酶的分子设计, 改造与工程应用
生物工程中的酶工程技术使用方法
生物工程中的酶工程技术使用方法引言：生物工程是一门将生物学、化学、工程学等理论与技术相结合的学科，它与现代产业和生活密切相关，并在许多领域发挥了重要作用。
酶工程技术作为生物工程的核心之一，广泛应用于医药、食品、化工、能源等领域。
本文将介绍生物工程中酶工程技术的使用方法。
一、选取合适的酶在生物工程中，根据实际需要选择合适的酶对目标产物进行催化反应是至关重要的。
酶是一种生物催化剂，具有高效、选择性和环境友好等特点。
因此，在进行酶工程之前，需要调研目标产物及其催化反应的特点，以确定最适合的酶。
例如，对于酶可承载的底物种类、反应温度和酸碱度等因素进行综合考虑，选择适合的酶。
二、酶工程基因的选择与改造酶工程技术的应用离不开基因工程的手段。
通过DNA重组技术、启动子的选择、基因调控元件的设计等手段，可以将理想的酶基因导入到宿主生物中。
这需要将目标基因与宿主生物的基因组进行兼容，并确保其在宿主生物中的表达量和稳定性。
同时，对于目标酶本身的改造也是酶工程技术的重要步骤。
借助于分子生物学技术，可以对目标酶进行特定的突变，以改变其活性、稳定性或底物特异性。
例如，酶突变可以通过有针对性地改变酶的氨基酸序列，从而提高其活性或选择性。
三、酶工程系统的优化酶工程技术的应用通常需要建立一个完整的酶工程系统。
这个系统包括酶的产生（发酵）、分离纯化和催化反应等步骤。
在建立酶工程系统时，有几个关键环节需要进行优化。
首先，酶的产生通常利用大规模发酵技术。
要实现高效的产酶，需要确定优化发酵条件，包括培养基成分、温度、pH值、搅拌速度等。
此外，还需考虑基因表达的调控，如改变启动子和编码序列等，以提高目标酶基因的表达水平。
其次，分离纯化是酶工程中的关键步骤之一。
传统的分离纯化技术包括层析、电泳和过滤等方法。
近年来，随着膜分离技术和亲和层析技术的进步，分离纯化的效率得以提高。
选择合适的分离纯化方法可以实现高纯度的酶产物。
最后，催化反应是酶工程中的核心步骤。
酶工程技术在制药中的应用研究
酶工程技术在制药中的应用研究随着医学的不断发展，药物的研制也日益提高了人类的健康水平，其中酶工程技术在制药中起到了重要的作用。
本文将围绕酶工程技术在制药中的应用展开论述。
一、酶工程技术简介酶是一种生物催化剂，能够在体内促进反应的进行。
而酶工程技术则是指利用现代分子生物学和遗传工程的方法，对酶进行设计、改造、合成和利用的技术。
酶工程技术的出现，为制药行业带来了新的机遇和挑战。
二、酶工程技术在制药中的应用1. 酶制药酶制药是利用酶在体外合成药物或对药物进行标记的一种方法。
由于酶具有高效、选择性强、对环境友好等特点，因此在制药中被广泛应用。
举例来说，酶可以在体外合成抗癌药物、维生素、抗生素等有效成分，也可以对药物进行放射性标记，在体内追踪药物的分布和代谢过程。
2. 酶工程技术在酶药物研制中的应用酶药物是指利用特定酶来治疗疾病的药物，在制药中具有广泛的应用前景。
随着酶工程技术不断发展，越来越多的酶药物被开发出来。
例如，利用酶切割蛋白质能够治疗关节炎和癌症等疾病，在新药研究中扮演了重要的角色。
3. 酶反应过程中的控制与优化在酶反应过程中，酶的性质和反应条件等都会对反应过程产生影响，因此需要对反应过程进行控制和优化。
酶工程技术可以通过改变酶的性质或设计特殊的反应条件，来优化酶反应过程，提高反应效率和质量。
例如，利用反应工程学方法，可以对pH、温度、底物浓度等因素进行优化，从而提高酶反应的产率和效率。
4. 酶工程技术在纯化和分离过程中的应用在药物的制备过程中，纯化和分离是非常关键的步骤，影响着药物的质量和产率。
