分子生物学基因工程和基因体外表达
分子生物学名词解释
分子生物学：从广义来讲，分子生物学是从分子水平阐明生命现象和生物学规律的一门新兴的边缘学科。
它主要对蛋白质及核酸等生物大分子结构和功能以及遗传信息的传递过程进行研究。
DNA重组技术:DNA重组技术（又称基因工程）是将DNA片段或基因在体外经人工剪接后，按照人们的设计与克隆用载体定向连接起来，转入特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生影响受体细胞的新的遗传性状。
信号转导:是指外部信号通过细胞膜上的受体蛋白传到细胞内部，并激发诸如离子通透性、细胞形状或其它细胞功能方面的应答过程。
转录因子:是指一群能与基因5′端上游特定序列专一结合，从而保证目的基因以特定强度在特定时间和空间表达的蛋白质分子。
功能基因组：又称后基因组，是在基因组计划的基础上建立起来的，它主要研究基因及其所编码蛋白质的结构和功能，指导人们充分准确地利用这些基因的产物。
结构分子生物学:就是研究生物大分子特定空间结构及结构的运动变化与其生物学功能关系的科学。
生物信息学：是生物科学和信息科学重大交叉的前沿学科，它依靠计算机对所获得数据进行快速高效计算、统计分类以及生物大分子结构功能的预测。
染色体：是指存在于细胞核中的棒状可染色结构，由染色质构成。
染色质是由DNA、RNA和蛋白质形成的复合体。
染色体是一种动态结构，在细胞周期的不同阶段明显不同。
C-值（C-value）:一种生物单位体基因组DNA的总量。
C-值矛盾（C-value paradox）：基因组大小与机体的遗传复杂性缺乏相关性。
核心DNA（core DNA）：结合在核心颗粒而不被降解的DNA。
连接DNA（linker DNA）：重复单位中除核心DNA以外的其它DNA。
DNA多态性：指DNA序列中发生变异而导致的个体间核苷酸序列的差异，主要包括单核苷酸多态性和串联重复序列多态性两类。
DNA的一级结构：是指4种核苷酸的排列顺序，表示了该DNA分子的化学组成。
又由于4种核苷酸的差异仅仅是碱基的不同，因此又是指碱基的排列顺序。
现代分子生物学重点
现代分子生物学1、DNA重组技术：又称基因工程,是将DNA片段或基因在体外经人工剪接后,按照人们的设计与克隆载体定向连接起来,在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达,产生影响受体细胞的新的遗传性状。
2、基因组：指某种生物单倍染色体中所含有的基因总数,也就是包含个体生长、发育等一切生命活动所需的遗传信息的整套核酸。
3、功能基因组：又称后基因组，是在基因组计划的基础上建立起来的，它主要研究基因及其所编码蛋白质的结构与功能，指导人们充分准确地利用这些基因的产物。
1、简述分子生物学的基本含义：从广义来讲:分子生物学是从分子水平阐明生命现象和生物学规律的一门新兴的边缘学科。
它主要对蛋白质和核酸等生物大分子结构和功能以及遗传信息的传递过程进行研究。
从狭义来讲：分子生物学的范畴偏重于核酸（或基因）的分子生物学，主要研究基因或DNA的复制、转录、表达和调节控制等过程，当然其中也涉及到与这些过程有关的蛋白质与酶的结构和功能的研究2、早期主要有那些实验证实DNA是遗传物质？写出这些实验的主要步骤主要是两个实验：肺炎链球菌转化实验和噬菌体侵染细菌实验步骤：肺炎链球菌转化实验首先将光滑型致病菌（S型）烧煮杀灭活性以后再侵染小鼠，发现这些死细菌自然丧失了治病能力，再用活的粗糙型细菌（R型）来侵染小鼠，也不能使之发病，因为粗糙型细菌天然无治病能力。
讲经烧煮杀死的S型细菌和活的R型细菌混合在感染小鼠时，实验小鼠都死了，解剖小鼠，发现有大量活的S型（而不是R型）细菌，推测死细菌的中的某一成分转化源将无治病力的细菌转化成病原细菌。
噬菌体侵染细菌的实验：用分别带有S标记的氨基酸和P标记的核苷酸的细菌培养基培养噬菌体，自带噬菌体中就相应的含有S标记的蛋白质或P标记的核酸，分别用这些噬菌体感染没有被放射性标记的细菌，经过1~2个噬菌体DNA复制周期后发现，子代噬菌体中几乎不含带S标记的蛋白质，但含有30%以上的P标记，这说明在噬菌体传代过程中发挥作用的可能是DNA，而不是蛋白质。
分子生物学
名词解释：1.操纵子：原核生物基因的一个基本转录单位，由编码序列及上游的调控序列组成。
编码序列通常包括几个功能相关的结构基因，调控序列由启动序列（启动子）、操纵序列（操纵基因）及其他调节序列构成。
2.顺式作用元件：真核基因表达时调控转录过程的特殊DNA序列，与转录因子结合而起作用，通常包括启动子、增强子、沉默子等。
3.反式作用因子：与其他基因的顺式作用元件结合，调节基因转录活性的蛋白质因子，根据功能不同可分为基本转录因子和特异性转录因子。
