基因工程期末复习考点.doc
Marshall W. Nirenberg Har G. Khorana
t
信使RNA 麟密码
t
DNA
浙江万里学院基因工程期末复习考点
第一章绪论
1. 分子生物学与基因工程发展的代表性事件：（客观题） 1928年,Griffith 实验——肺炎双球菌体内转化实验，证明了转化因子（DNA ）是遗传物质,
没有得出蛋白质与遗传物质的关系
1944年，Avery 实验——体外转化实验，证实了蛋白质不是遗传物质。
1952年，Hershey-Chase 实验一一利用放射性同位素标记大肠杆菌T2噬菌体的捣碎实验证 明
了遗传物质是DNA,而不是蛋白质。
1953年，沃森和克里克发现了 DNA 双螺旋的结构，开启了分子生物学时代。威尔金斯富
兰克林（填空）
1958年，Matthew Meselson Franklin Stahl 采用氯化艳密度梯度离心法验证DNA 复制的半
保留复制
Robert W. Holley 1965年破译了所有氨基酸的密码子
2. 镰刀型贫血：氨基酸突变血红蛋白亚基N 端的第六个氨基酸残基是缴氨酸（val ）,而
不是下正常的谷氨酸残基（Glu ）。
t
t
GAA
GUA
t t
C T T 值出| C AT “A A\ 反rpj A A A A ■ ' — ■ A 」A GAA 突变 G TA
嫌刀型细胞贫血控必因的图解
3. 胰岛素（公司+事件）
1921年，加拿大科学家Banting 和Best 发现胰岛素，是糖尿病治疗史上的里程碑 1922年，开始用于糖尿病的治疗
胰岛素发现四人组”：Banting 、Best 、科利普和麦克莱德
1922年5月，多伦多大学与礼来公司（EliLilly and Company ）it 成协议，由科学家们帮助礼来 开展胰
岛素的规模生产。因苏林：第一支商业化胰岛素的诞生
1982年5月14 口，礼来向美国FDA 提交了生物合成人胰岛素NDA18-790的申请 1982年10月28日，FDA 发布了批准书，第一支基因重组人胰岛素正式上市 1997年，第一支基因重组人胰岛素进入中国
Sanger 测序法：蛋白质的结构和功能是由氨基酸序列所决定的
中国科学家的贡献：人工合成牛胰岛素
1973年，斯坦福大学的Stanley Cohen 和加州大学旧金山分校的Herbert Boyer 合作发表了一 篇学术论文
一一重组DNA 技术
4.1990年，美国批准了第一例临床基因治疗申请，患者为四岁女孩Ashanti de Silva,由于 缺乏腺苜脱氢酶ADA 基因而患有严重综合性免疫缺陷症，研究者W.F. Anderson 将ADA 基因 导入患者的淋巴细胞，然后
将经改造的淋巴细胞回输到患者体内，取得了成功。
5.HIV被治愈唯一成功的例子：柏林病人
Endonucleas e
Bam HI ECO RI Hind III Hae III PstJ Q |QATC C CCTAG I —? 8 CCTAG GATCC G "Sticky- ends GjAATTC
CTTAAG —? Ki CTTAA AATTC G “Sticky” ends AAGCTT TTCGAlA
v *
—? M TTCGA AGCTT
A "Sticky” ends G CC GG
c(M Blunt C GG
CC
GG
ends
CTGCAG GACGTC —?
CTGCA
G G ACGTC “Sticky” ends CCCGGG
ccc GGG
6.基因编辑技术：ZFN 锌指核糖核酸酶、TALEN 转录激活因子样效应物核酸酶、CRISPR/Cas9
第二章基因操作的工具酶
L 限制性核酸内切酶的作用：
能在特异位点（酶切位点）上催化双链DNA 分子的断裂，产生相应的限制性DNA 片段 切割不同来源的DNA 分子将产生特征性限制性酶切图谱，具有重大应用价值（分子手术刀）
2.
细菌细胞内特异性降解外源核酸分子的核酸酶，其作用特点是：（知道）
特异性降解异源DNA 分子（甲基化修饰差异）
I 类限制酶随机切割双链DNA 分子，II 类限制酶识别、切割特殊的回文（对称）序列 3. 核酸工具酶分类：核酸水解酶类：核酸内切酶、核酸外切酶
（填空） 核酸合成酶类：DNA 聚合酶、RNA 聚合酶、DNA 连接酶
核酸修饰酶类：甲基化酶、核甘酸激酶、核昔酸转移酶、磷酸酶
4.5
6. 一种限制酶只能识别一种特定的核昔酸序列，并在特定的切割点上将DNA 分子切断
7. 分子剪刀——限制性内切酶
%1 分布：主要在微生物中
%1 作用特点：专一性：一种限制酶只能识别一种特定的核苻酸序列，并且能在特定的切点
上切割DNA 分子
多样性：限制酶有200多种
%1 结果：产生黏性末端或平末端（填空）
8. 判断粘性还是平末端
DNA sequence Cleavage products
9 .限制性内切核酸酶和甲基化酶一起称为限制一修饰系统
5' ： | | [ "AA丁TC
EcoRI IE CO RI
. 「' —1 「
1限制:作用|修饰作用］
S' [ | 5f/XAT TC I I | i | 3" 5’ yr I n I I^A A J" TC—rrT-rr S'
3。「TAA5* 3'(3 1J JJJ 5> 3, Il 山 1 [5 T? ViG、n【’’ 3,
EcoRI
T1
10.内切核酸酶分为三类：即I型、II型、HI型酶，通常所用的限制性内切核酸酶是指II型表2.1限制性内切核酸酶类型及主要特性
特性I型11型皿型
限制和修饰活性双功能的酶核酸内切酶和
甲基化酶分开
双功能的酵
桐市rfq Z￥ T K H
3种不同的亚基单一亚基两种不同的亚基限制作用所需的辅助因
子
ATP、Mg2*Mg2*ATP、Mg2 +特异性识别位点非对称序列回文对称结构非对称序列
切割位点在距识别位点至少lOOObp 的
地方随机的切割
位于识别位点上
距识别位点下游24~
26bp 处
序列特异的切割不是是是
在基因工程中的应用无用广泛使用用处不大11.采用Smith和Athens提议的方案，根据限制性内切核酸酶来源和菌株命名（选择判断）
a)
b)
c)
d)
e) Eg.
Hind 用来源细菌的英文缩写斜体符号命名
它的第一个字母大写，来源细菌属名的第1个字母
第二、三字母小写，来源细菌种名的头2个字母
第四个字母代表菌株
最后用罗马字母表示同一菌株中不同限制酶的编号
III代表从流感噬血杆菌（Haemophilus influenzae） d株中分离到的第3个限制酶
12.不同限制性内切酶切割的三种结果：（填空）
a.产生5'突出粘性末端cohesive end (EcoR I)
5 ' ------- G|AATT C ---- 3' 5 ' -------------------------- p OH AATTC --------------- 3'
3 ' —-C TT叫G一-5' EcoR I 3 ' —- TTA&H pG---5'
b.产生3'突出粘性末端（Pst I> Bam H I ）
c.产生平末端blunt end （Nru I）
13.同尾酶（判断题）BamH I和Bglll, Sal I和Xho I
14.限制性内切核酸酶Hpall和Mspl是同位酶，切割同样的DNA序列CCGG,但对这个序列的甲基
化状态有不同的限制性反应
Mspl切割所有状态下的CCGG序列，而Hpall仅切割非甲基化的CCGG序列。这样Mspl被用来识别所有的CCGG序列，而Hpall能用来确定是否甲基化
15.影响内切酶酶切反应的条件（简答，如何调整）
%1温度：一般37°C
%1盐离子浓度：Na+, Mg2 +
%1缓冲体系：具有稳定pH环境的Tris-HCI缓冲体系，DTT用于保持酶稳定性和活性
%1反应体积和甘油浓度：商品化的限制性内切核酸酶均加50%甘油作为保护剂，一般在-20°C保存。酶切反应时，加酶的体积一般不超过总反应的10%,否则甘油浓度过高，影响
酶切反应
%1反应时间：通常为lh；（不超过4h,否则产生非特异性结合，HF-高保真酶）进行大
量DNA酶切反应时一般让酶解过夜
%1DNA纯度和结构：一个酶单位定义：lh内完全酶解lMgX噬菌体DNA所需的酶量DNA样品中所含的蛋白质、有机溶剂、RNA等杂质会影响酶切反应的速度和完全程度；酶切的底
物一般为双链DNA, DNA的甲基化位置（用甲基化酶切割）会影响酶切反应评估DNA是否满足酶切条件：跑胶看下面有没有亮条带
酶切反应注意事项：价格昂贵；决不能用水稀释，以免变性失活；预先加入除酶以外的所有其他试剂；取酶立即放于冰上。分装小份避免反复冻融；使用无菌的新吸头；少加
水，使体积最小，但保证酶液体积不超过总体积的10%,否则酶液中的甘油会
抑制酶活性
16.“星”活性产生非特异性切割
17.DNA连接酶：催化DNA上裂口两侧（相邻）核苜酸裸露的3'羟基和5’磷酸之间形成共
价结合的磷酸二酯键（梯子的扶手），不是狙键（梯子的踏板）），使断开的
DNA裂口连接起来（填空）
结果：使粘性末端（平末端）连接起来，粘性末端效率高（判断题）
18.DNA连接酶的作用过程（简答）
1）连接酶与辅助因子ATP或NAD +形成酶-AMP复合物
2）AMP作用于DNA缺口的5'-末端磷酸基团
3）缺曰3' -0H对活跃的磷原子作亲核攻击，形成新的磷酸二酯键，封闭切口
19.DNA连接酶的反应条件
连接反应的温度是影响转化效率的最重要参数。多数内切酶产生的粘性末端的Tm值在15°C 以下，然而保持连接酶活性的最佳反应温度却是37°C但在该温度下，粘性末端之间的氢键结合是不稳定的，因此最适温度是粘性末端的Tm值和连接酶最适温度的折衷，所以连接反应一般采用16°C过夜
20.平末端DNA片段的连接（了解，客观）
a）直接用T4DNA连接酶连接：效率不高，较少采用
b）同聚物连接平末端DNA片段：先用末端核昔酸转移酶，给平末端DNA分子加上同聚物尾巴后再用DNA连接酶进行连接
1)
2) 3) c ）用衔接物连接平末端DNA 分子：目的是在平末端分子上构建限制性核酸内切酶酶切 位点，
经酶切后产生特异的粘性末端，从而与具有互补末端的DNA 连接
21. 重组DNA 实验的一般程序（掌握）
选用一
种对载体DNA 只具唯一限制识别位点的限制酶（如EcoRI ）作位点特异的切割， 形成全长的具粘性末端的线性DNA 分子
再将外源DNA 片段也用同一种酶作相同的消化
混合，加入DNA 连接酶。由于具有相同的（如EcoR I ）粘性末端，能退火形成双链结 合体。其中
单链缺口经DNA 连接酶封闭之后，便产生稳定的杂种DNA 分子
22. 碱性磷酸酶（修饰酶）：预先处理质粒载体，防止环化（知道）
功能：催化去除DNA 、RNA 、rNTP 和dNTP 上的5'端磷酸基团，从DNA 片段上除去5' 磷酸以防
自身连接