酶工程技术可以将药物在分离过程中与特定酶结合，通过酶的特异性去除其他无关成分，从而达到提高药物纯度和分离效率的目的。
三、酶工程技术在制药中的应用前景随着现代医学的不断进步，药物的精细化和个性化成为制药行业的重要趋势。
酶作为一种天然催化剂，具有高效、安全、环保等优势，可以满足药物制备的高效性和精细化的要求，在药物研究和制备中的应用前景广阔。
酶工程技术的研究及其在医药领域的应用
酶工程技术的研究及其在医药领域的应用一、本文概述随着生物技术的飞速发展，酶工程技术作为其中的重要组成部分，已经在医药领域展现出广阔的应用前景。
酶，作为生物体内的一类特殊蛋白质，具有高效、专一和温和的催化特性，因此被广泛用于医药、化工、食品等多个领域。
本文旨在探讨酶工程技术的最新研究进展，并重点分析其在医药领域的应用现状和发展趋势。
本文将对酶工程技术的基本原理和方法进行简要介绍，包括酶的来源、分离纯化、固定化以及酶反应器的设计等。
在此基础上，文章将重点论述酶工程技术在医药领域的多个应用方面，如药物合成、药物转化、药物分析和疾病诊断等。
通过具体案例和数据分析，展示酶工程技术在提高药物生产效率、降低药物成本、改善药物质量和提高疾病诊疗准确性等方面的积极作用。
本文还将对酶工程技术在医药领域面临的挑战和未来发展方向进行深入探讨。
随着生物技术的不断进步，酶工程技术的研究和应用将更加深入和广泛。
例如，新型酶的发现与改造、酶固定化技术的创新、酶反应器的优化以及酶工程技术在基因治疗和细胞治疗等新兴领域的应用等，都将成为未来研究的热点和方向。
酶工程技术在医药领域的应用已经取得了显著成果，并展现出广阔的发展前景。
本文将从多个角度全面分析酶工程技术在医药领域的应用现状和发展趋势，以期为相关领域的研究和实践提供有益的参考和借鉴。
二、酶工程技术的基础理论酶工程技术，作为一门应用生物技术的分支，其基础理论主要涵盖酶学基本原理、酶反应动力学、酶分子设计和改造以及酶固定化技术等方面。
酶学基本原理是酶工程技术的基石。
酶是生物体内具有催化功能的蛋白质，具有高度专一性和高效性。
酶通过降低反应的活化能来加速生物化学反应，使得原本难以进行的反应在温和条件下也能迅速进行。
了解酶的结构、催化机制以及影响因素，对于酶工程技术的应用至关重要。
酶反应动力学是研究酶催化反应速率与反应物浓度关系的科学。
通过对酶反应动力学的研究，可以了解酶催化反应的速度控制步骤、反应速率常数以及反应机制等，为酶工程技术的优化提供理论依据。
酶的生物改造共65页课件.ppt
4、定向进化的原理
在待进化酶基因的PCR扩增反应中，利用Taq DNA聚合 酶不具有3’->5’校对功能的性质，配合适当条件， 以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构建突变 库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化酶 (或蛋白质)，从而排除其他突变体。
定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。 定向进化=随机突变+选择。前者是人为引发的，后者
3、酶的定向进化技术
定义： 从一个或多个已经存在的亲本酶（天然或人为 获得）出发，经过基因突变和重组，构建一个 人工突变基因库，通过筛选最终获得预先期望 具有某些特性的进化酶；
所谓酶的体外定向进化，又称实验分子进化，属于蛋 白质的非合理设计，它不需事先了解酶的空间结构和 催化机制，通过人为地创造特殊的条件，模拟自然进 化机制(随机突变、重组和自然选择)，在体外改造酶 基因，并定向选择出所需性质的突变酶。
