南京林业大学酶工程期末考试重点生物技术专业

1、酶的特点和米氏方程式的推导。

酶是生物体内进行新陈代谢不可缺少的受多种因素调节控制的具有催化能力的生物催化剂。

酶催化作用特点：（一）酶和一般催化剂的共性：①用量少而催化效率高；②不改变化学反应的平衡点；③可降低反应的活化能。

（二）酶作为生物催化剂的特点：①用量少而催化效率高；②专一性高；③反应条件温和；④可调节性。

2、米氏常数的测定和意义。

答：测定：基本原则：将米氏方程变化成相当于y=ax+b的直线方程，再用作图法求出Km。

意义：①当v=Vmax/2时，Km=[s](Km的单位为浓度单位)。

②是酶在一定条件下的特征物理常数，通过测定Km的数值，可鉴别酶。

③可近似表示酶和底物亲和力，Km愈小，E对S的亲和力愈大；Km愈大，E对S的亲和力愈小。

④在已知Km的情况下，应用米氏方程可计算任意[S]时的V，或任意V下的[S]（用Km的倍数表示）。

3、可逆抑制的种类和判别。

答：①竞争性抑制：某些抑制剂的化学结构与底物相似，因而能与底物竟争与酶活性中心结合。

当抑制剂与活性中心结合后，底物被排斥在反应中心之外，其结果是酶促反应被抑制了。

特点：Km变大，酶促反应速度减小；②非竞争性抑制：酶可同时与底物及抑制剂结合，引起酶分子构象变化，并导至酶活性下降。

由于这类物质并不是与底物竞争与活性中心的结合，所以称为非竞争性抑制剂。

特点：Km虽然不变，但由于Vmax减小，所以酶促反应速度也下降了；③反竞争性抑制：抑制剂仅能与酶底物复合物结合，但ESI不能转化为产物P 。

特点：Km变小，Vmax减小，斜率不变。

4、酶的分类和命名。

答：分类：氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、合成酶。

系统名：包括所有底物的名称和反应类型。

推荐名：只取一个较重要的底物名称和反应类型。

对于催化水解反应的酶一般在酶的名称上省去反应类型。

酶系统编号：采用四码编号方法，第一个号码表示该酶属于6大类酶中的某一大类，第二个号码表示该酶属于该大类中的某一亚类，第三个号码表示属于亚类中的某一小类，第四个号码表示这一具体的酶在该小类中的序号。

每个号码之间用圆点（﹒）分开。

5、酶活单位和酶活测定。

答：酶活单位：①酶活单位U：在一定条件下，一定时间内将一定量的底物转化为产物所需的酶量。

（浓度/时间）②国际酶活力单位IU：在最适条件下，每分钟内催化1umol底物转化为产物所需的酶量。

1972年定为1kat单位：每秒钟能催化1mol底物转化为产物所需的酶量。

1kat=60×106IU。

③酶的比活力：用每mg蛋白质所含酶活力单位数，比活愈大，纯度愈高。

比活力＝酶活力U/mgPr＝总活力U/总蛋白mg酶活力测定的步骤：①根据酶催化的专一性，选择适宜的底物，并配制成溶液。

②根据酶的动力学性质，确定酶催化反应的温度PH值、底物浓度、激活剂浓度等反应条件。

③在一定的条件下，将一定量的酶液和底物溶液混合均匀，反应时间。

④运用各种生化检测技术，测定产物的生成量或底物的减少量。

注意：若不能即时测出结果的，则要及时终止反应，然后再测定。

6、酶活性中心的定义和部位。

答：酶活性中心：酶的特殊催化能力只局限在大分子的一定区域，也就是说，只有少数特异的氨基酸残基参与底部结合及催化作用。

这些特异的氨基酸残基比较集中的区域，即与酶活力直接相关的区域，称为酶的活性部位或活性中心。

活性部位：通常分为结合部位和催化部位，前者负责与底物的结合，决定酶的专一性；后者负责催化底物键的断裂形成新键，决定酶的催化能力。

对需要辅酶的酶来说，辅酶分子或辅酶分子上的某一部分结构，往往也是酶活性部分组成部分。

7、影响酶催化作用的有关因素。

答：①底物浓度：在低底物浓度时, 反应速度与底物浓度成正比，表现为一级反应特征；当底物浓度达到一定值，几乎所有的酶都与底物结合后，反应速度达到最大值（V max），此时再增加底物浓度，反应速度不再增加，表现为零级反应。