用途：在用Y-P32磷酸和多核昔酸激酶在5'端标记DNA 或RNA 之前，进行碱性磷酸酶 处理；
在DNA 连接之前常用它处理克隆载体以防止载体自身连接。
23. 磷酸激酶（了解）
对核酸末端羟基进行磷酸化的酶，用途：①放射性标记DNA 链的5 '末端，探针标记；② Maxam-Gilbert 化学法的DNA 序列分析；使缺少5'磷酸的DNA 片段和合成接头磷酸化 特性：①该酶很难纯
化，酶制品经常不纯；②铉离子是该酶的强烈抑制剂；③低浓度的磷酸 也可抑制该酶活性
24. 末端脱氧核昔酸转移酶（了解用途）
来源：小牛胸腺
功能：在一定条件下，催化将一个一个的脱氧核昔酸，沿着5'
3'加到DNA 链
的3' -0H 末端。该过程不需要DNA 模板，对双链、单链DNA 都适用。经常用 于人工
粘性末端的构建
25. 甲基化酶（了解）
甲基化：能识别限制酶识别的序列，识别顺序中的某个碱基发生甲基化（常见使限制酶识别 序列
中的C 或A 甲基化修饰），属修饰酶类。经修饰的DNA 不再被限制酶降解
细胞的限制一修饰系统中的修饰作用是由甲基化酶（methylase ）来完成的。甲基化酶 同限制性内切酶具有完全相同的识别顺序
真核生物中目前只发现5甲基胞H 密嚏（M5C ）
第三章载体
1. 载体：携带目的基因进入宿主细胞进行复制、扩增和表达的工具称载体（Vector ）;即用于克 隆、
运载和转移目的基因并能自我复制的DNA 分子。
2. 质粒：是细菌细胞内独立于细菌染色体而自然存在的、能自我复制、易分离和导入的环状 双链DNA 分子。
3. 噬菌体载体：为线性双链DNA 分子，全长48.5kb, DNA 两端各有一个互补单链的抽性 末端,能通
过碱基互补作用形成环状DNA 分子。粘性末端形成的双链区域称为cos 位点， 它是包装蛋白的识别位点。
4. 粘粒：又叫柯斯质粒（Cosmid ）载体，是指带有粘性末端位点的质粒。它是一种由人工构建 的
含有X 噬菌体DNA 的cos 位点和质粒复制子的特殊类型的杂和质粒载体，在结构组成上 具有噬菌体的特性，也具有质粒载体的特性和高容量的克隆能力，一般可插入35~40kb 的外 源基因。是构建真核生物基因文库的主要载体
5.人工染色体载体：利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体。主要有酵母人工染色体（YAC）及细菌人工染色体（BAC）o
6.细菌人工染色体（BAC）：是基于大肠杆菌的F质粒构建的高容量低拷贝质粒载体。
7.酵母人工染色体（YAC）：载体是利用酿酒酵母染色体的复制元件构建的载体。是最早构建成功的人工染色体克隆载体。
8.报告基因：在转基因的研究中，常常在载体上重组选择标记基因，通常称为报告基因，在一定的选择压力情况下，利用报告基因在宿主细胞内的表达，达到筛选转化子的目的。
9.载体按作用分类：克隆载体，表达载体，穿梭载体。
10.各种DNA载体比较（掌握）
11.质粒载体的修饰改造（了解）：
%1去掉不必要的DNA区域，只保留质粒复制必须部分，以提高外源DNA装载量
%1减少质粒内限制性内切酶位点，质粒酶切位点过多，给克隆外源DNA造成不便
%1加入选择性标记：通过质粒间的重组使质粒携带合适标记，常用的有抗生素抗性标记。
如：氨茉青霉素抗性标记、四环素抗性标记、卡那霉素抗性标记等
%1安全性能改造：不能随便转移，以免污染环境
%1改造或增加基因表达的调控序列：比如加入强启动子
12.发展概况（看一下即可）
第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSClOl, colEl, pCR, pBR313 和
pBR322
第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体
第三阶段：完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含
T3, T7, sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体
13.pBR322
分子量小（4.3kb）、拷贝数高、含四环素和氨茉青霉素两种抗生素抗性基因作为选择标记、对多种常见的限制性内切核酸酶仅有一个切割位点。
14.pUC载体的三个显著特点：
（1）分子量更小，仅为2.7KB,容纳外源DNA量增大；具有更高的拷贝数（每个细胞含500-700
个拷贝）
（2）含易于检测是否有外源DNA插入的标记基因LacZa,可利用互补原理进行蓝白筛选
（3）多克隆位点区（MCS）由人工合成的多个单一酶切位点构成
其MCS区与M13mp噬菌体载体的相同，可使pUC上克隆的目的基因直接转移到M13mp载体，进行DNA测序和体外突变等研究。
15 .蓝白斑筛选原理：
pUC18/pUC19上含有一个LacZ基因的调控序列和编码3 -半乳糖昔酶N端146个氨基酸的序列（? ?互补肽）的DNA序列（标记为lacZ'）,多克隆位点就存在于lacZ'上，B .半乳糖甘酶的C ■半乳糖
昔酶）结合才会形成一个有活性的0 ■半乳糖昔酶。（这种机制称为a ■互补作用）X-gal作为P ■半乳糖昔能的指示剂。在诱导物IPTG存在下，8 ■半乳糖昔酶催化X-gal形成蓝色化合物，导致菌落呈现蓝色。在多克隆位点中插入外源DNA,打断半乳糖昔酶的部分基因，不再产生。.肽链，就不能和宿主细胞产生的多肽片段结合生成有活性的8 .半乳糖昔酶，结果X-gal保持无色，菌落呈白色。
16.噬菌体载体:入噬菌体可以容纳较大的目的基因。例如用置换法可去掉长达20kb的XDNA, 换入相应长度的目的基因。基因文库构建常使用X载体。
17.入噬菌体入侵E.coli后，可选择进入裂解生长状态（烈性噬菌体）或溶源状态（温和噬菌体）。在进入溶源状态时，环状的A噬菌体基因组DNA与宿主DNA在附着位点上发生联会、断开、交换并重新组合，整个XDNA整合到宿主的染色体DNA±成为原噬菌体。这种情况下，只有cl 基因得以编码表达阻遏蛋白，其可以使参与溶菌周期活动的所有基因失去活性。故不会繁殖裂解细菌。
18.入噬菌体从溶原转为裂解是一种可诱导过程，诱导的因素可能很多，实验室常用的是热诱导:在低温时（30°C）建立溶原，用高温（4200则出现裂解，这种方法称为热诱导表达，使用的是温敏开关。
19.XDNA载体的构建：1.缩短长度；2.删除重复的酶切口；3.加装选择标记。
20.X噬菌体载体分类：
%1插入型载体：仅有一个可供外源DNA插入的克隆位点，如人gt系列。
%1替换型载体：具有两个对应的酶切克隆位点，如Charon4. EMBL4、EMBL3。
21.表达载体特点：①具有克隆载体所具有的基本特性；②具有可被宿主细胞识别的基因表达调控元件：启动子，核糖体结合位点，转录终止序列。
22.原核生物表达载体三个重要原件：夏制原点、多克隆位点、终止子。
23.启动子：大肠杆菌表达载体中常用的启动子：
（1） trp-lac jn动子（又称tac启动子）
tac启动子是一种人工构建的双杂合启动子，由trp启动子、lac操纵子的操纵基因和SD 序列融合而成。受lac阻遏蛋白的抑制，异丙基硫代半乳糖甘的诱导表达。
（2 PL启动子
特点：受温度的控制，低温（37°C）下被阻遏而抑制，高温（42°C）下去阻遏而激活
（3） T7噬菌体启动子
24.SD序列称为核糖体结合位点。
25.高效表达策略：
SD序列域密码子的距离
原核序列融合表达（密码子优化）
减轻宿主代谢负担：生长于表达阶段分开，蛋白分泌
26.原核表达系统：大肠杆菌、枯草芽艳杆菌等。
27.穿梭载体：能在两种不同的生物中复制的载体，能在原核和真核生物中笈制。（通常穿梭载体在细菌中用于克隆和扩增克隆基因，在真核细胞中用于基因表达分析）
28.真核表达载体启动子：
诱导型：
AOX：醇氧化酶（最强启动子）
MOX：醇氧化能
PHO:温度诱导（23度表达）
GAL （半乳糖诱导）
组成型：
GAP （甘油醛.3.磷酸脱氢酶）
TEF1 （延长因子）
ADH （乙醇脱知酶）
29.酵母表达系统：酿酒酵母，甲醇酵母，克鲁维酵母，汉逊酵母
30.酿酒酵母：
1安全性
2遗传背景清楚
3 DNA导入方便
4易于高密度发酵
5翻译后修饰
甲醇毕赤酵母：
1生长迅速
2pAOXl强启动子
3可诱导表达
31.分泌信号肽：
MF?a ：性结合因子，含88个氨基酸，效率高。
PHO5：酸性磷酸酯酶
SUC2：蔗糖酶
KIL：杀手毒素因子
保守性低，通常不能再宿主间通用
32.翻译后糖基化修饰：
Asn?X?Ser/Thr N.糖基化：天门冬酰胺上的酰胺氮进行糖基化
O-糖基化：苏/丝氨酸上的羟基氧进行糖基化（甘露糖）
33.hisL Mut+：
his4■:组敏酸缺陷型；
Mut+：有pAOXI, pAOX II 启动子；
Muf：无pAOX I, pAOX II 启动子；
Mut s：只有pAOX II启动子。
34.重组方式：
整合方式1：插入。如AOX位点、His4位点插入；
整合方式2：发生多次重组；
整合方式3：替换。
35.真核表达策略
%1提高转录水平（启动子）；%1信号肽；
%1
基因剂量（基因拷贝数）；
%1整合位点；
%1发酵条件（培养基成分、pH、溶氧、消泡等）：
%1表达产物的稳定性（蛋白酶缺陷菌株、降低pH、竞争性抑制）。
36.昆虫植物等表达载体（了解）
自己了解一下PPT,内容太多就不详细列出，看着心烦。
Ti质粒：Ti质粒具有五个主要功能区域:T-DNA、质粒转移、冠瘦碱代谢（opine catabolism）复制原点（ori）和毒性区域（vir）。T-DNA中直接参与转移并整合到植物染色体上的序列，仅是T-DNA 两端与其它序列交界处的25bp不完全直接重复，右端的序列称为右界（RB）,左端的为左界
（LB）o T-DNA区域内的所有基因与转移无关，所以将致瘤基因全部缺失后，将其它序列插入到这个区域，形成的T-DNA仍可将RB至LB内的序列转移并整合到植物基因组Vir区的毒性基因是T-DNA转移所必需的。
第四章分子克隆
早期基因分离方法中利用理化方法分离基因：密度梯度超速离心法（了解）
2逆转录法的过程（知道）
分离和纯化目的基因mRNA,反转录成cDNA,其程序：
①总RNA的提取：选择富含某种特异mRNA的组织细胞
细胞内RNA的组成和含量：
DNA95%核内5%细胞器
RNA10%核内15%细胞器75%细胞质
80-85% rRNA10-15% tRNA1-5% mRNA
b.真核细胞mRNA的特点及分离纯化方法
3'端具多聚A尾端序列，可利用多聚T为引物与其配对
1分子克隆的路线
1.获取外源DNA片段
2.外源DNA与载体连接
3.重组载体导入寄主细胞
选择与鉴定克隆重组子
%1mRNA的分离与纯化
a.poly（A）RNA 的分离：柱层析
b.