虽相当于环境，但只作用于突变后的分子群，起着选 择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，整个 进化过程完全是在人为控制下进行的
酶定向进化的过程和应用范围
蛋白质
随机突变 随机杂交
•稳定性 •活性 •有机溶液中的活性 •不同的底物的利用 •酸碱度 •蛋白质的表达 •亲和性 •专一性
性能
筛选
目达标到蛋目的白
三、酶定向进化的基本过程
随机突变 不同的定向进化方法构建突变基因 载体的选择，基因重组，组建基因
突变基因的筛选 平板筛选法，荧光筛选法，表面展示法
1、定向进化的方法
无性进化方法：易错PCR法，盒式诱变 有性进化方法
1）DNA改组法（DNA Shuffling) 2）体外随机重组法（RPR) 3）交错延伸法(StEP) 基因家族的同源重组 外显子的改组 杂合进化
蛋白质与酶的工程改造技术及其应用
蛋白质与酶的工程改造技术及其应用蛋白质是构成生物体细胞的基本结构单元，对于生命活动的各种过程都具有重要的作用。
酶则是生物体内催化反应的重要媒介，通过发挥催化活性加速生命过程，维持了细胞的生存。
传统的酶工程技术主要将重点放在酶的分离和纯化上，但是这种方法成本高、效率低，对于大规模生产和应用场景并不适用。
随着现代生物技术的不断发展，蛋白质与酶的工程改造技术不断更新，为生物制药、酶催化反应等领域提供了新的解决方案。
本文将介绍蛋白质与酶的工程改造技术及其应用。
一、蛋白质工程改造技术1.点突变技术点突变技术是将蛋白质基因的某个碱基或氨基酸序列进行改变，从而使其具有不同的功能、活性或特定的理化性质。
这种技术在人类疾病治疗、新型药物研发、工业酵素等领域有着广泛的应用。
例如，通过点突变技术可以将普通抗体转化为更强力、更稳定的人源化抗体，提高其在治疗上的效果；也可以将酵素的催化速率、热稳定性等进行调整，以适应特定的工业需求。
2.融合蛋白技术融合蛋白技术是将两个或多个不同蛋白质结构域进行连接，形成一个新的分子，从而具有多种不同的功能。
融合蛋白技术不仅可以产生新的蛋白质，还可以对原有蛋白质的稳定性、性质等进行调整。
例如，通过将大肠杆菌外膜蛋白（OmpA）与绿色荧光蛋白（GFP）进行融合，可以得到具有膜定位与荧光表达功能的融合蛋白，用于生物成像和药物靶向测定等领域。
3.点突变与融合蛋白技术的结合将点突变和融合技术相结合可以使得蛋白质的活性和稳定性得到双重提升。
例如，通过将发酵产物氨基酸脱羧酶（ADC）与乙醇磷酸酸转移酶（EPAT）进行融合，并进行点突变，可以得到具有更高催化效率和稳定性的蛋白质。
二、酶工程改造技术酶催化反应是生物科学和化学领域中的重要研究内容，具有广泛的应用前景。
酶工程改造技术可以通过改变酶的氨基酸组成、酶的整体结构、酶的环境条件等，调节酶的催化效率和稳定性，达到增强酶活性、改进反应过程、提高酶的选择性等目的。
现代生物化工中酶工程技术研究与应用
现代生物化工中酶工程技术研究与应用1. 引言1.1 背景介绍生物化工作为生物技术领域的一个重要分支，是利用生物学原理和工程技术解决工业生产过程中的环境问题和提高生产效率的重要手段。
而酶工程技术作为生物化工领域的重要支撑技术，其在现代生物化工中发挥着越来越重要的作用。
在当前全球气候变暖和资源匮乏的大背景下，生物化工以其可持续性和环保性逐渐成为产业发展的主流方向。
而酶工程技术作为生物化工中的重要技术手段，将继续发挥其在提高生产效率、减少资源浪费和环境污染等方面的重要作用。
对现代生物化工中酶工程技术的研究与应用具有重要意义。
1.2 研究意义酶工程技术在现代生物化工中具有重要的意义。
通过酶工程技术可以改善传统化工生产工艺，提高生产效率，减少能源消耗，降低生产成本。