②PH：在一定的pH 下, 酶具有最大的催化活性,通常称此pH 为最适 pH；pH稳定性。

③温度：一方面是温度升高,酶促反应速度加快；另一方面,温度升高,酶的高级结构将发生变化或变性，导致酶活性降低甚至丧失；因此大多数酶都有一个最适温度。

在最适温度条件下,反应速度最大。

④酶浓度：在一个反应体系中，当[S]>>[E]反应速率随酶浓度的增加而增加（v=k[E]）,这是酶活测定的基础之一。

⑤抑制剂；⑥激活剂。

8、影响酶催化效率的有关因素答：（一）底物和酶的邻近效应与定向效应：酶和底物复合物的形成过程既是专一性的识别过程，更重要的是分子间反应变为分子内反应的过程。

这一过程包括：邻近效应和定向效应。

邻近效应是指酶与底物结合形成中间复合物后，使底物和底物（如双分子反应）之间，酶的催化基团与底物之间结合于同一分子而使有效浓度得以极大的升高，从而使反应速率大大增加的一种效应。

定向效应是指反应物的反应基团之间和酶的催化基团与底物的反应基团之间的正确取位产生的效应。

（二）底物的形变和诱导契合：当酶遇到其专一性底物时，酶中某些基团或离子可以使底物分子内敏感键中的某些基团的电子云密度增高或降低，产生“电子张力”，使敏感键的一端更加敏感，底物分子发生形变，底物比较接近它的过渡态，降低了反应活化能，使反应易于发生。

（三）酸碱催化：酸碱催化是通过瞬时的向反应物提供质子或从反应物接受质子以稳定过渡态，加速反应的一类催化机制。

在水溶液中通过高反应性的质子和氢氧离子进行的催化称为专一的酸碱性催化或狭义的酸碱催化；而通过H+和OH-以及能提供H+和OH-供体进行的催化称为总酸碱催化或广义的酸碱催化。

（四）共价催化：共价催化又称亲核催化或亲电子催化，在催化时，亲核催化剂或亲电子催化剂能分别放出电子或汲取电子并作用于底物的缺电子中心或负电中心，迅速形成不稳定的共价中间复合物，降低反应活化能，使反应加速。

（五）金属离子催化：金属离子以3种主要途径参加催化过程（1）通过结合底物为反应定向；（2）通过可逆的改变金属离子的氧化态调节氧化还原反应；（3）通过静电稳定或屏蔽负电荷。

（六）多元催化和协同效应（七）活性部位微环境的影响9、简述胰凝乳蛋白酶的催化反应机制。

答：胰凝乳蛋白酶选择裂解芳香族氨基酸如象Phe、Tyr羧基侧链。

其活性中心由Ser195、His57和Asp102组成。

在胰凝乳蛋白酶的催化反应中，组氨酸的咪唑基起着广义酸碱催化剂的作用，先促使Ser195的羟基亲核地附着到底物敏感肽键中的羧基原子上，形成共价的酰化中间物，在促进酰化的ES中间物上的酰基转移到水或其他的酰基受体（如醇、氨基酸等）上。

丝氨酸三残基（包括天冬氨酸和组氨酸）构成的活性中心的一部分。

组氨酸极化Ser侧链的羟基（去质子）。

底物存在时，His57侧链接受Ser195侧链羟基的质子。

因此His57是碱催化剂。

Ser195丢失氢离子，产生烷基氧离子。

烷基氧离子的亲核性比羟基大得多。

Asp102协助His57定位，通过氢键和静电相互作用使His57更能接受Ser195的质子。

10、酶活性的调节控制。

答：一、调节酶的浓度；二、通过激素调节酶活性；三、反馈抑制调节酶活性；四、抑制剂和激活剂对酶活性的调节；五、其他调节方式：通过别构调控、酶原的激活、酶的可逆共价修饰和同工酶来调节酶的活性。