4.启动子：位于结构基因上游，与RNA聚合酶识别，结合的特异性DNA序列，与基因转录起始有关。
5.同源重组：是指发生在同源序列间的重组，它通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。
又称基本重组。
6.DNA克隆：指在体外对DNA分子按照既定目的和方案进行人工重组，将重组分子导入适当细胞内，使其在细胞内扩增和繁殖，从而获得该DNA分子大量拷贝的过程称为分子克隆，又叫基因克隆或重组DNA技术。
7.基因工程：在体外将目的基因和载体DNA按照既定的目的进行人工重组，并将重组体导入宿主细胞，经过无性生殖和表达得到所需的核酸、蛋白质或生物新品种。
包括转基因动物、植物、基因工程生产药物、基因诊断、基因治疗等。
8.限制性核酸内切酶：一类能够识别和切割双链DNA分子内特定的碱基顺序的核酸水解酶，绝大多数是从原核细胞中提取的，可分三大类，其中II型是分子克隆中最常用的工具酶。
9.PBR322：是研究最早、最清楚的质粒，其全部顺序为4363bp，含有一个复制原点，一个Amp和Tet标记，有限制酶酶切位点，可供外源性基因插入，利用这种遗传标记，有利于筛选出重组转化菌10.gDNA文库：基因组DNA文库，是指存在于转化菌内、由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合。
它涵盖了基因组全部遗传信息。
11.cDNA文库：细胞总mRNA的克隆，文库只包含表达蛋白质或多肽的基因。
分子生物学-名词解释
名词解释：核酸结构，性质与功能分子生物学:是从分子水平研究生命现象、生命的本质、生命活动及其规律的科学。
医学分子生物学:是从分子水平研究人体在正常和疾病状态下生命活动及其规律的一门科学。
它主要研究人体生物大分子和大分子体系的结构、功能、相互作用及其同疾病发生、发展的关系。
基因：是核酸分子中贮存遗传信息的遗传单位，是指DNA特定区段，是RNA和蛋白质相关遗传信息的基本存在形式。
大部分生物中构成基因的核酸是DNA, 少数生物（如RNA病毒）是RNA。
核酸的一级结构：核酸中核苷酸的排列顺序。
组成DNA分子的脱氧核糖核苷酸(dAMP, dGMP, dTMP, dCMP)的排列顺序。
组成RNA分子的核糖核苷酸(AMP, GMP, UMP, CMP)的排列顺序。
由于核苷酸间的差异主要是碱基不同，所以也称为碱基序列。
DNA的一级结构：四种脱氧核糖核苷酸(dAMP, dGMP, dTMP, dCMP)或四种碱基的排列顺序。
DNA三级结构：DNA分子在形成双螺旋结构的基础上，进一步折叠成超螺旋结构(supercoil) (原核细胞)，或在蛋白质的参与下，进行精密的包装(真核细胞)，所形成的空间结构。
超螺旋结构(superhelix 或supercoil)：DNA双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构。
正超螺旋(positive supercoil)盘绕方向与DNA双螺旋方同相同；负超螺旋(negative supercoil)盘绕方向与DNA双螺旋方向相反。
结构基因：在基因片段中，贮存着一个特定的转录RNA分子的DNA序列，这段序列决定该RNA分子的一级结构，就称为结构基因。
外显子（exon):结构基因中在成熟RNA分子中保留的相对应的序列内含子(intron):是指RNA分子剪接时删除部分相对应的结构基因序列基因转录调控序列:与转录相关的、结构基因以外的序列启动子（promoter):是RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列，位于结构基因转录起始点的上游，偶见位于转录起始点的下游。
分子生物学考点整理1
分子生物学考点整理符广勇朱兰第一章．绪论一、分子生物学概念分子生物学是从分子水平研究生命本质为目的的一门新兴边缘学科，是研究核酸、蛋白质等所有生物大分子结构与功能相互关系的科学，是人类从分子水平上真正揭开生物世界奥秘、由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。
二、重组DNA技术又称基因技术，是20世纪70年代初兴起的技术科学，目的是将不同的DNA片段按照人们的设计定向连接起来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生影响受体细胞的新的遗传性状。
三、基因表达的调控基因表达的调控主要表现在信号传导研究、转录因子研究及RNA剪辑三个方面。
四、转录因子转录因子是能与基因5`端上游特定序列专一结合，从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。