酶工程技术有助于开发新型的生物催化过程，可以实现对复杂化合物的高效合成，拓展生物合成的应用领域。
酶工程技术可以为医药和食品工业提供更加安全、高效和绿色的生产手段，为人类健康和生活质量的提升提供支持。
酶工程技术的研究还有助于深化对生命科学的理解，推动生物技术的发展和创新。
深入研究与应用酶工程技术对于推动现代生物化工的发展，促进科技进步和经济发展具有重要的意义。
1.3 研究目的研究目的是为了探索和发展酶工程技术在现代生物化工领域中的应用潜力，进一步提高生物转化过程的效率和产量。
通过深入研究酶的结构和功能特性，不断改良和优化酶的性能，实现对特定底物的高效催化转化，从而提高生产效率，降低能耗，减少废弃物排放，推动生物化工产业的可持续发展。
研究酶工程技术的前沿进展，探讨新型酶的发现和设计方法，探索利用合成生物学和基因编辑技术构建高效酶系统的可能性，为未来生物化工的发展提供技术支持和指导。
通过本文的研究，旨在加深对酶工程技术的理解，探索其在现代生物化工中的应用前景，促进技术创新和产业升级，推动生物资源的可持续利用和环境保护。
2. 正文2.1 酶工程技术概述酶工程技术是一门结合生物学、化学、工程学等多学科知识的交叉领域，是利用基因工程技术对酶进行改造和优化，以提高其在生物化工生产中的效率和稳定性的技术。
酶与酶工程
1.酶1.1酶的基本概念酶的化学本质是蛋白质，这一点是被生物化学所证明了的，研究酶的化学本质，可用研究蛋白质的方法进行研究。
一般情况下，一个结构完整的酶包括蛋白质和非蛋白质两部分，蛋白质部分称为辅基酶蛋白，非蛋白质部分称为辅助因子，辅基酶蛋白和辅助因子构成一个全酶。
辅助因子的化学本质因不同的酶而不同，它可以是小分子量的有机化合物，也可以是无机矿物质离子。
酶是一种生物催化剂，在催化活性上与无机催化剂类似，酶在催化反应时，其本身不发生化学改变，只是催化反应的进行，此外，酶在催化反应时，仅改变反应速度，并不改变反应的平衡。
酶催化反应的动力学机理是降低反应的活化能。
酶作为生物催化剂，其催化反应的专一性远远超过无机催化剂，根据酶的专一化程度，可分为绝对专一性和相对专一性。
绝对专一性：是指一种酶只能催化一种底物进行一种反应，底物的分子结构、空间构型及构象的不同都表现出专一性。
相对专一性：是指一种能够催化一类结构相似的物质进行相同类型的反应，主要是对某一化学键的专一性。
例如，胰蛋白酶(Trypsin EC 3.4.31.4)催化含有赖氨酸或精氨酸羰基的肽键的水解反应，凡是具有含赖氨酸或精氨酸羰基酰胺键的底物都能被此酶催化水解。
1.2酶的结构和功能构成酶活性中心的氨基酸在一级结构上，呈分散状态，这些氨基酸是通过酶蛋白的二、三、四级结构使得其在空间上彼此集中，构成一个特定的与酶活性表达有关区域，这个特定区域即酶的活性中心(active center)，换句话说，酶的活性中心是酶分子上的与底物结合并催化反应的特定基团或特定区域。
酶活性中心包括两部分，其一是底物结合部位，其二是催化部位。
必需基团参与构成酶的活性中心和维持酶的特定构象。
必需基团是指酶分子中某些基团若经化学修饰后（氧化、烷化、酰化、还原等）使其结构改变，则酶分子丧失活性。
活性部位的基团都是必需基团，必需基团包括活性中心基团和其外的对维持酶活性空间构象所必需的一些基团。
酶分子改造的方法及应用
酶分子改造的方法及应用摘要：酶工程是研究酶的生产和应用的一门技术性学科，进入20世纪后，随着微生物发酵技术的发展和酶分离纯化技术的更新，酶制剂的研究得到不断推进并实现了其商业化生产，但直接利用酶制剂时存在酶的稳定性差、使用效率低、不能在有机溶剂中反应等缺点。
