土壤脱氢酶活性的测定
实验一活性污泥和土壤脱氢酶活性的测定
环境生物技术实验一 活性污泥和土壤脱氢酶活性的测定一、实验目的了解活性污泥脱氢酶活性的测定原理及方法二、实验原理活性污泥和土壤中的微生物对于有机物的降解，实质上是微生物经过一系列的酶的催化作用下的生物氧化还原反应。
参加生物氧化的重要酶为氧化酶和脱氢酶二大类，参加生物氧化的重要酶为氧化酶和脱氢酶二大类，其中脱氢酶类尤为重要。
其中脱氢酶类尤为重要。
其中脱氢酶类尤为重要。
其中脱氢其中脱氢酶能使氧化有机物的氢原子活化并传递给特定的受氢体实现有机物的氧化和转化。
如果脱氢酶活化的氢原子被人为受氢体接受，就可以通过直接测定人为受氢体浓度的变化间接测定脱氢酶的活性，就可以通过直接测定人为受氢体浓度的变化间接测定脱氢酶的活性，表征生物表征生物降解过程中微生物的活性。
因此，脱氢酶的活性可以反映处理体系内活性微生物量以及其对有机物的降解活性，以评价降解性能。
解活性，以评价降解性能。
脱氢酶活性测定方法有MB.2H 定性分析法和TTC 比色法，目前用得较多的为氯化三苯基四氮唑（TTC ）比色法。
利用TTC 作为人为受氢体，其还原反应方程式如下：作为人为受氢体，其还原反应方程式如下：无色的TTC 受氢后变成红色的TF （三苯基甲月替），根据红色的深浅，测出相应的光密度（OD 值），从而计算TF 的生成量，求出脱氢酶的活性。
的生成量，求出脱氢酶的活性。
三、实验设备及药品1．紫外-可见光分光光度计、分析天平、50mL 离心管、50mL 具塞三角瓶、50mL 比色管、甲醛、丙酮、4mg/mL 的TTC 溶液（2，3，5-氯化三苯基四氮唑，分析纯）、10 %硫化钠（Na 2S 分析纯）、无氧水（0.36% 亚硫酸钠，分析纯）、连二亚硫酸钠( Na 2S 2O 4 ，分析纯)、Tris （三羟甲基氨基甲烷，分析纯） 2．活性污泥悬浮液或土壤悬浮液。
．活性污泥悬浮液或土壤悬浮液。
要点：(1) 所有操作应当尽量在避光条件下进行。
脱氢酶最适反应条件, 温度温度 30～37℃ , pH 值7.4～8.5。
土壤脱氢酶活性测定
土壤脱氢酶活性测定
测定步骤
1 称取4克鲜土于50ml三角瓶中，加入4ml（0.5%TTC+0.5%葡萄糖）-Tris缓冲溶液（pH7.6）,(2ml 1%TTC-Tris缓冲溶液，2ml 1%葡萄糖)，置37℃暗室培养24hr。
2 取出后用少量甲醇提取后过滤，再用50ml容量瓶或比色管定容。
3 滤液马上用485nm波长下分光光度计测定。
pH7.6 Tris缓冲液的配制：
A：0.2M三-（羟甲基）-氨基甲烷溶液（1000 ml含24.23克）
B：0.2M HCl
100 ml A+76.8ml B,加水稀释至400 ml，准确调节pH为7.6。
TBF标准曲线的制备：准确称取10mg TPF溶于250 ml甲醇中，得到40 mg/L 的母液。
从中吸取0，1，2，3，4，5 ml于50ml容量瓶中，用甲醇定容，得到0，40，80，120，160，200ug TPF的标准曲线。
参考文献
Casida LC Jr, Klein DA, Santoro T(1964) Soil dehydrogenase activity. Soil Science 98, 371-376.
H.Y.Chu, J.G.Zhu, Z.B.Xie, H.Y.Zhang, Z.H.Cao and Z.G.Li(2003) Effects of lanthanum on dehydrogenase activity and carbon dioxide evolution in a Haplic Acrisol. Australian Journal of Soil Research 41, 731-739.
