫学实验

病原生物学与免疫学实 验
2020年7月21日星期二
病原生物学与免疫学实验室规则
微生物学实验室是进行微生物培养鉴 定及试验的场所，是一个微生物高度 集中的区域，为了防止微生物感染人 体及扩散，保证安全及每次实验结果 的准确性，要求同学遵守下列规则：
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一般注意事项
进实验室穿上实习衣，离室时脱下，要反 折，并经常进清洗。
点（pH 2～3）比阴性菌（pH4～5） 为低，—般染色时溶液的酸碱度约在 pH 7左右，电离后阳性菌带有的阴电 荷比阴性菌多。因此，摄取的碱性染 料亦较多，不易脱色。
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2.通透性学说：
革兰氏阳性菌细胞膜的通透性比阴 性菌低，进入细胞的染料和碘液结 合生成沉淀，脱色剂较易通过革兰 氏阴性菌的细胞膜，将碘和染料的 复合物溶解洗出，故易脱色；阳性 菌细胞膜透通性低，故不易脱色。
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•产芽•芽孢胞细菌的种类
•芽孢 • 菌体 • （营养细胞）
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鞭毛
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荚膜的观察：
特殊染色
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负染色
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三、细菌标本染色检查染料都是中性有机盐。据着色基的 不同可分为以下类型：
碱性染料（basic dye）—带正电染料。其阳
离子部分为发色基团，可与细胞中带负电的组 分结合。
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四、细菌动力检查法
鞭毛是细菌的运动器官，有鞭毛的细菌 ，具有运动的能力，能定向地由一个部 位泳动到另一个部位。许多杆菌和螺菌 或弧菌具有鞭毛，细菌的运动力是细菌 特征之一，所以检查细菌的动力可以鉴 别细菌。
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检查细菌动力的方法 悬滴法 、 压滴法、 暗视野显微镜法、 半固体琼脂培养法等。
书包、衣物等勿带入实验室，必要的文具 、实验指导，笔记等带入后，也要远离操 作部位。
实验室内要保持安静，有秩序，不得高声 谈笑，或随便走动以免影响他人实验。
实验室内禁止饮食、吸烟和用嘴湿润铅笔 或标签等，也不要以手抚摸头部等部位。
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做练习要保持无菌操作操作。以防止临床 标本及纯培养物的污染，
酸性染料（Acid dye）—带负电染料。其阴
离子部分为发色基团，可与细胞中带正电的组 分结合。
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细菌染色法:
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负染色
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简单染色
•制备涂片标本→染色
• 水洗、吸干
•镜检
•染色1min
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（一）细菌涂片的制备
一般制备涂片包括涂片、干燥、固定三步。
涂片
干燥
固定
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固定的目的：
使细菌的细胞凝固，使菌体与玻片粘 得更牢固；
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1.悬滴法（示教）
【材料】 菌种：变形杆菌、葡萄球菌的幼龄（8-12小时）
肉汤培养液。 凹玻片、盖玻片、凡士林。 【方法】 悬滴法见图1-6
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2.压滴法
【材料】 菌种：变形杆菌、葡萄球菌的幼龄（8-12小时）
肉汤培养液。 盖玻片、载玻片、镊子。 【方法】
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五、示教操作 细菌涂片的制备 革兰氏染色法的步骤 接种环、接种针的使用（图1-4） 菌液采取法
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一、普通光学显微镜的使用
显微镜的构造图 显微镜的使用方法 油镜头的辨认 显微镜的维护
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油镜加香柏油的原理
玻璃折射率：
n=1.52
香柏油折射率：
n=1.515
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二、细菌基本形态和特殊结构的观察
使用显微镜的油镜观察各示教片，比 较各菌的形态、大小、排列等；注意 芽胞在菌体上的位置、大小；鞭毛形 态、数最及其位置；荚膜的大小及其 与菌体的关系，将观察结果画在实验 报告上。
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•细胞壁与革兰氏染色
•甲 菌
•乙菌
•初染 •结晶紫
•媒染
•碘 液
•脱色 •乙醇
•紫色（G＋）
•复染
•沙 黄
•红色（G）
•革兰氏染色步骤示意图
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3.化学学说：
革兰氏阳性菌细胞内含有某种特殊化 学成份，一般认为是核糖核酸镁盐与 多糖的复合物，它能和料染一煤染剂 复合物相互结合，使已着色的细菌不 易脱色。