通过酶的修饰可提高酶的稳定性，消除或降低酶的抗原性，使之更适合生产和应用的要求。
近年来发展的蛋白质工程技术则使酶的定向改造成为可能。
随着生物技术的发展，酶工程将引起巨大的变革。
关键词：酶分子修饰蛋白质工程模拟酶引言：近年来，酶工程开始兴起，迅速发展，其研究成果也越来越广泛地运用于各个领域。
虽然如此，但是由于酶一离开其特定的环境条件就会变得不太稳定，不适合大批量生产的需求，因此，大规模应用酶和酶工艺的还不多。
在工业应用中，底物及产物带来的影响常常导致pH偏离酶作用的最适条件的中性范围，使酶难以发挥作用。
在临床应用上，绝大多数酶对人体而言都是外源蛋白质，具有抗原性，直接注入会引起人体的过敏反应。
所以人们希望能够通过各种人工方法改造酶，使其更能适应各方面的需要。
1.酶分子改造的方法1.1酶分子修饰酶分子修饰[1]（Modification of Enzyme Molecule）即通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的过程。
酶分子修饰在提高酶的活力、增强酶的稳定性、降低或消除酶的抗原性、研究各种物理因素对酶分子空间构象的影响，进一步探讨酶分子的结构与功能之间的关系等方面具有重要意义。
1.1.1酶分子的主链修饰酶分子的主链修饰[2]就是利用酶分子主链（肽链或核苷酸链）的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。
1.1.1.2主链的切断修饰[3]主链断裂后，引起酶活性中心的破坏，酶的催化功能丧失（用于探测酶活性中心的位置）。
酶活性中心的空间构象维持不变，酶的催化功能也可以保持不变或损失不多，但是抗原性有发生改变。
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图 1 overlap extension PCR 介导定点突变
表 1 酶性质随着定点突变而改变
Table 1 Enzyme characteristic change following by
sited directed muta genesis
修饰
酶
修饰部位
原氨基酸残基新氨基酸残基
酶性质的改变
酪氨酰 TRNA 合成酶 51
( 2) STEP ( staggered extension process) 重 组[ 12] 。 STEP 重组是一种简化的 DNA shuffling 方法。它不 是由短片段组装全长基因, 而是在 PCR 反应中, 将 含不同点突变的模板混合, 随之进行多轮变性、短 暂复性及延伸反应, 在每一轮中, 那些部分延伸的 片段可以随机地杂交到含不同突变的模板上继续 延伸, 由于模板转换而实现不同模板间的重组, 如 此重复直至获得全长基因片段。
第 24 卷第 8 期
中 国生 物 工 程 杂 志
CHINA BIOTECHNOLOGY
2004 年 8 月
酶的分子设计、改造与工程应用
朱俊晨1, 2*
( 1 深圳职业技术学院生物工程系 深圳 518055
王小菁2
2 华南师范大学生命科学院 广州 510641)
摘要 酶工程的研究已经发展到分子水平, 在体外通过基因工程、化学、物理等手段改造酶分子 结构与功能, 大幅提高了酶分子的进化效率和催化效率, 生产有价值的非天然酶。对酶工程学若 干 热点 和前沿课题的研究、应用进行了概述, 分析了国际上酶工程研究及应用技术、手段、方 法, 包括体外分子进化、核酶和抗体酶的设计、酶分子的定向固定化技术、酶蛋白分子的化学修 饰、融合酶、人工合成及模拟酶等技术, 并展望了酶工程的技术进步和应用的新进展。 关键词 酶工程 蛋白质工程 分子设计
2 核酶和抗体酶的设计