mRNA的分级：密度梯度离心或电泳
%1mRNA转译活性的鉴定：通过转译系统检测基因产物
%1逆转录合成双链cDNA
cDNA第一链的合成：一次好的逆转录反应可使寡聚（dT）选出的mRNA有5—30%被拷贝
cDNA第二链的合成
%1cDNA克隆，将重组体导入细菌细胞
注：没有多聚A尾端序列的RNA分子，可用寡聚六甘酸（hexamer）为引物合成第一条链
3文库构建（知道）
基因组文库的构建
1.供体生物基因组DNA的制备，尽量提取大分子量的比较纯合的基因组DNA
2.限制性核酸内切酶部分酶切后，分离选择具有一定长度（15-20kb）的DNA片段
3.在体外将代表该生物完整基因组的所有DNA片段与合适的载体连接成重组分子
4.根据所用载体，选择相应的宿主细胞（大肠杆菌）
5.导入受体细胞
1.分离细胞总RNA,然后利用真核mRNA分子的如端多聚A结构将mRNA从tRNA和rRNA 中分离出来
2.以mRNA为模板逆转录合成cDNA第一条链
3.合成cDNA第二条链有两种方法:一是用大肠杆菌的RNaseH切割RNA-DNA杂交分子产生RNA短片段，DNA聚合酶I以RNA短片段为引物合成新的DNA链;二是利用cDNA第一链的
3,端出现的发夹环结构，即第一链末端返折为合成cDNA第二条链提供引物
4.这些体外合成的cDNA经两端补齐后而具平头末端，在cDNA分子的两端与带有限制性核酸内切酶位点的人工接头连接，然后酶切后与载体（通常是入噬菌体）连接，导入大肠杆菌，即得cDNA文库河
晓中朋&
L
仲！I I
R
cDNA文库构建
（判断）理想的基因组文库应包括全部的基因组序列，每一个克隆包括的DNA片段越大，则总克隆数日就可以越少，因此，构建核基因库时常要选择能接受较大片段的载体
检测构建的基因组文库是否包括一个完整的基因组序列,可用下面的公式计算：
如人类基因组DNA全长为3.0xl06kb,以X EMBL作载体，插入片段的平均长度为17 kb,
P为99%时构建的基因库应有8.1x105个重组噬菌体
4热激转化法的影响因素：（客观题）
载体：载体性质、空间结构、分子大小等
受体细胞
转化过程
5电激转化法相比于热激转化法的优势
%1操作简便、效率高
%1适用于各种细胞
%1可转移大于100Kb的质粒DNA
6基因枪转化技术（判断）
基因枪技术，又称为生物弹道技术或微粒轰击技术，是用火药爆炸或者高压气体加速将
包裹了DNA的球状金粉或者鸨粉颗粒直接送入完整的组织或者细胞中的一种技术。
其基本原理就是采用一种微粒加速装置，使裹着外源基因的微米级的金或钙颗粒获得足够的动量打入靶细胞或组织
已广泛用于转化水稻、小麦、玉米、大豆等主要作物
7重组子直接筛选（了解）
1.表型特征筛选（遗传检测法）
A.抗药性标志选择:常用的质粒抗性基因有氨羊青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素
B.标志补救（表达产物与营养缺陷互补）
C.蓝白斑筛选（a—互补）
2.基因水平检测
D.限制性酶切图谱:凝胶电泳法筛选
E.PCR法筛选
F.核酸分子杂交:原位杂交，南杂交等
第五章常用基因工程技术
一、凝胶电泳（看分离工程也行的）
1.1含义：用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶等作为支持介质的一种区带电泳方法。
1.2分离原理
DNA分子在高于等电点的pH值溶液中带负电荷，在电场中向阳极移动。
「电荷效应：DNA本身电荷数迁移率- DNA所带电荷数越多，分子量越小, 越接近球形，迁移率
越大。
分子筛效应：DNA的分子大小和构型
1.3检测原理
漠化乙锭（EB）在紫外光照射下发射荧光。用EB对DNA样品染色时，会插入DNA 分子的碱基对中形成荧光结合物。荧光的强度同DNA片段的大小（或数量）成正比。
1.4影响凝胶电泳的因素
（1）DNA本身
（2）凝胶类型和浓度
琼脂糖凝胶电泳能分辨率为0.1-60kb,适用于鉴定大分子DNA片段，
聚丙烯酰胺凝胶分辨率为0.001-lkb,适用于鉴定蛋白质及小分子核酸，
琼脂糖浓度越低，大DNA片段分辨越清楚，反之，小DNA片段越清楚；
（3）缓冲液
常用pH在8.0左右，离子强度为0.02.0.05。
常用TBE （硼酸缓冲液）和TAE （醋酸缓冲液），TBE缓冲能力大。
对高分子量的DNA, TAE的分辨率高，而对低分子量的DNA, TAE分辨率较低。
（4）电压
用琼脂糖凝胶电泳测定DNA分子大小时，应尽量减少电荷效应，使分子的迁移速度主要决定于凝胶受阻滞的程度，这样DNA片断的迁移率则与电压成正比，DNA片段能得到很好的分辨
（5）电泳时间：时间不宜过长，否则会出现扩散现象，影响观察效果。
二、杂交技术
核酸分子杂交：是指来源不同的具有互补序列的两条核酸单链，在一定条件下，按碱基配对原则结合成杂化双链的过程。杂交的双方分别称为探针和待测核酸。
2.1探针于探针标记
探针：能与核酸分子中特定片段互补结合并带有能检测标记物的已知核酸序列。
探针标记：使探针带上可检测标记物的过程。
2.2Southern 杂交
概念：根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段，这种实验方法叫做DNA印迹杂交技术，即Southern blotting0（ 1975年,E. Southern）
实验步骤：
（一）待测DNA样品的制备：1、提取待测DNA； 2、限制酶消化DNA
（二）电泳分离酶切DNA片段：琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳
（三）凝胶中核酸变性：
1、碱变性剂处理电泳后琼脂胶，将胶上DNA分子变成单链
2、酸中和处理
（四）Southern 转膜
平铺在已用电泳缓冲液饱和的两张滤纸上，在凝胶上部覆盖-张硝酸纤维膜（常用的固
相支持物：硝酸纤维素膜，尼龙膜，化学活化膜、滤纸等），接着加一叠干滤纸，再压上一重物。由于干滤纸的吸引作用，凝胶中的单链DNA随电泳缓冲液一起转移（毛细管虹吸法）。DNA 分子同硝酸纤维素滤膜接触后就束缚在上面，严格按照在凝胶中的谱带模式，原样地被吸印到滤膜上，8CTC烘烤l-2hr, DNA片段稳定地固定在硝酸纤维膜上
（五）制备探针
（六）Southern 杂交
1、预杂交：将转印后的载体膜置于预杂交液中，预杂交液不含探针，主要成分为商品化的
牛血清等，这些大分子可非特异性与载体膜空白部位结合，降低探针在膜上的非特异性结
合
2、杂交：再将滤膜放到加有放射性同位素标记探针的溶液中进行核酸杂交。这些探针与其
中某些被吸印的DNA序列互补，一旦同滤膜上的单链DNA杂交之后，就较难解链。因此可以漂洗去掉游离的没有杂交上的探针分子
（七）杂交结果的检测
1、放射性自显影：用X光底片曝光后所得的放射自显影图片，同漠化乙锭染色的凝胶谱带
作对照比较，便可鉴定出究竟哪一条片段是同探针的核昔酸序列同源的
2、非放射性标记物显色
标记物除了放射性核素标记物（32P、35S、3H）夕卜，还有非核素标记物，半抗原、生物素、荧光素、化学发光探针等。例如荧光素可在激发光下显示荧光标记。
2.3Northern 杂交
概念：根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的单链RNA片段转移并结合在适当的滤膜上，通过同标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用检测被转移的DNA片段。
实验步骤：
（一）待测RNA样品的制备：1、提取待测RNA； 2、纯化
（二）变性电泳：
RNA虽为单链，但分子中存在二级结构，必须除去，采用RNA变性电泳方法，在分离RNA的同时消除二级结构，且保证RNA按照分子大小分离。
RNA变性电泳方法：甲醛变性电泳、敖甲基汞变泳、乙二醛变性电泳
（三）转膜和杂交方法同Southtem
2.4Western 杂交
概念：SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，再将蛋白质从凝胶转移到一种固相支持物（硝酸纤维膜上），通过抗体与附着于固相支持物上的靶蛋白所呈现的抗原抗体特异性反应进行检测，是一种检测蛋白质的免疫化学方法
实验步骤：
1）电泳后，小心剥下凝胶，60V湿转lh,将蛋白转移到NC膜（0.45 gm）上；若是PDVF 膜，转之前用甲醇，转之后需水或TBST润洗
2）加入封闭液，4°C封闭过夜；
3）将膜用封闭液稀释8000倍的6xHis抗体（鼠抗，1 mg/ml）在摇床上室温杂交1 h；
4）用TBST清洗三次，每次10 min；
5）将膜用辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体（1： 5000）在摇床上室温
杂交1 h；
6）用TBST清洗三次，每次10 min；
7）加入1 ml HRP-TMB显色剂，避光显色2-5 min。
下瓣,概
niniinniiinnniinioiiini
nnm
三、PCR 技术：在体外通过酶促反应有选择地大量扩增（包括分离）一段目的基因的技术
PCR ：聚合酶链式反应，在试管中，利用DNA 聚合酶、一对引物和四种dNTP,对模 板DNA 反复多
次地进行复制，从而得到大量扩增特定产物的反应过程，称为PCR
1985 年,K.Mullis 3.1 PCR 原理
模拟DNA 的天然复制过程，由变性一复性一延伸三个基本反应步骤构成：
根据目的DNA 片段两端的碱基序列，合成两个不同的寡聚核昔酸引物，它们分别与 DNA 的两条链互补配对。
将适量的寡聚核昔酸引物与4种脱氧核糖核昔三磷酸（dNTP ）、DNA 聚合酶及含有目 的DNA 的模板DNA 分子混合，经过高温变性（使DNA 双链解开）、低温复性（使引物与 模板附着）和中温延伸（合成新的DNA 片段）三个阶段的一次循环，DNA 的量即可以增 加1倍，则30次循环后，DNA 的量增加23°倍
3.2 PCR 三个阶段
（1） 模板DNA 的变性：模板DNA 双链或经PCR 扩增形成的双链DNA 经加热至94°C 一 定时间后，解离变性成单链，以便与引物结合；
（2）
模板DNA 与引物的复性：温度降至55C 左右，等于或小于引物Tm 时，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合；
（3）
引物的延伸：DNA 模板一引物结合物在TaqDNA 聚合酶（Mg?+存在）作用下，以4