第二章．染色体与DNA一、染色体上的蛋白质染色体上的蛋白质主要包括组蛋白和非组蛋白。
根据凝胶电泳性质可以把组蛋白分为H1、H2A、H2B、H3、H4。
这些组蛋白都含有大量的赖氨酸和精氨酸。
二、组蛋白的特性1．进化上的极端保守性不同种生物组蛋白的氨基酸组成是十分相似的，特别是H3、H4。
2.无组织特异性到目前为止，仅发现鸟类、鱼类及两栖类红细胞不含H1而带有H5，精细胞染色体的组蛋白是鱼精蛋白这两个例外。
3．肽链上氨基酸分布的不对称性碱性氨基酸集中分布在N端的半条链上。
4.组蛋白的修饰作用包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化及ADP核糖基化。
5.富含赖氨酸的组蛋白H5三、HMG蛋白叫高迁移率蛋白四、真核细胞DNA序列的分类1.不重复序列2.中度重复序列3.高度重复序列重复序列的意义：若某一重复序列出现错误，对基因的影响不大，稳定性较高；在短时间内可同时产生大量的基因产物。
重复序列的应用:应用于分子标记的作用：卫星DNA（便于分子标记）和微卫星DNA五、真核生物基因组与原核生物基因组的区别1.真核基因组庞大，原核生物基因组小2.真核基因组存在大量的重复序列，原核基因组没有重复序列3.真核基因组大部分是非编码序列，原核基因组大多是编码序列4.真核基因组的转录产物为单顺反子，原核基因组转录产物多为多顺反子5.真核基因是断裂基因，有内含子结构，原核基因为连续基因，几乎没有内含子结构6.真核基因组存在大量的顺式作用原元件，包括启动子、增强子和沉默子等，原核基因组基本没有增强子和沉默子7.真核基因组存在大量的DNA多态性，原核基因组很少有8.真核基因组具有端粒结构，原核基因组没有端粒结构六、重叠基因（Overlapping gene）指两个或两个以上的基因共有一段DNA序列，或是指一段DNA序列成为两个或两个以上的基因的组成部分。
PCR技术在分子生物学中的应用
PCR技术在分子生物学中的应用PCR（聚合酶链式反应）是一种基于DNA复制的体外扩增技术，它在分子生物学领域具有广泛的应用。
PCR技术通过利用DNA的天然复制机制，实现快速、精确、可靠的DNA扩增。
本文将介绍PCR技术在分子生物学研究中的重要应用。
一、基因突变检测与基因诊断PCR技术在基因突变检测与基因诊断中扮演着重要角色。
通过设计特异性引物，PCR可以选择性地扩增感兴趣的基因片段，从而检测基因突变的存在。
该技术对早期肿瘤、遗传性疾病等的诊断具有重要的意义。
例如，在乳腺癌诊断中，通过PCR技术可以检测BRCA1/2基因的突变，从而指导病人的治疗方案选择。
二、基因克隆与基因工程PCR技术在基因克隆与基因工程中也有广泛应用。
通过PCR扩增目标基因序列，可以获得大量目标DNA片段。
这些扩增的目标基因片段可以用来进行基因克隆、表达载体构建和基因突变等实验操作。
PCR技术的快速和高效，极大地推动了基因工程的发展。
三、DNA测序与基因组学研究PCR技术在DNA测序和基因组学研究中发挥着重要作用。
在DNA 测序中，PCR可以扩增目标片段，使其达到测序所需的起始浓度。
此外，PCR技术还可以用于扩增低浓度的目标DNA，从而增加测序结果的可靠性。
在基因组学研究中，PCR技术可以用于扩增DNA序列的特定区域，进而研究基因组的结构和功能。
四、病原体检测与疾病诊断PCR技术在病原体检测和疾病诊断中有着广泛的应用。
通过针对特定病原体的基因序列设计引物，PCR可以迅速检测到病原体的存在。
这种迅速、敏感的检测方法对于疾病的早期发现和治疗具有重要意义。
例如，在新型冠状病毒检测中，PCR技术被广泛应用于特异性检测病毒的基因序列。
五、分子人类学与亲子鉴定PCR技术在分子人类学和亲子鉴定中的应用也非常重要。
通过PCR 扩增人类基因组的特定区域，可以比较个体之间的遗传差异，从而揭示人类的遗传多样性与进化。
此外，PCR技术也可用于亲子鉴定，通过比较孩子和父母之间的基因序列差异，确定双亲关系。
基因工程的手段
基因工程的手段
基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。
基因工程的手段主要包括以下几种：
1.基因克隆技术：这是基因工程的基础技术之一，通过将某个有
意义的DNA片段插入到载体DNA上，形成重组DNA分子，再将其导入细胞中，使细胞表达出与该DNA片段相关的功能蛋白
质。
2.基因敲除技术：利用RNA干扰或CRISPR/Cas9技术，将目标基
因的DNA序列进行改变或剪切，使其失去功能。
这种技术可以用于研究基因的功能，也可以用于治疗某些遗传性疾病。
3.基因编辑技术：这是近年来发展迅速的一种基因工程技术，主