H.Y.Chu,。
土壤酶指标测定
土壤酶指标测定土壤生物化学指标测定一、土壤脱氢酶(dehydrogenase)活性测定（比色法）（一）分析意义脱氢酶能酶促发展过氧化氢充分反映，它起至着氢的中间传达题的促进作用。
在土壤中，碳水化合物和有机酸的脱氢酶作用比较活跃，他们可以作为氢的工体。
脱氢酶能自基质中析出氢而进行氧化作用。
（二）方法挑选与原理lenhard(1956)最先明确提出用ttc做为氢的受体分解成红色的tf，入行闭塞测定，以溶液的光密度值表示酶活性。
后来对上述的方法搞了相同的改良和健全。
用土壤有机质做为氢的供体或用葡萄糖搞氢的供体，用分解成的tf数量或折算成氢的体积去则表示脱氢酶的活性。
（三）试剂配制1、0.5%ttc溶液2、甲苯3、tris-hcl缓冲液ph7.6：0.1m三羟甲基氨基甲烷（12.114g/l）50ml与0.1mhcl38.5ml混合后，用水稀释至100ml。
4、硫化钠5、0.1mol/l葡萄糖溶液。
（四）实验步骤1、标准曲线的绘制：称取相当于50mg纯品量的已烘干的ttc于50ml比色管中，定容，制成1mg/l的母液。
分别向6支50ml比色管中依次注入1、2、3、4、5、6mlmg/ml标准ttc溶液，用蒸馏水定容，是为工作液：取7只带塞比色管（50ml）依次加入2mltris-hcl演算缓冲液，1ml不同浓度的ttc工作液，1ml10%硫化钠新配溶液，摇匀，放置20分钟；反应完全后，准确加入10ml甲苯，振摇。
完全提取tf，稳定数分钟，取上层有机溶液在紫外分光光度计492nm处闭塞（在比色皿中也需稳定2分钟）绘制标准曲线。
2、操作过程：取0.5g新鲜土壤，置于50ml比色管中，依次加入2mltris-hcl盐酸缓冲液、1ml0.1mol/l葡萄糖溶液、1ml0.5%ttc溶液,震荡均匀，离心（4000转/分）5分钟后，将甲苯提取液在分光光度计492nm处闭塞测定。
同时设无土壤和无ttc的对照（以蒸馏水替代）。
脱氢酶活性检测在环境监测中的应用
脱氢酶活性检测在环境监测中的应用脱氢酶活性检测方法是一种常用于环境监测的生物学方法，其通过测量脱氢酶对底物的催化能力，来间接反映环境中某些特定污染物的浓度和毒性程度。
该方法具有高灵敏度、高选择性、快速、经济和可重复等优点，因此在环境监测中得到广泛应用。
第一，脱氢酶活性检测可用于监测水体中的污染物浓度。
水体中的有机物污染物，如苯、甲苯、二甲苯等可通过脱氢酶催化反应被氧化，从而反映水体中有机物污染物的存在及浓度。
环境中孕育潜在有毒性的有机物污染物，通过脱氢酶活性检测可以实时监测其浓度，从而及时采取措施，避免对水体生态及人类健康产生潜在危害。
第二，脱氢酶活性检测可用于监测土壤中的有毒物质浓度。
某些化学物质经分解产生的有毒物质，如重金属离子，可引起土壤中微生物群落的损伤，从而影响土壤肥力和生态系统的稳定性。
脱氢酶活性检测可通过测量土壤中微生物的脱氢酶活性，来评估土壤中有毒物质的毒性程度。
据此结果，可以采取相应的措施，如修复污染土地，保护生态环境。
脱氢酶活性检测可用于监测空气中的有机污染物浓度。
空气中存在大量的VOCs（挥发性有机化合物），例如苯类、醛类等，这些物质对人体和环境都有潜在危害。
脱氢酶活性检测可检测大气中VOCs的浓度，比传统的气相色谱-质谱联用（GC/MS）方法更快速、灵敏和经济。
脱氢酶活性检测在空气质量监测、工业废气排放等方面具有广阔的应用前景。
脱氢酶活性检测是一种可靠、灵敏的环境监测方法，具有广泛的应用前景。