种dNTP 为反应原料，目的DNA 序列为模板，按碱基配对与半保留复制原则，从引 物3,端催化复制链以5, 一3,方向延伸,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留 复制链。重复循环变性一复性一延伸，就可获得更多的半保留复制链，而这种新链又 可成为下次循环的模板。
3.3 PCR 必需组分（要素）
模板DNA, —对寡核昔酸引物，4种dNTP, Taq DAN 聚合酶，带有Mg?+的缓冲液
3.3.1 DNA 模板
模板可以是基因组DNA 、质粒DNA 、噬菌体DNA 、扩增后的DNA 、cDNA 等 含有靶序列的DNA 可以单链或双链形式加入PCR 混合液
通常小片段模板DNA 的PCR 反应效率要高于大分子DNA,因此PCR 反应前用机械剪 切或用稀有限制性酶解基因组DNA,以提高产率
3.3.2引物
PCR 扩增引物是指与待扩增的目的DNA 区段两 端序列互 补的人工合成寡核昔
酸，通常由15-25个核苜酸构成。包括上 游引物1和下游引物2。这两种引物在模板DNA 上结合点之 间的距离决定了扩增片段的R 度 引物设计原则：
1） G+C 含量45-55%,四种碱基随机分布，避免5个以上喋吟或嗜呢成串排列 2） 引物长度：15-25个核昔酸 3） 引物扩增跨度:300-500bp
4）退火温度Tm 值高于55°C, Tm=4（G+C）+2（A+T）
5）引物3'端的几个碱基，要严格要求配对
6）两个引物之间和引物自身不应有互补序列
7）避免引物内部出现二级结构
8）引物特异性
9）引物中加上合适的酶切位点
10）引物3、端碱基以G或C为好，引物5、端可修饰
兼并引物：即一类由多种核昔酸组成的混合物，彼此之间有一个或者数个核昔酸的差异，比如在通过氨基酸序列推测引物的时候，就需要合成兼并引物。
3.3.3dNTP混合液
4 种dNTP 即dATP、dCTP、dGTP、dTTP
dNTP浓度过高可加快反应速度，但会增加碱基的错误掺入率，适当的低浓度会提高反应的精确度，常用浓度2.5mmol/L
3.3.4Taq DNA 聚合酶
早期PCR反应用的是DNA聚合酶I的Klenow片段
缺点：①热敏感：变性温度下失活，每一轮都要人工补充新的酶；
%1其最适温度是37C,这种低温易引起DNA引物与模板序列间形成非专一的碱基错配，降低PCR产物的特异性。
Taq DNA聚合酶
Taq聚合酶是我国台湾科学家钱嘉韵（Chien）女士，在美国黄石国家森林公园火山温泉中所分离，钱嘉韵是第一个报道分离耐高温DNA聚合酶工作的。
嗜热水生菌（简称Taq）生活在75"C的温泉中，它的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）的最适反应温度是72C,并且在94°C也相当稳定耐热。催化活性有：聚合活性、5、一3、外切核酸酶活性（但缺3、一5、外切核酸酶活性）、逆转录酶活性、末端转移酶活性Taq DNA聚合酶的特点：
（1）能以高温变性的目的DNA为模板从分别结合在扩增区段两端的引物为起点，按5'.3' 方向合成新生的互补链DNA。
（2）最适温度72°C,且连续保温30min仍具有很高的活性，在比较宽的温度范围内都保持催化能力。因此，Taq聚合酶提高了反应的特异性和敏感性。只需在反应开始时，加一次就能在整个扩增循环中保持活性。这样就可通过编程控制PCR循环仪的反应温度和时间，使PCR完全自动化。
（3）出错概率：1/2X104,对分子克隆实验有影响。
3.3.5反应缓冲液
（1）Tris-HCl维持反应体系的pH；
（2）KC1有利于引物的复性；
（3）明胶可保护酶不变性失活；
（4）Mg?*能影响Taq DNA聚合酶的活性，显著影响PCR的产量及产物特异性，过高则易出现非特异性扩增，过低则酶活性显著下降。
3.3.6温度及循环参数
（1）变性温度一般为94°C。时间取决于DNA的复杂性，一般30s或Imin。温度过高、时间过长会降低Taq DNA聚合酶的活性
(2)支性温度一般55-80°C 30s或Imin。由Tm=4(G+C) + 2(A+T)计算得到延伸温度选在70-
75°C, Taq DNA聚合酶活性最高。时间根据扩增片段的长度而决定，一般Ikb以内延伸
Imin
(3)PCR的循环次数取决于模板DNA的浓度，一般20-30次。循环次数越多，非特异性产物也越多
3.4 PCR技术操作过程
(1)将10XPCR缓冲液、上游引物、下游引物、模板DNA和4dNTP混合液加入0.5mL 塑料管中，加
灭菌水至适当的反应体系
(2)将上述液体混合，短暂离心后置95°C加热变性5min；接着加入适量Taq DNA聚合酶，混匀。
再加入两三滴液体矿物油，覆盖在反应液上，以防蒸发
(3)再短暂离心后，将反应管置PCR仪中按下列程序作热循环
反应变性复性聚合周期
194C 5nin55C Inin721 Inin1
2941 Inin55C Inin72X2 Imin25-30
394P Inin551 Inin72X? lOmin1
(4)反应结束后，样品可于4°C保存
(5)最后，取适量反应液置琼脂糖凝胶电泳，经溟化乙锭染色后在紫外灯下观察结果，PCR 产物应为
一条明显的、单一的荧光带(实验中应设不加模板DNA的阴性对照和含目的序列DNA的阳性对照)
注意事项：1、防污染(1)设置不同的操作区(2)分装试剂(3)严格操作过程
2、设对照(1)阳性对照(2)阴性对照(3)试剂对照
四、PCR技术的扩展
4.1反转录PCR (RT-PCR)
含义：反转录PCR即以mRNA作为模板，进行
反转录合成cDNA的PCR方法。
步骤：其样品模板为mRNA。一般分两步进行:
第一步用反转录酶将RNA反转录成cDNA,
第二步以cDNA为模板进行PCR扩增。
目前己发现一种rTth酶，既有反转录酶活性又
有DNA聚合酶活性。因此做RT-PCR可简单到
用一种酶和一种缓冲体系在一个反应管内直接扩
增RNA
4.2巢式PCR
巢式PCR是指用两对引物先后扩增同一样品的方法。
先用一对外侧引物扩增含目的基因的大片段DNA,再用一对内侧引物以大片段DNA为模板扩增目的基因
优点：较常规PCR灵敏度大大提高，同时第二次扩增乂可鉴定第一次扩增产物的特异性用于临床检验(如血清中丙型肝炎的检测)
4.3多重PCR
在反应中用多组引物同时扩增基本称多重PCR
扬州大学基因工程期末试题复习要点整理
基因工程期末试题复习要点整理 基因工程是70年代出现的一门科学，是生物学最具生命力和最引人注目的前沿科学之一，是现代生物技术的代表，是生命科学类专业中的一门重要的专业课。本课程主要介绍基因工程概述、重组DNA基本技术及原理、基因克隆、基因的分离及鉴定、基因工程的表达系统、基因工程的应用等。通过本课程的学习，使学生掌握基因工程技术的基本原理和了解该技术在动物、植物和微生物等方面的应用，为今后从事生物学教学、生物技术研究和产品开发，或进一步的研究生学习科研打下坚实的理论及专业基础。扬州大学试题纸 一、名词解释：共10题，每题2分，共20分。 1. 基因: 是DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。 2. 定位克隆: 获取基因在染色体上的位置信息，然后采用各种方法对该基因进行定位和克隆 3. 融合基因: 是指应用DNA体外重组技术构建的一类具有来自两个或两个以上的不同基因核苷酸序列的新型基因。 4. 转化子: 导入外源DNA后获得了新遗传标志的细菌细胞或其他受体细胞，又称重组体。 5. 人工接头：是人工合成的具有一个或数个特定限制性内切酶识别和切割序列的双股平端DNA短序列。 6. RT-PCR: 是指以mRNA在反转录酶作用下合成cDNA第一链为模板进行的PCR。 7. ORF : 起始于AUG、止于UAA、UGA、UAG的连续的密码子区域，是潜在的编码区。 8. MCS: 指载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制核酸内切酶的酶切位点的DNA片段。 9. gene targeting : 基因工程中利用活细胞染色体DNA可与外源DNA的同源性DNA序列发生重组的性质，来进行定点修饰改造染色体上某一目的基因的技术 10. 5’RACE: 是一种通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术，是以mRNA为模板反转录成cDNA第一链后用PCR技术扩增出某个特异位点到5’端之间未知序列的方法。 四、简答题：共4题，共20分。 1．简述获得目的基因常用的几种方法。（5分）
最新基因工程笔记总结
第二章Enzymes 第四节DNA连接酶Ligase 一、DNA连接酶的发现 二. 连接条件 必须是两条双链DNA。 DNA3’端有游离的-OH，5’端有一个磷酸基团（P）。需要能量。 三、连接反应的机理 1、A TP（NAD+)提供激活的AMP。 2、A TP与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合物，并释放出焦磷酸PPi。 3、AMP 与连接酶的赖氨酸-氨基相连。 4、AMP 随后从连接酶的赖氨酸-氨基转移到DNA 一条链的5’端P上，形成“DNA-腺苷酸”复合物。 5、3’-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出AMP。 Ligase：只连“Nick切口”，不连“Gap缺口” 四. 两种DNA连接酶 1. E. Coli DNA ligase 来源：E.coli 适用：粘性末端（PEG与高浓度一价阳离子存在可连平末端） 2. T4 ligase 来源：T4 phage 适用：粘性末端及平末端 T4 vs. E.coli T4 DNA ligase制备容易，价格便宜，能进行各种类型连接反应，应用更广泛！ 五.Ligase的反应温度 最佳温度： 界于酶作用速率和末端结合速率之间，一般认为是4-15℃比较合适。 六. DNA分子连接的四种形式 1. 粘性末端； 2. 平末端； 3. 平末端加尾； 4. 平末端加衔接物(linker)或接头(adaptor) (1)Digestion and Ligation 1．粘性末端连接 Problem: (自我环化作用) 解决方法：a、双酶切（两种内切酶）b、去磷酸 2.平末端连接 粘性末端连接效率高于平末端约100倍！ 解决方法：化平末端为粘性末端 3. 平末端连接---同聚物加尾法（1）末端脱氧核苷酸转移酶 功能：5’至3’单链聚合 作用特点：单链；无模版 作用机理： a: 用5’-特异的核酸外切酶处理DNA分子，以便移去少数几个末端核苷酸, 获得3’-OH的单链延伸末端。 