3 酶分子的定向固定化技术
2 1 核酶的设计 不但 RNA 分子具有催化功能, 包括近年发现
的某些 DNA 分子也具有催化功能, 将其统称为核 酶 ( ribozyme) , 进一步的研究发现核酶的一种多功 能的生物催化剂, 不仅可以作用于 RNA 和 DNA, 而 且还可以作用于多糖、氨基酸酯等底物, 核酶还可 以同时具用信使编码功能和催化功能, 实现遗传信 息的复制、转录和翻译, 是生命化过程中最简单、最 经济、最原始的、催化核酸自身复制和加工的方式。 可以根据核酶核酸序列的高度特异性, 通过生化或 基因技术人工设计合成催化其自我切割和断裂的 核酸组成 , 根据病毒基因的全部序列, 设计并合成 出防治有这些病毒引起的人、畜和植物病毒病的核 酶, 如能够 防治流感、肝炎、艾滋 病和烟草 花叶病 等, 核酶也可以用来治疗某些遗传病和癌病, 还可 以用作研究核酸图谱和基因表达的工具[15] 。 2 2 抗体酶的设计
酶, 一大类以蛋白质为主体的生物催化剂, 具 有在常温常压和近中性 pH 等温和条件下, 高效率 地进行区域或对映体选择性催化的特点。迄今, 从 生物界已发现和定性了近 3000 种 酶, 分属氧化还 原、转移、水解、裂合、异构、连接六大酶类, 对许多 酶的纯化、结构、功能、动力学性 质获得了 深入了 解。随着对其不断深入的认识和社会发展的实际 需求, 酶的应用范围已遍及食品工业、农业、医药卫 生行业、环 保、能源开 发和生命科 学等各个 方面。 但在粗放的工业条件下, 例如高温、高压、重金属离 子、氧化剂、极端 pH 等, 天然酶常常会遭 到破坏, 从而使酶的生产和使用受到极大限制。目前工业 上直接利用酶 制剂时还存在 一些缺点, 如稳定性 差、使用效率低, 不能在有机溶剂中使用, 寿命不长 等, 造成了使用酶的成本升高。近年来, 特别是随 着蛋 白质工程的 ( protein engineering ) 应用, 即把分 子生物学、结构生物学、计算生物化学结合起来, 根 据蛋白质结构与功能关系的知识, 经过计算机辅助 的分子设计, 按照人类的需要, 产生性能优良的酶 分子, 本文根据国际酶工程研究和国内外酶工程产 业的现状、发展趋势, 结合现今国际上相关的工作 进展, 从酶分子设计改造、人工合成与工程应用的 角度, 进行分析、总结、展望, 旨在为酶工程的研究 及应用提供一些技术思路、模式和策略。
库中筛选出来一组突变基因人为进化, 还可以将具 有结构同源性的几种基因进行体外重组, 共同进化 出一种 新的蛋白质。DNA shuffling 的基本 过程如变和中性突变, 同 时也可实 现目的蛋 白质多种 特性的共 进化[ 7~ 11] 。
第8 期
朱 俊晨 等: 酶的分子设计、改造与工程应用
33
同时, 由于已有的结构与功能相互关系的信息远远 不能满足当今人们对蛋白质新功能的要求, 因此目 前采用体外分子定向进化的方法来改造酶蛋白的 研究越来越多, 并已在短短几年内取得了令人瞩目 的成就。
了一个赋 予宿主 细胞 对头 孢霉 素抗性 性能 提高 16 000倍的突变体。近年来, 在 DNA shuffling 的基 础上又延伸出了以下新技术:
固定化酶因 其优越 性而在药 物生产、临床诊
断、发酵及食品工程、分析生物技术等领域应用十 分广泛。但是, 在大多数情况下, 酶固定化以后由 于酶蛋白通过几种氨基酸残基在固定化载体上的 附着( attachment) 造成活性部分或全部失去, 引起了 固定 化 酶 蛋 白 无 序 的 定 向 和 结 构 变 形 的 增 加