在水体、土壤和空气等环境中，脱氢酶活性检测能够准确及时地反映污染物的浓度和毒性程度，为环境保护和生态修复提供重要参考依据。
这种方法的广泛应用将有助于建立更加全面和有效的环境监测体系，以保护环境质量和人类健康。
土壤活性测定实验报告
一、实验目的1. 了解土壤活性的基本概念和测定方法。
2. 掌握土壤酶活性的测定原理和操作步骤。
3. 通过实验，了解土壤酶活性与土壤肥力的关系。
二、实验原理土壤活性是指土壤中微生物、植物、动物等生物体及其代谢产物的综合活性。
土壤酶活性是土壤活性的重要指标，可以反映土壤中生物体的代谢能力和土壤肥力状况。
本实验通过测定土壤酶活性，了解土壤活性水平。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：土壤样品、过氧化氢酶、磷酸酶、脲酶、蛋白酶、转化酶、脱氢酶等试剂。
2. 实验仪器：恒温水浴锅、pH计、分光光度计、滴定管、移液管、烧杯、试管等。
四、实验方法1. 土壤样品的采集与处理采集不同类型土壤样品，过筛后，置于4℃冰箱中保存。
2. 土壤酶活性的测定（1）过氧化氢酶活性测定原理：过氧化氢酶催化过氧化氢分解，产生水和氧气。
通过测定氧气的产生量来计算过氧化氢酶活性。
操作步骤：①配制过氧化氢酶反应液：取一定量的土壤样品，加入一定量的磷酸盐缓冲液，混匀，置于4℃冰箱中保存。
②取一定量的过氧化氢酶反应液，加入一定量的过氧化氢，在恒温水浴锅中反应一段时间。
③用分光光度计测定反应液的吸光度，根据标准曲线计算过氧化氢酶活性。
（2）磷酸酶活性测定原理：磷酸酶催化磷酸苯二钠水解，产生酚和磷酸。
通过测定酚的产生量来计算磷酸酶活性。
操作步骤：①配制磷酸酶反应液：取一定量的土壤样品，加入一定量的磷酸盐缓冲液，混匀，置于4℃冰箱中保存。
②取一定量的磷酸酶反应液，加入一定量的磷酸苯二钠，在恒温水浴锅中反应一段时间。
③用分光光度计测定反应液的吸光度，根据标准曲线计算磷酸酶活性。
（3）脲酶活性测定原理：脲酶催化尿素水解，产生氨和二氧化碳。
通过测定氨的产生量来计算脲酶活性。
操作步骤：①配制脲酶反应液：取一定量的土壤样品，加入一定量的磷酸盐缓冲液，混匀，置于4℃冰箱中保存。
②取一定量的脲酶反应液，加入一定量的尿素，在恒温水浴锅中反应一段时间。
③用滴定法测定氨的产生量，根据标准曲线计算脲酶活性。
土壤脱氢酶活性的测定
土壤脱氢酶活性的测定一、实验原理脱氢酶的正式命名是AH：B氧化还原酶，广泛存在于动植物组织和微生物细胞内，它能酶促一定的基质中脱出氢而进行氧化作用。
脱氢酶的种类因电子供给体和接受体的特异性而有不同。
单位时间内脱氢酶活化氢的能力表现为它的酶活性。
通过测定土壤中微生物的脱氢酶活性，可以了解微生物对土壤中有机物的氧化分解能力，即土壤酶的活性。
已知受氢体可接受脱氢酶脱出的氢原子，根据接收氢原子的量可以判断脱氢酶的活性。
如无色的氯化三苯基四氮唑（TTC，俗称红四唑）接受氢后变成红色的三苯基甲瓒（TF），根据产生红色的色度进行比色定量分析，就可以判断脱氢酶的活性。
通常，吸光度越大（红色越深），脱氢酶活性越大。
二、实验材料、试剂和仪器1．材料：过0.9mm孔径筛的土壤样品，8g2．试剂：0.36%Na2SO3溶液，15mlTris-HCl缓冲液（PH=7.6），45ml0.4%TTC,7.6mlNa2S2O4，十几粒甲醛，10ml丙酮，20ml3．仪器：50ml具塞比色管，6只比色管架，1只1~5ml移液枪，1只（枪头3个）100~1000ul移液枪1只（枪头1个）药匙1个水浴锅1个分光光度计1台分析天平1台离心管4只培养箱1台离心机1台三、实验步骤1．标准曲线的绘制（1）按下表配制系列浓度的TTC标准溶液。