b: 加入dA TP/dTTP和末端脱氧核苷酸转移酶组成的反应混合物中，DNA分子的3-OH末端将会出现单纯由poly(dA)和poly(dT)组成的DNA单链延伸。 c: 获得poly(dA)和poly(dT)尾巴，就会彼此连接起来。缺点： 当poly(dA)，Poly(dT)不严格等长时,重组DNA分子会有缺口。 需要用DNA聚合酶I填补，然后用DNA连接酶连接最后的缺口。 4. 平末端连接 ---衔接物连接法与接头连接法 (1) 平末端的衔接物连接法 衔接物的5’末端和待克隆的DNA片段的5’-末端，用多核苷酸激酶处理使之磷酸化。通过T4 DNA连接酶的作用使两者连接起来。用适当的限制酶消化具衔接物的DNA分子和克隆载体分子。 (2) 平末端的接头连接法 将具有某种限制性酶(BamHI)粘性末端的典型DNA 接头分子与平末端的DNA片段连接后，后者变成具有粘性末端的DNA分子。 七.热稳定的DNA连接酶——来自嗜热高温放线菌 热稳定的DNA连接酶的应用： 寡核苷酸连接测定法（oligonucleotide ligation assay, OLA） 连接酶链式反应（ligation chain reaction, LCR） 寡核苷酸连接测定法的作用 检测突变 寡核苷酸连接测定法的作用：检测突变。 1. 寡核苷酸连接测定法 （1）原理: 两条寡聚核苷酸探针分子，同一种与之互补变性的靶DNA之间的杂交作用,这两条寡聚核苷酸探针分子在靶DNA分子上的位置是彼此相邻的。 当他们同靶DNA链是完全碱基配对时，便可以被连接酶连接起来。 结合点或靠近结合点处存在和靶DNA错配的碱基两个探针之间不能形成磷酸二脂键。 精品文档
基因工程知识点梳理
生物选修3知识点 专题1 基因工程 基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过，赋予生物以，创造出。基因工程是在 上进行设计和施工的，又叫做。 （一）基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”—— （1）来源：主要是从中分离纯化出来的。 （2）功能：能够识别的核苷酸序列，并且使每一条链中的两个核苷酸之间的断开，因此具有。（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式： 和。 2.“分子缝合针”—— (1)两种DNA连接酶（）的比较： ①相同点：都缝合键。 ②区别：来源于大肠杆菌，来源于T4噬菌体， 只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来； 而能缝合两种末端，但连接的之间的效率较低。 (2)与DNA聚合酶作用的异同: DNA聚合酶只能将加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。 DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。 必须需要模板 3.“分子运输车”—— （1）载体具备的条件：①。 ②，供外源DNA片段插入。 ③，供重组DNA的鉴定和选择。 （2）最常用的载体是 ,它是一 种 。
（3）其它载体： (二)基因工程的基本操作程序 第一步： 1.目的基因是指：基因。 2.原核基因采取获得，真核基因是。人工合成目的基因的 常用方_ 和_。 3. 从基因文库中获取 基因文库（1）概念：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。 （2）类型：基因组文库和部分基因文库（如cDNA文库） （1）原理： （2）过程：第一步：加热至90～95℃； 第二步：冷却到55～60℃，； 第三步：加热至70～75℃，。 第二步：（核心步骤）
生命科学导论整理
生命科学导论 1. 生命的特征 （1）.物质成分基本相同 C、H、O、N、P、S、Ca….. 蛋白质、核酸、脂肪、糖类、维生素等多种有机分子 蛋白质：由20种氨基酸组成。 核酸：由8种核苷酸组成。 ATP(三磷酸腺苷)为贮能分子 （2）.严密的组织和高度的统一性 各种生物编制基因程序的遗传密码是统一 DNA--RNA--Protein （3）.新陈代谢，metabolism 生物体不断地吸收外界的物质，这些物质在生物体内发生一系列变化，最后成为代谢过程的最终产物而被排出体外。 组成作用（anabolism）：从外界摄取物质和能量，将它们转化为生命本身的物质和贮存在化学键中的化学能。 分解作用（catabolism）：分解生命物质，将能量释放出来，供生命活动之用。 （4）.生长特性，Growth 生物体能通过新陈代谢的作用而不断地生长、发育 遗传因素起决定性作用 外界环境因素也有很大影响 （5）遗传和繁殖能力，genetics 生物体能不断地繁殖下一代，使生命得以延续。 生物的遗传是由基因决定的，生物的某些性状会发生变异；没有可遗传的变异，生物就不可能进化。 （6） .应激能力，irritability 生物接受外界刺激后会发生反应。 生物的运动受神经系统的控制。 （7）.进化 2. 生命的定义 从生物学角度的定义：由核酸和蛋白质等物质组成的多分子体系，它
具有不断自我更新、繁殖后代以及对外界产生反应的能力。 从物理学角度的定义---“负熵”：热力学第二定律：任何自发过程总是朝着使体系越来越混乱，越来越无序的方向，即朝着熵增加的方向变化。 生命的演化过程总是朝着熵减少的方向进行，一旦负熵的增加趋近于零，生命将趋向终结，走向死亡。 “生命”的完整的、系统的定义：生命的物质基础是蛋白质和核酸; 生命运动的本质特征是不断自我更新，是一个不断与外界进行物质和能量交换的开放系统；生命是物质的运动，是物质运动的一种高级的特殊实在形式。 3.主要的进化学说 拉马克进化学说、达尔文自然选择学说、现代综合进化论、中型选择学说。 关于生命起源的假说神造论自然发生论宇生论。 4. 人种的迁徙 四种：蒙古利亚人种（Mongloid）或称黄种 高加索人种（Caucasoid）或称白种 尼格罗人种（Negroid）或称黑种 澳大利亚人种（Australoid）或称棕种 5 6几种重要的生命物质 有机物 遗传信息的存储和传递者——核酸 生命信息载体 遗传信息的表达者——蛋白质（酶的催化作用、运载和贮存协调
基因工程知识点总结归纳(更新版)
基因工程 绪论 1、克隆（clone）：作名词：含有目的基因的重组DNA分子或含有重组分子的无性繁殖。作动词：基因的分离和重组的过程。 2、基因工程（gene engineering）：体外将目的基因插入病毒、质粒、或其他载体分子中，构成遗传物质的新组合，并使之掺入到原先没有这些基因的宿主细胞内，且能稳定的遗传。供体、受体和载体是基因工程的三大要素。 3、基因工程诞生的基础 三大理论基础：40年代发现了生物的遗传物质是DNA；50年代弄清楚DNA 的双螺旋结构和半保留复制机理；60年代确定遗传信息的遗传方式。以密码方式每三个核苷酸组成一个密码子代表一个氨基酸。 三大技术基础：限制性内切酶的发现；DNA连接酶的发现；载体的发现 3、基因工程的技术路线：切：DNA片段的获得；接：DNA片段与载体的连接；转：外源DNA片段进出受体细胞；选：选择基因；表达：目的基因的表达；基因工程的工具酶 1、限制性内切酶（restriction enzymes）：主要是从原核生物中分离纯化出来的，是一类能识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶。 2、限制酶的命名：属名（斜体）+种名+株系+序数 3、II型限制性内切酶识别特定序列并在特定位点切割 4、同裂酶：来源不同，其识别位点与切割位点均相同的限制酶。 5、同尾酶：来源不同，识别的靶序列不同，但产生相同的黏性末端的酶形成的新位点不能被原来的酶识别。 6、限制性内切酶的活性：在适当反应条件下，1小时内完全酶解1ug特定的DNA 底物，所需要的限制性内切酶的量为1个酶活力单位。 7、星号活性：改变反应条件，导致限制酶的专一性和酶活力的改变。 8、DNA连接酶的特点：具有双链特异性，不能连接两条单链DNA分子或闭合单链DNA，连接反应是吸能反应，最适反应温度是4至15度，最常用的是T4连接酶。 9、S1核酸酶：特异性降解单链DNA或RNA。
基因工程期末考试重点知识整理教学文案
基因工程期末考试重点知识整理
基因工程 第一章基因工程概述 1、基因工程的概念(基因工程基本技术路线PPT) 基因工程（Gene Engineering）,是指在基因水平上的遗传工程,它是用人为方法将大分子(DNA)提取出来,在离体条件下用适当的工具酶进行切割后,把它与作为载体的DNA分子连接起来,然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中,以让外源遗传物质在其中“安家落户”,进行正常的复制和表达,从而获得新物种的一种崭新的育种技术. 2、基因工程的历史 基因工程准备阶段：1972，第一个重组DNA分子的构建，构建人：Paul Berg 及其同事PPT 基因工程诞生：1973，Cohen & Boyer首次完成重组质粒DNA对大肠杆菌的转化 基因工程发展阶段的几个重要事件： 一系列新的基因工程操作技术的出现； 各种表达克隆载体的成功构建； 一系列转基因菌株、转基因植物、转基因动物等的出现 3、基因工程的内容（P9） 4、基因克隆的通用策略（P12）(基因组文库(鸟枪法)+分子杂交筛选)
第二章分子克隆工具酶 5、限制性核酸内切酶的概念、特点、命名、分类(问答) 概念：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶，主要存在于细菌体内 特点（参加PPT） 命名：依次取宿主属名第一字母，种名头两个字母，菌株号，然后加上序号。如：从Haemophilus influenze Rd中提取到的第三种限制型核酸内切酶被命名为Hind Ⅲ，Hin指来源于流感嗜血杆菌，d表示来菌株Rd，Ⅲ表示序号。 分类：依据酶的亚单位组成、识别序列的种类以及是否需要辅助因子可分为：Ⅰ型酶、Ⅱ型（Ⅱs型）酶和Ⅲ型酶。 真核细胞中有4中DNA聚合酶：α，β，γ，线粒体DNA聚合酶 原核生物中3中DNA聚合酶：Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ
基因工程主要知识点整理