11、协同效应：正协同效应：底物或调节物的结合大大增加了酶对后续底物分子的亲核性。

（S型曲线）负协同效应：底物浓度较小的范围内，酶活力上升很快，随后底物浓度虽有较大提高，但反应速率升高很小，表现为负协同。

（表现双曲线）同工酶：是指催化相同的化学反应，但其蛋白质分子结构、理化性质和免疫性能等方面都存在明显差异的一组酶。

酶的别构调节：酶分子的非催化部位与某些化合物可逆地非共价结合后发生构象的改变，进而改变酶活性状态，称为酶的别构调节。

1、写出谷氨酸发酵的最理想途径，说明CO2固定化反应的重要性。

答：途径：葡萄糖经糖酵解（EMP途径）和己糖磷酸支路（HMP途径）生成丙酮酸，再氧化成乙酰辅酶A（乙酰COA），然后进入三羧酸循环，生成α－酮戊二酸。

α－酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的催化及有NH4+存在的条件下，生成谷氨酸。

即，谷氨酸的生物合成途径包括EMP、HMP、TCA循环、DCA循环和CO2固定作用等。

重要性：体系中如果不存在CO2固定反应，则有：3/2 C6H12O6 + NH4+ == C5H9O4 N + 4 CO2 产率：147 /（180*3/2）== 54.4%体系中存在CO2固定反应，则有：C6H12O6 + NH4+ == C5H9O4 N + CO2 产率：147 / 180 == 81.7%可见，在GA的生物合成过程中，CO2固定反应对于产率的提高有着多么重要的作用。

实际上，发酵过程中不可能控制柠檬酸合成所需的C4二羧酸完全来自于CO2固定反应，体系也不可能完全不存在CO2固定反应，因此，GA 发酵的糖酸转化率应在：54.4%-81.7%。

2、谷氨酸产生菌之所以能够合成、积累并分泌大量的GA，其菌种内在的原因有哪些？答：①生物素缺陷型：谷氨酸产生菌大多数为生物素缺陷型,谷氨酸发酵时,通过控制生物素亚适量(贫乏量) ,引起菌种代谢失调, 使谷氨酸得到大量积累。

②具有CO2 固定反应的酶系：菌种能利用CO2 产生大量草酰乙酸, 有利于谷氨酸的大量积累。

③α-KGA脱氢酶酶活性微弱或丧失：体内α-KGA脱氢酶活性很低时，TCA循环才能够停止，α-KGA才得以积累，为谷氨酸的生成奠定物质基础。

④GA产生菌体内的NADPH氧化能力欠缺或丧失：NADPH 是α-KGA还原氨基化生成GA必须物质，而且该还原氨基化所需要的NADPH是与柠檬酸氧化脱羧相偶联的；由于NADPH的在氧化能力欠缺或丧失，使得体内的NADPH有一定的积累，NADPH对于抑制α-KGA的脱羧氧化有一定的意义。

⑤产生菌体内乙醛酸循环（DCA）的关键酶——异柠檬酸裂解酶：该酶是一种调节酶，或称为别构酶，其活性可以通过某种方式进行调节，通过该酶酶活性的调节来实现DCA循环的封闭，DCA 循环的封闭是实现GA发酵的首要条件。

糖的代谢才能沿着α - 酮戊二酸的方向进行, 从而有利于谷氨酸的积累。

⑥菌体有强烈的L-谷氨酸脱氢酶活性：α-KGA + NH4+ +NADPH == GA + NADP L-谷氨酸脱氢酶，实质上GA产生菌体内该酶的酶活性都很强，α—酮戊二酸易生成谷氨酸。

该反应的关键是与异柠檬酸脱羧氧化相偶联。

3、谷氨酸发酵过程中，生物素（V H）作用表现在那几个方面？答：GA 产生菌大都是生物素的营养缺陷型，即：VH-。

生物素对发酵的影响是全面的，在发酵过程中要严格控制其浓度。

（一）生物素对糖代谢的影响：①VH对于糖酵解有促进作用; ②对丙酮酸的有氧氧化——乙酰辅酶A的生成也有促进作用。