（2）显色。
用药匙向每只比色管中各加入少许连二亚硫酸钠（Na2S2O4），混匀，使TTC 全部还原为红色的TF。
用1~5ml移液枪向各管滴加1ml甲醛终止反应，摇匀后再加入2ml丙酮震荡摇匀，37℃水浴10min。
（3）测定吸光度，绘制标准曲线。
在485nm波长下测定各管溶液的吸光度A，并以A为纵坐标，TTC浓度为横坐标，绘制出TTC标准曲线。
2．土壤脱氢酶活性的测定（1）培养并显色（此步骤由助教预先完成）。
首先，按下表向四只离心管中分别加入以下物质然后，将以上四只离心管避光，37℃保温培养12~24h。
脱氢酶活性测定实验报告
脱氢酶活性测定实验报告TTC标准曲线的绘制：TTC浓度(ug/mL) 8 16 24 32 40 吸光值A 0.041 0.186 0.298 0.312 0.456土壤脱氢酶的吸光值记录：编号 1 2 3 平均吸光值A 0.145 0.167 0.186 0.166由标准曲线可得相应TTC浓度为：2.0314 ug/mL则土壤脱氢酶活性= ABC= 2.0314*18*1= 36.5652式中：A为查出的TTC浓度(ug/mL)；B为培养时间校正值(18h);C为比色时稀释倍数(1)。
思考题：1.影响脱氢酶活性的因素有哪些？答：pH：每种酶都有最适pH，在此pH下，酶活性最大；温度：酶活性随着温度的升高而增加，在最适温度时达到最高值，然后开始下降；激活剂：可以促进酶活性；抑制剂：会使酶活性降低；还有内因如底物浓度和酶浓度。
2.已知乳酸脱氢酶（LDH）在NAD+的递氢作用下，使乳酸脱氢生成丙酮酸。
丙酮酸在碱性溶液中与2,4-二硝基苯肼生成2,4-二硝基苯腙使溶液呈蓝色。
颜色的深浅与丙酮酸浓度成正比。
请设计一个测定动物肝脏乳酸脱氢酶活性的实验。
答：1，校正曲线的制作：（1）按下表操作：加入物(ml) B 1 2 3 4 5丙酮酸标准液0 0.025 0.05 0.1 0.15 0.2底物缓冲液0.5 0.475 0.45 0.4 0.35 0.3去离子水0.11 0.11 0.11 0.11 0.11 0.11二硝基苯肼0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5NaOH 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0相当于金氏单位0 125 250 500 750 1000（2）37度水浴15分钟，室温放置5min后，于440nm波长处比色，比色杯光径为1.0cm，用B管调零，读取各管吸光度。
以吸光度值为纵坐标，相应的酶活性单位为横坐标绘制校正曲线。
2，酶活性的测定：（1）加入物(ml) 测定管对照管血清0.01 0.01NAD＋底物缓冲液0.5 0.5（37度水浴5min）NAD＋溶液0.1 －（37度水浴15min）2,4二硝基苯肼0.5 0.5NAD＋溶液－0.1（37度水浴15分钟）0.4mol/L溶液 5.0 5.0（2）混匀，室温放置5min后，于440nm波长处比色，比色杯光径为1.0cm，用蒸馏水调零，读取各管吸光度。
脱氢酶活性检测方法及其在环境监测中的应用
内容介绍
基本原理
基本原理