第一章基因克隆 基因工程的基本技术有哪些？ 答：对核算分子的分离、纯化、回收、分析和检测、切割、连接和修饰，以及序列测定、诱变、扩增和转移等基因操作技术。 构建基因文库一般使用什么作为载体？ 答：一般使用大肠杆菌作为载体 克隆与亚克隆？ 答：克隆在一等程度上等同于基因的分离。亚克隆是将目的基因所对应的小段的DNA片段找出来。 PCR对基因克隆有什么作用？ 答：现在基因克隆可以不用通过构建基因文库来实现，可以通过理性设计和PCR扩增获得大多数所需要的基因。但是尽管如此，在不知道基因序列的情况下，如相互作用的基因，表达调控因子，新基因等，还需要构建基因文库来进行基因克隆。 第二章分子克隆工具酶 限制与修饰系统？ 答：限制系统可以排除外来DNA。限制的作用实际就是降解外源DNA，维护宿主稳定的保护机制。甲基化是常见的修饰作用，宿主通过甲基化来达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的作用。并且能够保证自身的DNA不被降解。 使用最广泛的限制酶？ 答：EcoR I是应用最广泛的限制性内切酶 限制性内切酶的命名？ 答：宿主属名第一字母、种名头两个字母、菌株号+序列号。 如：HindIII 限制与修饰系统分类？ 答：至少可分为3类。II类所占比例最大，其酶分子为内切酶与甲基化分子不在一起，识别位点为4-6bp的回文序列，切割位点为识别位点中或者靠近识别位点。其限制反应与甲基化反应是分开的反应。不需要ATP的参与。 限制酶识别的序列长度？结构？
答：一般为4-6个bp，即每256和每4096个碱基中存在一个识别位点。回文序列，不对称序列，多种不同序列，间断对称序列 限制酶产生的末端？ 答：1、黏末端2、平末端3、非对称突出末端 什么是同裂酶？分类？ 答：识别相同序列的限制酶称为同裂酶。但他们的切割位点有可能不同。分为：1、同位同切酶2、同位异切酶3、同工多位酶4、其他 限制性内切酶的作用是什么？它的反酶是什么？ 答： 什么是同尾酶？ 答：许多不同的限制酶切割DNA产生的末端是相通的，切实对称的，即他们可产生相同的黏性突出末端。 酶切的缓冲液中一般含有什么？作用是？ 答：调控pH的缓冲剂：稳定溶液的pH M g2+：稳定酶的作用，提高酶的活性，提高酶的特异性 DDT（二硫苏糖醇）：防止DNA二聚化，影响酶切结果 BSA（小牛血清蛋白）：防止了酶的贴壁效应（可使酶变形），同时减少非特异性吸附，对酶有稳定和促进的作用。 酶切的反应温度？反应时间？中止酶切的方法? 答：反应温度大多为37℃，时间一般为2-3h。中止的方法是在65℃下反应20min。 什么星星活性？抑制其发生的办法？ 答：在极端非标准条件下，限制酶能够切割与识别序列相似的序列，这个改变的特性称为星星活性。抑制星星活性的措施有很多，如减少酶的用量（可避免过分酶切）、减少甘油浓度、保证反应体系中唔有机溶剂或乙醇、提高离子强度到100-150mmol/L（如果不会抑制酶活性的话）和降低反应pH至pH7.0以及保证使用M g2+作为2价阳离子。 影响酶活性的因素有？ 答：可分为内因和外因 外因是可预见的，可控的：反应条件、底物的纯度（是否有杂质、是否有盐离子和苯酚的污染）、何时加酶、操作是否恰当、反应提及的选择以及反应时间的长短等。 内因有：星星活性、底物甲基化和底物构象（线性还是超螺旋） 原核细胞有几种DNA聚合酶？其特点是什么？ 答：DNA聚合酶I是单链多肽，可催化单链或者双链DNA的延长；DNA聚合酶II则与低分子脱氧核苷酸链的延长有关；DNA聚合酶III在细胞中存在的数目不多，是促进DNA链延长的主要酶。
专题一、基因工程知识点归纳
专题一基因工程 一【高考目标定位】 1、专题重点：DNA重组技术所需的三种基本工具；基因工程的基本操作 程序四个步骤；基因工程在农业和医疗等面的应用；蛋白质工程的原理。 2、专题难点：基因工程载体需要具备的条件；从基因文库中获取目的基 因；利用PCR技术扩增目的基因；基因治疗；蛋白质工程的原理。 二【课时安排】2课时 三【考纲知识梳理】 第1节DNA重组技术的基本工具 教材梳理： 知识点一基因工程的概念：基因工程是指按照人们的愿望，进行格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。 注意：对本概念应从以下几个面理解： 知识点二基因工程的基本工具 1.限制性核酸切酶——“分子手术刀” （1）限制性切酶的来源：主要是从原核生物中分离纯化来的。 （2）限制性切酶的作用：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并能将每一条链上特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键切开。（3）限制性切酶的切割式及结果：①在中心轴线两侧将DNA切开，切口是黏性末端。②沿着中心轴线切开DNA，切口是平末端。 2.DNA连接酶——“分子缝合针” （1）来源：大肠杆菌、T4噬菌体 （2）DNA连接酶的种类：E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。 （3）作用及作用部位：E.coliDNA连接酶作用于黏性末端被切开的磷酸
二酯键，T4DNA连接酶作用于黏性末端和平末端被切开的磷酸二酯键。注意：比较有关的DNA酶 （1）DNA水解酶：能够将DNA水解成四种脱氧核苷酸，彻底水解成膦酸、脱氧核糖和含氮碱基 （2）DNA解旋酶：能够将DNA或DNA的某一段解成两条长链，作用的部位是碱基和碱基之间的氢键。注意：使DNA解成两条长链的法除用解旋酶以外，在适当的高温（如94℃）、重金属盐的作用下，也可使DNA 解旋。 （3）DNA聚合酶：能将单个的核苷酸通过磷酸二酯键连接成DNA长链。（4）DNA连接酶：是通过磷酸二酯键连接双链DNA的缺口。注意比较DNA聚合酶和DNA连接酶的异同点。 3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” （1）分子运载车的种类：①质粒：常存在于原核细胞和酵母菌中，是一种分子质量较小的环状的裸露的DNA分子，独立于拟核之外。②病毒：常用的病毒有噬菌体、动植物病毒等。 （2）运载体作用：①是用它做运载工具，将目的基因转运到宿主细胞中去。②是利用它在受体细胞对目的基因进行大量复制。 （3）作为运载体必须具备的条件：①在宿主细胞中保存下来并大量复制②有多个限制性切酶切点③有一定的标记基因，便于筛选。 思维探究：知识点3、4、5主要是介绍DNA重组技术的三种基本工具及其作用。限制酶──“分子手术刀”，主要是介绍限制酶的作用，切割后产生的结果。在这部分容学习时，应关心的问题之一是：限制酶从哪里寻找？我们可以联想从前学过的容──噬菌体侵染细菌的实验，进而认识细菌等单细胞生物容易受到自然界外源DNA的入侵。那么这类原核生物之所以长期进化而不绝灭，有保护机制？进而联想到可能是有什么酶来切割外源DNA，而使之失效，达到保护自身的目的”。这样就对“限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来”的认识提高了一个层次。 基因进入受体细胞的载体──“分子运 输车”的学习容，不能仅仅着眼于记住这几个 条件，而应该深入思考每一个条件的涵，通过 深思熟虑，才能真正明确为什么要有这些条件 才能充当载体。 教材拓展： 拓展点一限制酶所识别序列的特点 限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是奇数个碱
(整理)专题一基因工程.(最新整理)
专题一基因工程单元测试 A卷 一、选择题(共50分) 1．限制性内切酶的特点是( ) A．只能识别GAATTC序列 B．识别特定的核苷酸序列和具有特定的酶切位点 C．识别黏性末端 D．切割质粒DNA的标记基因 2．上海医学遗传研究所成功培育出第一头携带白蛋白的转基因牛，可以想象这头牛( ) A．发生了基因突变 B．发生了染色体变异 C．发生了基因重组 D．没发生可遗传的变异 3．“工程菌”是指( ) A．用物理或化学方法诱发菌类自身某些基因得到高效表达的菌类细胞株系 B．用遗传工程的方法，把相同种类不同株系的菌类通过杂交得到的新细胞株系 C．用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系 D．从自然界中选择出的能迅速增殖的菌类 4．基因工程技术也称为DNA重组技术，其实施必须具备的四个必要条件是( ) A．目的基因限制性内切酶运载体受体细胞 B．重组DNA RNA聚合酶内切酶连接酶 C．模板DNA信使RNA质粒受体细胞 D．工具酶目的基因运载体受体细胞 5．用DNA限制酶切割DNA时识别的核苷酸序列和切口是( ) A．一种限制酶只识别一种核苷酸序列，有专一性酶切位点 B．一种限制酶在DNA双链上识别的核苷酸序列不同 C．一种限制酶在DNA双链上识别的核苷酸序列相同，但酶切位点不同 D．一种限制酶在DNA双链上识别的核苷酸序列和酶切位点都不同 6．根据mRNA的信息推出并获取目的基因的方法是( ) A．用DNA探针测出目的基因 B．用mRNA探针测出目的基因 C．用mRNA反转录形成目的基因 D．用PCR技术扩增mRNA 7．在人类染色体DNA不表达的碱基对中，有一部分是串联重复的短序列，它们在个体之间具有显著的差异性，这种短序列可用于( ) A．生产基因工程药物 B．侦查罪犯 C．遗传病的产前诊断
生物技术概论基因工程部分复习重点