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接种环（上）和接种针（下）
•2— 5mm
•柄约22cm
•5—
•金属柄约
8cm
14.5cm
•绝缘柄 •约7.5cm
•安装环(针)的螺口(约8mm)
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菌液采取法图1-5
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后，斜持玻片，使酒精流去，再加酒精。如此重 复2～3次，直至流下的酒精无色或稍呈淡紫色时 为止（约30秒钟）。水洗，甩干。 复染：以稀释石炭酸复红染液复染1分钟后，水 洗，待干或用吸水纸印干，油镜镜检。
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革兰氏染色法
•由丹麦医生Hans Christian Gram于1884年创立
•。【操作步骤】
离开实验室前，应在消毒液中将手浸泡5 ～10分钟，再用清水洗净。
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发生意外事故的处理
皮肤破伤：用生理盐水洗净后，涂以2％红 汞或2％碘酒。
烧伤：涂以凡士林油，5％鞣酸或2％苦味 酸。
化学药品腐蚀伤：若为强酸，先用大量清 水冲洗，再以5％碳酸氢钠或5％氢氧化铵 溶液中和之；强碱腐蚀则先以大量清水冲 洗后，再以5％醋酸或5％硼酸洗涤中和。
可改变菌体对染料的通透性； 加热固定可杀死细菌，比较安全。
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多种标本涂片标记示意图
如多种标本，可用蜡笔在玻片上划为数格 ，并于玻片的背面，标明标本的编号。
• 正面
•反面 •
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㈡革兰氏染色法（Gram Stain）
初染：滴加结晶紫染液于涂片上，染1分钟，水 洗，甩干。
媒染：加卢戈氏碘液，1分钟后水洗，甩干。 脱色：加95％酒精数滴于涂片上，频频摇3～5秒
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1.细菌的三种基本形态（示教）
球菌：链球菌、葡萄球菌。 杆菌：大肠杆菌。 螺形菌：霍乱弧菌。 上述示教镜各一台/每室
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细菌的三种基本形态示意图
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•⊕
葡萄球菌：
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•Figure 1 - A Gram stain of Gram + Staphylococcus cells.
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•链球菌
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吸入病原菌菌液：应立即吐人容器内消毒 ，并用1∶1000高锰酸钾溶液或3％双氧水 漱口。
菌液流洒桌面，倾倒适量消毒液于污染面 浸泡半小时后抹去，再以清水擦洗干净。
严防火灾：试验完毕立即关闭电闸，煤气 阀门，如系酒精，乙醚、汽油等火种，切忌用
水，可撒泼大量沙土等扑灭火苗。
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实验一 细菌的形态学
•涂片固定
•结晶紫初染
•碘液媒染
•乙醇脱色
•复红复染
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【结果】
细菌被染成紫色者，称为革兰氏阳性菌； 而细菌染成红色者，称为革兰氏阴性菌；
•阳性菌——紫 色 •阴性菌——红 色
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【意义】
鉴别细菌，用本法染色可将细菌分成两大类。 了解致病性 指导选择用药
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【革兰氏染色法的原理 】
有三种学说。 1.等电点学说：革兰氏阳性细菌的等电
吸过菌液的吸管、毛细吸管，要投入含有 2～3％来苏儿或0.1％新洁而灭液的玻璃 筒中，其它带菌材料放在指定地点，以防 止微生物污染环境。
若发生吸入菌液，割破手指等事故，应立 即报告老师，进行预防处理。
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爱护公物，节约使用实验材料、器材，如 损坏公物，应立即向指导教师报告，登记 处理。
实验完毕，应及时清理实验室，做好卫生 ，关好门、窗、水笼头、电灯。
•链球菌（显微镜下示意图）
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•杆菌(bacillus)
•Figure 2 - Gram stain of Gram - E. coli cells
•显微镜下的杆菌
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弧菌
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2.细菌的特殊结构观察（示教）
芽胞示教片：破伤风杆菌。 鞭毛示教片：变形杆菌。 荚膜示教片：肺炎双球菌。
上述示教镜各一台/每室
第一周
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实验内容
普通光学显微镜的使用 细菌基本形态和特殊结构的观察 细菌标本染色检查法
（革兰氏染色法） 细菌动力检查法 （悬滴法、压滴法）
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目的要求
了解细菌的基本形态及其特殊结构。 基本掌握显微镜的使用和保养。 掌握接种环的使用及菌液的采取法。 掌握细菌涂片的制备及革兰氏染色方
法。 熟悉细菌动力检查法。