TTC脱氢酶测定方法的基本原理是利用TTC盐（如TTC-CoA）作为底物，在脱 氢酶的作用下，将TTC盐还原成TTF，并通过比色法测定TTF的生成量。脱氢酶的 活性越高，底物的还原速度越快，生成的TTF也就越多。通过测量特定时间内TTF 的生成量，可以计算出脱氢酶的活性。
应用案例
应用案例
在医学领域，TTC脱氢酶测定方法可用于研究疾病的发病机制和药物治疗效果。 例如，通过对患者脱氢酶活性的检测，可以了解其体内代谢状态和生理功能，有 助于对疾病的诊断和治疗提供依据（具体案例略）。
应用案例
在农业领域，TTC脱氢酶测定方法可用于研究作物的生理特性和产量之间的关 系。通过测定不同品种作物脱氢酶的活性，了解其代谢状态和生理功能，为作物 品种的选育和栽培管理提供指导（具体案例略）。
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脱氢酶活性检测方法及其在环 境监测中的应用
01 引言
目录
02 脱氢酶活性检测方法
03 环境监测中的应用
04 案例分析
05 结论
06 参考内容
引言
引言
脱氢酶是生物体内一类重要的酶类，它们参与许多生物过程，如能量代谢、 物质转化等。脱氢酶活性的检测方法在环境监测中具有重要意义，可用于评估环 境污染对生物体影响、污染物代谢过程及生态系统健康状况的影响。本次演示将 详细介绍脱氢酶活性检测方法及其在环境监测中的应用。
3、设定对照组：不添加脱氢酶的样品为对照组。
6、比色：将反应液与显色剂混合，观察颜色变化，并进行比色测定。
注意事项
注意事项
1、实验过程中要严格控制温度和pH值等实验条件，以确保实验结果的准确性。 2、实验操作完成后，要及时记录实验数据，并对实验结果进行分析和处理。
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土壤脱氢酶活性的测定
一、实验原理
脱氢酶的正式命名是AH：B氧化还原酶，广泛存在于动植物组织和微生物细胞内，它能酶促一定的基质中脱出氢而进行氧化作用。
脱氢酶的种类因电子供给体和接受体的特异性而有不同。
单位时间内脱氢酶活化氢的能力表现为它的酶活性。
通过测定土壤中微生物的脱氢酶活性，可以了解微生物对土壤中有机物的氧化分解能力，即土壤酶的活性。
已知受氢体可接受脱氢酶脱出的氢原子，根据接收氢原子的量可以判断脱氢酶的活性。
如无色的氯化三苯基四氮唑（TTC，俗称红四唑）接受氢后变成红色的三苯基甲瓒（TF），根据产生红色的色度进行比色定量分析，就可以判断脱氢酶的活性。
通常，吸光度越大（红色越深），脱氢酶活性越大。
二、实验材料、试剂和仪器
1．材料：过0.9mm孔径筛的土壤样品，8g
2．试剂：0.36%Na2SO3溶液，15ml
Tris-HCl缓冲液（PH=7.6），45ml
0.4%TTC,7.6ml
Na2S2O4，十几粒
甲醛，10ml
丙酮，20ml
3．仪器：50ml具塞比色管，6只
比色管架，1只
1~5ml移液枪，1只（枪头3个）
100~1000ul移液枪1只（枪头1个）
药匙1个
水浴锅1个
分光光度计1台
分析天平1台
离心管4只
培养箱1台
离心机1台
三、实验步骤
1．标准曲线的绘制
（1）按下表配制系列浓度的TTC标准溶液。
（2）显色。
用药匙向每只比色管中各加入少许连二亚硫酸钠（Na2S2O4），混匀，使TTC 全部还原为红色的TF。
用1~5ml移液枪向各管滴加1ml甲醛终止反应，摇匀后再加入2ml丙酮震荡摇匀，37℃水浴10min。
（3）测定吸光度，绘制标准曲线。