要包括CRISPR/Cas9系统和锌指核酸酶技术等。
这些技术可以在基因组内进行精确的修改，包括插入、删除或替换特定的
DNA序列。
4.基因转移技术：将外源基因导入到受体细胞中，使其表达并产
生相应的效应。
这种技术可以用于改良作物品种、生产药物和疫苗等。
除了以上几种主要的基因工程技术外，还有一些辅助性的技术手段，如PCR技术、凝胶电泳技术、基因测序技术等，这些技术为基因工程的实施提供了重要的支持和保障。
需要注意的是，基因工程技术虽然具有巨大的潜力和应用价值，但同时也存在一定的风险和挑战。
因此，在应用基因工程技术时，需要严格遵守伦理和法规要求，确保技术的安全性和可控性。
第十章外源基因表达和基因工程药物
（二）顺式作用原件（启动子、增强子和沉默子） 直接影响基因表达活性 （三）转录因子的调控 （四）真核生物在转录后仍可控制mRNA的结构和 功能，其在转录后层次不同于原核生物
目标蛋白性质
是否需要糖基化
三维结构复杂程度
是
否
简单结构
真核表达 系统
原核表达 系统
复杂的三维结构
• 目的：针对难以或无法从自然界直接提取、 分离、纯化所获得的，或制造成本、产量 规模等受限制的，或利用化学方法无法合 成的多肽，蛋白质、酶这类生物分子药物， 利用细胞或组织或器官或生命体的复制、 转录、翻译及其调控系统以及翻译后加工、 修饰等体系，按人的意愿生物合成这些生 物分子，并从中将表达产物分离纯化至预 期程度，最终加工成药品。
测序；表达图谱 4. 法医—犯罪现场标本分析 5. 肿瘤—各种肿瘤检测 6. 其他……
二、目的基因与表达载体的重组
• 重组载体的构建：对目的基因和载体DNA 进行剪切、修饰，在连接酶的作用下连接 形成完整有复制能力的重组体。
（一）载体
• 对于外源基因的表达，第二个问题就是选 择合适的表达载体并将目的基因重组至表 达载体上。
第十章外源基因表达与基 因工程药物
第一节 概 述
• 外源基因的表达：利用细胞内相关酶系及其调控 系统，将外源基因转录成肽链或加工成活性蛋白 质的过程。
• 具体的说，利用分子生物学技术，在体外将编码 外源蛋白质的基因重组至适宜的表达载体上，通 过相关技术将其导入宿主细胞内，借助宿主细胞 的转录、翻译或翻译后修饰酶系及相应的调控系 统，在宿主细胞合成或分泌具有原有生物活性的 蛋白质。
• 目的基因和载体DNA分子的体外重组关键 在于：选择合适的重组位点、剪切位点； 以及剪切后适当的条件将目的基因和载体 DNA分子连接获得重组分子。
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2. DNA 聚合酶Ⅰ大片段
(large fragment of DNA polymerase I)
DNA聚合酶I用枯草杆菌蛋白酶(subtilisin) 裂 解后产生的大片段，这个片段也称为Klenow 片 段（Klenow fragment ）。
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(五) 病毒载体
逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、 EB 病毒等作为基因转移的载体。多数病毒 载体均已质粒化，病毒载体质粒主要由病 毒启动子、包装元件、选择性遗传标记， 以及pBR322 的复制子组成。
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二、表达载体
(一) 原核表达载体
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( 二) λ 噬菌体
噬菌体(bacteriophage, phage) 是感染细菌 的病毒， 用作克隆载体的噬菌体有两种。
λ噬菌体 M13噬菌体
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λZiplox 载体
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(三)黏性质粒（cosmid ）
end ）。 如EcoR Ⅰ切割后产生5ˊ黏性末端：
5 -GAATTC-3 ' 3 ?-CTTAAG-5 '
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5 -G
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
AATTC-3
3 -CTTAA
G-5
6
PstⅠ切割后产生3ˊ黏性末端：
5 ?-CTGCAG -3 ? 3 ?-GACGTC -5 ?