1、PCR：一种模拟DNA体内复制过程的体外DNA复制过程，在一个离心管的缓冲液体系中，加入DNA模板，d-NTPs、引物和DNA聚合酶，通过变性、退火、延伸三个温度的不断循环，使目标DNA得到快速大量的复制，需要两条合成的寡核苷酸片断和耐热的DNA聚合酶。 2、启动子：在基因序列中，标志着转录起始的可以被RNA聚合酶识别的位点（DNA区段），一般位于基因的上游。 3、终止子：位于基因的编码序列之外（一般在下游）的一段标志着转录停止的RNA聚合酶识别位点。 4、Ti质粒：根癌农杆菌核外的一种环状双链DNA分子，约200kb，Ti质粒的结构上可分为毒性区、T-DNA区、结合转移区、复制起始区。 5、SD序列：位于起始密码子上游的一段保守序列，为细菌核糖体有效结合和翻译起始所必须，一般长约3-9bp，位于起始密码子上游3-11碱基的位置，它与16S核糖体RNA的3端互补，控制翻译的起始。 6、反义链：下链或模板链，在基因的DNA双链中，转录时作为mRNA合成模板的那条单链。 7、基因文库：是指汇集了某一生物基因组DNA全部序列的重组体DNA群体（转化子群）。具体来说，构建基因文库时，首先将代表某一生物类型的全部DNA片段分别插入到特定载体上，然后将重组载体导入到宿主细胞并获得大量的含有重组载体的克隆（一般为单菌落或噬菌斑）。 8、DNA探针：经放射性或非放射性物质标记已知的特定的DNA序列。 9、载体构建：用限制性酶切取目的基因，再用同一种限制酶切开质粒，用连接酶把目的基因和质粒连接起来的过程。 10、转化：将普通的质粒分子导入受体细胞的过程。 11、感受态细胞：经过处理后处于容易接受外源DNA状态的细胞。 12、多克隆位点：克隆载体中的一段用于插入外源DNA片段的特定区域，由一系列的紧密相连的限制性内切酶位点组成，而且每个限制性内切酶位点应该在整个载体中是唯一的。 13、选择标记基因：在基因工程中的一类用于选择转化细胞（菌）的抗性基因，通常是一些抗生素抗性基因，比如对氨苄青霉素、四环素氯霉素、卡那霉素以及潮霉素等具有抗性的基因，这样，通过在培养基中加入特定的抗生素就可以选择得到转化的细胞（菌）。 14、Cos位点：λDNA为线状双链DNA分子，在分子两端各有12个碱基的单链互补粘性末端，当其注入到寄主细胞中后，可以迅速通过粘性末端形成双链环状DNA分子，这种通过粘性末端互补结合成的双链区段称为cos位点。 15、什么是基因，它和细胞，染色体的关系如何？ DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小的功能单位；基因线性排列在染色体上。 16、为什么认为1973年是基因工程诞生的元年？ 1973年DNA体外重组实验的成功。 17、上世纪40到70年代初分子生物学领域理论上和技术上有哪些重大突破；对于基因工程的诞生起到了决定性的作用？ 理论上的三大发现和技术上的三大发明，为基因工程的诞生起到了决定性的作用： 理论上的三大发现：（1）DNA是遗传物质被证实；（2）DNA双螺旋模型被提出；（3）“中心法则”提出 技术上的三大发明：a、核酸限制性内切酶的发现和应用；b、DNA连接酶的发现和应用；c、载体的发现及其应用。 18、什么是克隆？当前动物克隆的基本原理是什么？它和植物的克隆有什么区别？ 克隆作为名词是指某一个体(或细胞分子)通过无性繁殖的方式产生的具有相同遗传背景的后代组成的集体。作为动词是指产生上述集体或群体的过程。多利羊的克隆过程：从A羊体中取出卵细胞，去除其细胞核，将B羊的体细胞核取出转移到去和的卵细胞中，然后将整合后的卵细胞注入到C羊的子宫内，经过一段时间得到和A羊几乎相同的羊。植物克隆是利用植物细胞的全能性，进行的营养体的繁殖过程。 19、基因工程的基本流程是什么？基因工程在现实生活中有什么应用价值？ 流程：（1）从供体生物的基因组中，分离获得带有目的基因的DNA片段（2）在体外，将目的基因插入能自我复制的载体中（3）将重组分子导入到受体细胞中并进行繁殖（4）选择得到含有充足DNA分子的细胞克隆，并进行大量繁殖，从而使目的基因得到扩增（5）进一步对获得的目的基因进行研究分析，并设法使之实现功能蛋白表达。 应用：基因工程药物、基因疫苗、转基因植物、转基因动物以及在酶制剂工业、食品工业、化学与能源工业及环境保
基因工程期末考试重点知识整理
基因工程 第一章基因工程概述 1、基因工程的概念(基因工程基本技术路线PPT) 基因工程（Gene Engineering）,是指在基因水平上的遗传工程,它是用人为方法将大分子(DNA)提取出来,在离体条件下用适当的工具酶进行切割后,把它与作为载体的DNA分子连接起来,然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中,以让外源遗传物质在其中“安家落户”,进行正常的复制和表达,从而获得新物种的一种崭新的育种技术. 2、基因工程的历史 基因工程准备阶段：1972，第一个重组DNA分子的构建，构建人：Paul Berg及其同事PPT 基因工程诞生：1973，Cohen & Boyer首次完成重组质粒DNA对大肠杆菌的转化 基因工程发展阶段的几个重要事件： 一系列新的基因工程操作技术的出现； 各种表达克隆载体的成功构建； 一系列转基因菌株、转基因植物、转基因动物等的出现 3、基因工程的内容（P9） 4、基因克隆的通用策略（P12）(基因组文库(鸟枪法)+分子杂交筛选) 第二章分子克隆工具酶 5、限制性核酸内切酶的概念、特点、命名、分类(问答) 概念：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶，主要存在于细菌体内 特点（参加PPT） 命名：依次取宿主属名第一字母，种名头两个字母，菌株号，然后加上序号。
如：从Haemophilus influenze Rd中提取到的第三种限制型核酸内切酶被命名为Hind Ⅲ，Hin指来源于流感嗜血杆菌，d表示来菌株Rd，Ⅲ表示序号。 分类：依据酶的亚单位组成、识别序列的种类以及是否需要辅助因子可分为：Ⅰ型酶、Ⅱ型（Ⅱs型）酶和Ⅲ型酶。 真核细胞中有4中DNA聚合酶：α，β，γ，线粒体DNA聚合酶 原核生物中3中DNA聚合酶：Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ 6、几个基本概念 粘性末端：两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置是交错的，对称地分布在识别序列中心位置两侧，这样形成的DNA片段末端称为~。 平末端：两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置处在识别序列的对称结构中心，这样切割的结果产生的DNA片段末端是平齐的，称之为~。 同裂酶：一些来源不同的限制性核酸内切酶具有相同的识别序列。如：BamHI和BstI均可识别GGATCC。 同尾酶：有些限制性内切酶虽然识别序列不同，但是切割DNA分子产生相同的DNA末端。如：TaqI：TCGA；ClaI：A TCGA T；AccI：GTCGAC 星星活性：某些限制性核酸内切酶在特定条件下，可以在不是原来的识别序列处切割DNA，这种现象称为Star活性。 DNA物理图谱：（多为质粒图谱）
生命科学导论(知识点归纳)
生命是由核酸和蛋白质组成的，具有不断自我更新能力的多分子体系的存在形式，是一种过程，是一种现象。 生命科学是研究自然界中各种生命现象及其规律的学科。既研究生物的生命现象及其本质，又研究生物与环境之间的相互关系。 生命的物质基础是蛋白质和核酸; 生命运动的本质特征是不断自我更新，是一个不断与外界进行物质和能量交换的开放系统；生命是物质的运动，是物质运动的一种高级的特殊实在形式。 生命的特征：细胞、原生质、新陈代谢、调节、生长、繁殖、应激性 生物学经历了三个发展阶段：描述生物学阶段（19世纪中叶以前）;实验生物学阶段（19世纪中到20世纪中）;创造生物学阶段（20世纪中叶以后） 17世纪中叶——牛顿经典力学;18世纪中叶——（蒸汽机）工业革命;19世纪中后——电气革命;20世纪初——量子论、相对论、核物理（20世纪上半叶，现代物理学黄金半世纪） 人类文明发展的三次技术革命：19世纪——工业革命——解放手脚;20世纪——信息革命——解放大脑;21世纪——生物技术革命——创造生命 维纳——控制论;贝塔朗菲——系统论;申农——信息论 生物技术：应用自然科学和工程学的原理，依靠微生物、动物、植物体作为反应器将物料进行加工以提供产品为社会服务的技术。 水稻育种专家袁隆平;小麦育种专家李振声 生物气体燃料：天然沼气;发酵沼气 沼气发酵的优点：白色能源;增加肥效;消除病害;处理污泥 沼气，是各种有机物质，在隔绝空气（还原条件），并必适宜的温度、湿度下，经过微生物的发酵作用产生的一种可燃烧气体。 细胞学说的三点内容：1.所有生物都是一个或多个细胞组成2. 细胞是生命的基本单位 3. 新细胞是从原有细胞（分裂）而来。 原核生物的特征：1.遗传物质仅一个环状DNA 2.无核膜 3.无细胞器，无细胞骨架 4.以无丝分裂或出芽繁殖例子：支原体、细菌、蓝藻、螺旋藻 真核生物三大系统：膜系统、细胞核系统、骨架系统 内质网：蛋白质合成、脂类合成、蛋白质的修饰、新生多肽的折叠与组装 高尔基体：蛋白质的加工与修饰（糖基化等）、蛋白质的分解、蛋白质和脂的运输、蛋白质的分泌等 溶酶体：（酸性水解酶）清除无用的生物大分子、衰老的细胞器及衰老损伤和死亡的细胞，为新细胞的产生创造条件。防御功能 线粒体：（外膜、内膜、嵴、基质、膜间隙）进行氧化磷酸化，产生ATP，是细胞的“动力工厂”。 线粒体和叶绿体的半自主性：1.腔内都有成环状DNA,70S核糖体2.它们都能自行分化。3.但部分蛋白质还要在胞质内合成 植物细胞特有的细胞结构：细胞壁、叶绿体、大液泡、胞间连丝 叶绿体：能量转化器，光合作用 细胞骨架系统 胞质骨架：微丝、微管、中间纤维 核骨架：核纤层、核基质 细胞连接植物细胞由细胞壁和胞间连丝联接。 ?多细胞动物通过：封闭连接，锚定连接和通讯连接 细胞外基质
高三生物知识点归纳：基因工程及其应用
高三生物知识点归纳：基因工程及其应用 1.概念：按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。 高考生物知识点归纳 2.原理基因重组 3.工具： A.基因的”剪刀”：限制性内切酶 ①分布：主要在微生物中。 ②作用特点：特异性，即识别特定核苷酸序列，切割特定切点。 ③结果：产生黏性未端(碱基互补配对)。 B.基因的”针线”：DNA连接酶 ①连接的部位：磷酸二酯键，不是氢键。 ②结果：两个相同的黏性未端的连接。 C.基因的”运载工具”：运载体 ①作用：将外源基因送入受体细胞。 ②具备的条件：a、能在宿主细胞内复制并稳定地保存。b、具有多个限制酶切点。 c、有某些标记基因。 ③种类：质粒、噬菌体和动植物病毒。 ④质粒的特点：质粒是基因工程中最常用的运载体。 4.基因操作的基本步骤： ①提取目的基因：人们所需要的特定基因，如人的胰岛素基因、抗虫基因、抗病基因、干扰素基因等 ②目的基因与运载体结合(以质粒为运载体)：用同一种限制酶分别切割目的基
因和质粒DNA(运载体)，使其产生相同的黏性末端，将切割下的目的基因与切割后的质粒混合，并加入适量的DNA连接酶，使之形成重组DNA分子(重组质粒) ③将目的基因导入受体细胞常用的受体细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌、动植物细胞 ④目的基因检测与表达 检测方法如：质粒中有抗菌素抗性基因的大肠杆菌细胞放入到相应的抗菌素中，如果正常生长，说明细胞中含有重组质粒。 表达：受体细胞表现出特定性状，说明目的基因完成了表达过程。如：抗虫棉基因导入棉细胞后，棉铃虫食用棉的叶片时被杀死;胰岛素基因导入大肠杆菌后能合成出胰岛素等。