在485nm波长下测定各管溶液的吸光度A，并以A为纵坐标，TTC浓度为横坐标，绘制出TTC标准曲线。
2．土壤脱氢酶活性的测定
（1）培养并显色（此步骤由助教预先完成）。
首先，按下表向四只离心管中分别加入以下物质
然后，将以上四只离心管避光，37℃保温培养12~24h。
（2）培养结束后，用1~5ml可调式移液枪向各管分别加入1ml甲醛终止反应，
再分别加入2ml丙酮震荡并于37℃下水浴保温10min。
（3）离心。
将各离心管置于离心机中，4000r/min离心5min。
（4）测吸光度。
取上清液在485nm波长下测定吸光度A，在标准曲线上查出相应的TTC浓度。
3．土壤脱氢酶活性计算。
脱氢酶活性=ABC
式中，A为由标准曲线上查出的TTC浓度（ g/ml）；B为培养时间校正值（h）;C 为比色时稀释倍数（当吸光度值大于0.8时，要适当稀释，使其在0.8以下）四、实验注意事项
1．所有操作尽量在避光条件下进行。
脱氢酶最适反应温度为30~37℃，最适pH 值为7.4~8.5，因此要控制好水浴锅的温度和缓冲液的pH。
2．取用甲醛时要小心，如若沾到皮肤上要迅速用自来水冲洗。
3．加入还原剂连二亚硫酸钠时，要保证各管加入的量几乎相同，防止因加入不同量的还原剂造成差异。
4．离心管经摇晃后会在管壁上沾有土，因此离心后取上清液测吸光度时，可用吸管吸取上清液到比色皿中，避免吸入土壤颗粒。
5．用过的比色皿如果内壁沾有颜色而难以清洗，可用硝酸浸泡。
五、思考与讨论
影响脱氢酶活性的因素有哪些？
答：1.反应终止剂的选择：本实验用甲醛作为终止剂，因其能抑制酶活性而使反应终止。
但终止剂不止甲醛一种，例如浓硫酸也可作终止剂。
但加入浓硫酸会使培养液褪色，背景值增大，且可能长时间会发生茶色反应，影响吸光度的测定。
2.萃取剂的影响：比起其它萃取剂，丙酮的萃取效果较好，吸光度大，与水互溶，不会发生液液分层现象，TF会均匀分布在水与萃取剂的混合液中。
3.TTC浓度的影响：TTC浓度影响很大，浓度上升时，TF的产量也增大。
但从已有研究来看，当TTC浓度过大时，TF产量会下降。
过高的TTC浓度不仅不会促进TTC还原反应，反而会抑制酶活性，使反应终止。
4.温度和pH的影响：反应的最适温度为30~37℃，最适pH为7.4~8.5，温度较低或较高都会使酶活性受到抑制。
5.培养时间的影响：根据酶活性的测定原则，培养时间应尽量短些，以避免因基质浓度下降、产物的形成以及酶本身的变性所带来的不良影响。
但培养时间过短会使得酶促反应可生成的被检测物质的量太少，难以定量检测，因此应选择合适的培养时间。
六、实验前准备工作
1．土样的采集和预处理
（1）本实验所用土壤采自大港。
（2）土壤采集后，通过风干、磨碎、过筛、混合、分装，制成满足分析要求的土壤样品。
2．器皿的清洗和溶液的配制（溶液的配制量要根据实验人数计算，避免不够和浪费）
（1）配制500ml pH 为7.6的0.5mol/l的Tris-HCl缓冲溶液：称取Tris（三羟甲基氨基甲烷，分子量121.4）30.285g溶于蒸馏水，加入1N的HCl 210ml，定容至500ml。
（2）配制100ml 0.4%的TTC溶液：称取0.4gTTC溶于0.5ml Tris-HCl缓冲溶液中，用蒸馏水定容至100ml。
（注：TTC即氯化三苯基四氮唑，又称红四唑）（3）配制500ml 0.36%的Na2SO3溶液：称取1.8gNa2SO3溶于蒸馏水，定容至500ml。
3.提前12~24h培养土样。
2011.12.20。