( 1) Family shuffling 当 DNA shuffling 用来重组一 系列进化上相关的基因时, 就称为 Family shuffling。 一个突出的例子是, 当将 4 种头孢菌素酶基因进行 Family shuffling 时, 酶活最高可增加 540 倍, 而单基 因 shuffling 只增加 8 倍。
( 图 3a) 。现在的新技 术已经寻找到几 条不同的途 径应用于酶蛋白的固定化, 使酶蛋白能够以有序方 式附着在载体的表面, 实现酶的定向固定化而使酶 活性的损失降低到最小 程度( 图 3b) , 涉及的定向 固定化方法有如下几种: ( 1) 借助化学方法的位点 专一性 固定化; ( 2) 磷蛋 白的位点专一 性固定化; ( 3) 糖蛋白的位点专一性固定化; ( 4) 抗体( 免疫球 蛋白) 的位点专一固定化。
模拟酶相比, 抗体酶已经用于酶作用机理的研究, 手性药物的合成和拆分, 抗癌药物的制备。目前人 们正致力于进一步提高抗体酶的催化效率, 期望在 深入了解酶的作用机理, 以及抗体和酶的结构和功 能的基础上, 能够真正按照人们的意愿, 构建出具 有特定催化活性和专一性的、催化效率高的、能满 足各种用途需要的抗体酶。
定点突变技术可以随心所欲地在已知 DNA 序 列中取代、插入或缺失一定长度的核苷酸片段。该 方法与使用化学因素、自然因素导致突变的方法相 比, 具有 突变 率高、简单 易行、重 复性 好的 特点。 图 1为 overlap extension PCR 介导定点突变的基本过 程, 其中 C 和 D 是相互匹配、并含有特定突变点的 一对引物。利用定点突变技术对天然酶蛋白的催 化性质、底物特异性和热稳定性等进行改造已有很 多成功的实例[ 2~ 6] , 酶性质随着经定点突变而改变 如表 1 所示 , 然而, 定点突变技术只能对天然酶蛋 白中少数的氨基酸残基进行替换, 酶蛋白的高级结 构基本维持不变, 因而对酶功能的改造较为有限。
内酰胺酶 二氢叶酸还原酶
51 70~ 71 70~ 71
27
苏!丙
苏!脯 丝, 苏 ! 苏, 丝 苏, 丝 ! 丝, 丝
天冬 ! 天胺
对底物 ATP 的新合力 提高 100 倍
完全失活
恢复活性 活性降低为正 常酶的 0 1%
1 2 DNA shuffling DNA shuffling 方法 不仅可以对从随 机突变文
( 4 ) 临 时 模 板 随 机 嵌 合 生 长 ( random chimeragenesis on transient templates, RACHITT ) [ 14] 。
34
中 国生 物 工 程 杂 志
第 24 卷
RACHITT 技术是与 DNA shuffling 概念上明显不同 的、改进的基因家族改组技术。它不包括热循环、 链转移或交错延伸反应, 而是将随机切割的基因片 段杂交到一个临时 DNA 模板上进行排序、修剪、空 隙填补和连接的过程。其中的悬垂切割步骤可使 比 DNase 消化片段更短的短片段得以重组, 明显提 高重组的频率和密度。
此外, 融合蛋白技术的发展也为酶固定空间取 向的控制提供了 新的方法。FMN: NAD( P ) H 氧化 还原酶( FMN: NAD( P) H oxidoreductase) 和荧光素酶 ( luciferase) 是 催 化细 菌生 物 发 光的 两 种 酶。Min 等[ 16] 将生物素 羧化载体蛋白 ( biotin carboxy carrier protein, BCCP) 分别 融合 在荧 光素 酶 和 FMN: NAD ( P) H 氧化还原酶的 N 末端, 通过生物素( biotin) 和 亲和素 ( avidin) 的相互作用, 将这两个体内生物素 化的融合蛋白定向固定在亲和素包被的琼脂糖颗