基因工程期末复习考点.doc
Marshall W. Nirenberg Har G. Khorana t 信使RNA 麟密码 t DNA 浙江万里学院基因工程期末复习考点 第一章绪论 1. 分子生物学与基因工程发展的代表性事件：（客观题） 1928年,Griffith 实验——肺炎双球菌体内转化实验，证明了转化因子（DNA ）是遗传物质, 没有得出蛋白质与遗传物质的关系 1944年，Avery 实验——体外转化实验，证实了蛋白质不是遗传物质。 1952年，Hershey-Chase 实验一一利用放射性同位素标记大肠杆菌T2噬菌体的捣碎实验证 明 了遗传物质是DNA,而不是蛋白质。 1953年，沃森和克里克发现了 DNA 双螺旋的结构，开启了分子生物学时代。威尔金斯富 兰克林（填空） 1958年，Matthew Meselson Franklin Stahl 采用氯化艳密度梯度离心法验证DNA 复制的半 保留复制 Robert W. Holley 1965年破译了所有氨基酸的密码子 2. 镰刀型贫血：氨基酸突变血红蛋白亚基N 端的第六个氨基酸残基是缴氨酸（val ）,而 不是下正常的谷氨酸残基（Glu ）。 t t GAA GUA t t C T T 值出| C AT “A A\ 反rpj A A A A ■ ' — ■ A 」A GAA 突变 G TA 嫌刀型细胞贫血控必因的图解 3. 胰岛素（公司+事件） 1921年，加拿大科学家Banting 和Best 发现胰岛素，是糖尿病治疗史上的里程碑 1922年，开始用于糖尿病的治疗 胰岛素发现四人组”：Banting 、Best 、科利普和麦克莱德 1922年5月，多伦多大学与礼来公司（EliLilly and Company ）it 成协议，由科学家们帮助礼来 开展胰 岛素的规模生产。因苏林：第一支商业化胰岛素的诞生 1982年5月14 口，礼来向美国FDA 提交了生物合成人胰岛素NDA18-790的申请 1982年10月28日，FDA 发布了批准书，第一支基因重组人胰岛素正式上市 1997年，第一支基因重组人胰岛素进入中国 Sanger 测序法：蛋白质的结构和功能是由氨基酸序列所决定的 中国科学家的贡献：人工合成牛胰岛素 1973年，斯坦福大学的Stanley Cohen 和加州大学旧金山分校的Herbert Boyer 合作发表了一 篇学术论文 一一重组DNA 技术 4.1990年，美国批准了第一例临床基因治疗申请，患者为四岁女孩Ashanti de Silva,由于 缺乏腺苜脱氢酶ADA 基因而患有严重综合性免疫缺陷症，研究者W.F. Anderson 将ADA 基因 导入患者的淋巴细胞，然后 将经改造的淋巴细胞回输到患者体内，取得了成功。
专题1基因工程知识点梳理(含教材答案)
专题1 基因工程 ※基因工程的概念： 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。 ﹡原理：基因重组 ﹡目的：创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。 ﹡意义：能够打破生物种属的界限（即打破生殖隔离，克服远源杂交不亲和的障碍），在分子水平上定向改变生物的遗传特性。 ﹡操作水平：DNA分子水平 【思考】： （1）基因工程的物质基础是：所有生物的DNA均由四种脱氧核苷酸组成。 （2）基因工程的结构基础是：所有生物的DNA均为双螺旋结构。 （3）一种生物的DNA上的基因之所以能在其他生物体内得以进行相同的表达，是因为它们共用一套遗传密码子。 一、基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶） （1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。 （2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。 （3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端（回文结构特点）。 ①在中心轴线两侧将DNA切开，切口是黏性末端。 ②沿着中心轴线切开DNA，切口是平末端。 2.“分子缝合针”——DNA连接酶
（1）分类：根据酶的来源不同，可分为E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶两类 （2）功能：恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 ★两种DNA连接酶(E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶)的比较： ①相同点：都缝合磷酸二酯键 ②区别：E．coIiDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能使黏性末端之间连接； T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端之间的效率较低。 (3)与DNA聚合酶作用的异同: DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。 （4）与DNA分子相关的酶
基因工程细胞工程知识点汇总
基因工程细胞工程知识点汇总 一、基因工程 （一）基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA 分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。 （一）基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶） （1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。 （2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。 （3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。 2.“分子缝合针”——DNA连接酶 (1)两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶）的比较： ①相同点：都缝合磷酸二酯键。 ②区别：E·coliDNA连接酶来源于T4噬菌体，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。 (2)与DNA聚合酶作用的异同: DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。 3.“分子运输车”——载体 （1）载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。 （2）最常用的载体是 质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。 （3）其它载体： 噬菌体的衍生物、动植物病毒 (二)基因工程的基本操作程序 第一步：目的基因的获取 1.目的基因是指：编码蛋白质的结构基因。 2.原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反转录法_和化学合成法_。 技术扩增目的基因
基因工程知识点总结.
选修3易考知识点背诵 专题1 基因工程 基因工程的概念 1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶） （1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。 （2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有特异性。 （3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。 2.“分子缝合针”——DNA连接酶 (1)两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）的比较： ①相同点：都缝合磷酸二酯键。 ②区别：E·coliDNA连接酶来源于T4噬菌体，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来； 而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。 (2)与DNA聚合酶作用的异同:DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DN A连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。驤賭魎闭砺蓀審諦拥惮璦绫广韓砚遜嚙攤龋拟坛赣檷麥该红兰栋茲轶畴護赈淨繅羁鲎珑漲诉狯铬滅绠铍缅養釁匦赵骥綸烩飪罚条欏鲩揀鸥。 3.“分子运输车”——载体 （1）载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。 ②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。 ③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。 （2）最常用的载体是质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。 （3）其它载体：噬菌体、动植物病毒 (二)基因工程的基本操作程序 第一步：目的基因的获取 1.目的基因是指：是人们所需要转移或改造的基因 2.获取目的基因的方法____________ _________________ _____________ 3.原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反转录法_和化学合成法_。 4.PCR技术扩增目的基因 （1）原理：DNA双链复制 （2）过程：第一步：加热至90～95℃DNA解链；第二步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链；第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。 第二步：重组DNA分子