5 ?-CTGCA
G -3 ?
能去除DNA或RNA 5ˊ端的磷酸根。制备 载体时，用碱性磷酸酶处理后，可防止载体自 身连接，提高重组效率。
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6. 末端脱氧核苷酸转移酶
（terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT )
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Ⅱ型 有 无 特异 可知、固定
Ⅲ型 有
有 特异 识别位点附近切割DNA ， 切割位点很难预测。
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2．限制性内切酶的命名
EcoR Ⅰ E代表Escherichia 属 co代表coli 种 R 代表RY13 株
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3．限制性内切酶的识别和切割位点
通常是 4 ～ 6 个碱基对、具有回文序列 （palindrom ）的DNA片段，大多数酶是错位 切割双链 DNA，产生 5ˊ或3ˊ黏性末端（ sticky
表达载体中含有复制起始位点、抗性基 因 、克隆位点 、启动子 、核糖体结合位点和 转录终止信号。
第二节 基因克隆的载体
载体是携带目的基因，使其在宿主细 胞内复制或表达的DNA分子。
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一、常用的克隆载体
(一)质粒（plasmid ） 是存在于多数细菌和某些真核生物染
色体外的双链环状的DNA分子。一般只能 容纳小于10 kb 的外源DNA片段。
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作为克隆载体的质粒应具备下列特点：
是由λ噬菌体的黏性末端（ cos区）与质 粒重新构建的载体，为双链、环状 DNA。其 克隆容量可达40～50 kb 。
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(四) M13噬菌体 (M13 phage)
一种大肠杆菌雄性特异丝状噬菌体。 感染细菌 后，经过复制转变为双链的复制型（ RF ）。复制型 M13 可用作克隆载体。
（1）分子量相对较小，能在细菌内稳定存 在，有较高的拷贝数。
（2）具有一个以上的遗传标志，便于对宿主
细胞进行选择，如抗生素抗性基因，
β-半乳糖苷酶基因（Lac Z）等。 （3）具有多个限制性内切酶的单一切点，便
于外源基因的插入。
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5ˊ→3ˊ聚合酶活性 3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性 无5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性
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Klenow片段的主要用途有：
(1) 补齐双链DNA 的3ˊ末端。
(2) 通过补齐3ˊ端，使3ˊ末端标记。
5ˊ-G-OH 3ˊ-CAATT-OH
Klenow
d *ATP,dTTP
5ˊ-GTT*A*A-OH 3ˊ-CAA T T-OH
第八章 基因工程与体外表达
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基因工程是指在体外对 DNA分子按 照既定的目的和方案，对 DNA进行剪切和 重新连接，然后把它导入宿主细胞，从而 能够扩增有关 DNA片段，表达有关基因产 物，进行 DNA序列分析，基因治疗，研究 基因表达的调节因子，以及研究基因的功 能等。
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4. T4 DNA连接酶（T4 DNA ligase ）
催化双链 DNA 一端 3ˊ-OH 与另一双链 DNA的5ˊ端磷酸根形成 3ˊ→5ˊ磷酸二酯键， 使具有相同黏性末端或平端的 DNA两端连接 起来。
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5. 碱性磷酸酶（alkaline phosphatase ）
(3) 在cDNA 克隆中，第二股链的合成。
(4) DNA 序列分析。
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3. 逆转录酶（reverse transcriptase）
一种RNA 依赖的DNA聚合酶，即以RNA 为模板合成DNA， 合成方向为5ˊ→3ˊ延伸，无 3ˊ→5ˊ外切酶活性。
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第一节 基因克隆的工具酶
一、限制性核酸内切酶 （restriction endonuclease ） 从双链 DNA内部特异位点识别并且裂
解磷酸二酯键。
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1. 限制性核酸内切酶的特点
类型 限制性 修饰作用 识别位点
切割位点
Ⅰ型 有 有 特异 识别位点下游100 到1000bp
3 ?-G
ACGTC -5 ?
有一些酶沿对称轴切断DNA，产生平端或 钝端（Blunt end ）, 如Sma Ⅰ：
5 ?-CCCGGG -3 ? 3 ?-GGGCCC -5 ?
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5 ?-CCC 3 ?-GGG
GGG -3 ? CCC -5 ?
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二、其他常用的工具酶
1. DNA聚合酶Ⅰ (DNA polymerase I)