土壤酸性磷酸酶活性测定
土壤酶测定方法
土壤磷酸酶（酸性）——磷酸苯二钠比色法（一）试剂1.pH5 醋酸盐缓冲液：A:L 醋酸溶液（稀释至1000ml）B:L 醋酸钠溶液 A 液+B液稀释至 100ml若使用无水乙酸及乙酸钠配制 1 升PH为的乙酸盐缓冲液，则需要无水乙酸及乙酸钠的量计算以下：①无水乙酸用量的计算：无水乙酸的浓度为，则需无水乙酸的体积为×1000/=（毫升）；②乙酸钠用量的计算：查表知，无水乙酸钠的摩尔质量为82，则需无水乙酸钠的质量为×82× 1=11（克）。
使用无水乙酸及乙酸钠配制 1 升PH为的乙酸盐缓冲液的方法以下：用量筒量取毫升无水乙酸至1000 毫升烧杯内，再用台秤称取无水乙酸钠11 克至该烧杯，而后用量筒量取=996 毫升蒸馏水至该烧杯内，搅拌至乙酸钠溶解并呈平均的溶液即为1 升PH为的乙酸 - 乙酸钠缓冲液。
或许：量 7ml 醋酸钠液 +3ml 醋酸液混淆即得。
2.% 磷酸苯二钠： pH5醋酸缓冲液3.氯代二溴对苯醌亚胺：称取 2 ，6- 二溴苯醌氯酰亚胺，用 10ml 96%乙醇（48ml 乙醇 +2ml 水）溶解，储存于棕色瓶中，寄存在冰箱中，保留的黄色溶液未变褐色以前均可使用。
4.酚标准溶液：酚原液 --- 取 1g 苯酚溶于蒸馏水中，定容至 1000ml 水中，保留于棕色瓶中。
酚工作液 --- 取 10 ml 酚原液稀释至 1000ml 水中，每毫升含酚5.甲苯硫酸铝溶液，称取硫酸铝，定容至100ml。
（二）实验步骤1.标线制作取 0，1， 3，5，7，9，11，13ml 酚工作液，置于 50ml 容量瓶中，加入5ml 缓冲液和 4 滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，30min 后比色测定。
以光密度值为纵坐标，浓度为横坐标绘成标准曲线。
2.样品测定称取风干土样（过 20 目筛，去除杂质），搁置于 200ml 容量瓶（离心管）中，加甲苯，轻摇 15min 后，加入 20ml %磷酸苯二钠，认真摇匀后搁置于 37°C恒温箱中培育 24h，后于培育液中加入 %硫酸铝溶液过滤。
土壤酸性磷酸酶活性测定方法
土壤酸性磷酸酶活性测定方法土壤酸性磷酸酶活性的测定⑴原理该方法以对硝基苯磷酸二钠（即pNPP）为基质，基质在土壤酸性磷酸酶的催化下水解生成黄色色的对硝基苯酚（即pNP），该黄色溶液在410nm处有最大吸收光值，根据对硝基苯酚的生成数量与黄色溶液的吸光度呈正比来进行定量分析，以此来反映土壤酸性磷酸酶的活性，采用的是对硝基苯磷酸二钠比色法。
⑵测定方法①称取壤土0.2g、砂土0.5g、粘土0.1g风干土于10mL离心管中，加入0.2 mL甲苯和4 mL ph6.5 磷酸缓冲液，再加1 mL 0.05 mol/L对硝基苯磷酸二钠溶液（用磷酸缓冲液配制），摇匀后加盖，放进36~37℃的培养箱中进行培养1个小时；②培养完成后取出加入0.5 mol/L的CaCl2 1 mL 及0.5 mol/L的NaOH 4 mL，摇匀；③而后在2500r/min下离心5min；取上层清夜于10ml 离心管4000r/min下再离心5min.④取上清液在410 nm处比色，并记录吸收光值。
⑶标准曲线的制作①取13支玻璃试管，按顺序编号，并按表2加入试剂。
表2对硝基苯酚标准曲线配制表离心管号0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、120.005?mol/mLpNP（mL）0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08 0.09 0.10 0.11 0.12H2O（mL）0.8、0.79、0.78、0.77、0.76、0.75、0.74、0.73、0.72 0.71 0.70 0.69 0.68pNP的含量（?mol）0、0.00005、0.0001、0.00015、0.0002、0.00025、0.0003、0.00035、0.0004 0.00045 0.0005 0.00055 0.0006摇匀0.2mol/LpH6.5磷酸缓冲液（mL） 40.5mol/L CaCl2（mL） 10.5mol/L NaOH（mL） 4②混匀后，转入10mL的离心管中，在2500r/min下离心5min，再在4000r/min下离心5min以0号作为对照，在A410nm波长下测光吸收值，并记录光吸收值A410。
土壤磷酸酶(酸性、中性和碱性磷酸酶
土壤磷酸酶测定（酸性、中性和碱性磷酸酶）1. 分析意义土壤有机磷转化受多种因子制约，尤其是磷酸酶的参与，可加速有机磷的脱磷速度。
在pH4-9的土壤中均有磷酸酶。
积累的磷酸酶对土壤磷素的有效性具有重要作用。
研究证明，磷酸酶与土壤碳、氮含量呈正相关，与有效磷含量及pH也有关。
磷酸酶活性是评价土壤磷素生物转化方向与强度的指标。
2. 试验原理Kroll等（1955）最早提出用苯基磷酸盐作基质，以酚的释放量表示磷酸酶活性。
测定磷酸酶主要根据酶促作用生成的有机基团量或无机磷量计算磷酸酶活性。
前一种通称为有机基团含量法，是目前较为常用的测定磷酸酶的方法。
后一种称为无机磷含量法。
研究证明，磷酸酶有三种最适pH：4-5，6-7和8-10。
所以，测定酸性、中性和碱性反应土壤的磷酸酶，要提供相应的pH缓冲液才能测出该土壤的磷酸酶最大活性。
测定磷酸酶常采用的pH缓冲体系有醋酸盐缓冲液（pH5.0-5.4），柠檬酸盐缓冲液（pH7.0），三羟甲基氨基甲烷缓冲液（pH7.0-8.5），硼酸缓冲液（pH9-10）。
测定磷酸酶时，用各种磷酸一酯作为基质。
常用的基质有苯磷酸二钠、酚酞磷酸钠、甘油磷酸钠、α或β萘酚磷酸钠、ρ-硝基苯磷酸钠等。
3. 试剂配制a. 0.5％磷酸苯二钠（用缓冲液配制）；b. pH5醋酸盐缓冲液、pH7柠檬酸盐缓冲液、pH9.4硼酸盐缓冲液；c. 氯代二溴对苯醌亚胺试剂：取0.125g 2.6-二溴苯醌氯酰亚胺，用10mL 96％乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。
保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用；d. 酚的标准溶液：酚原液－取1g重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至1L，贮于棕色瓶中；酚工作液－取10mL 酚原液稀释至1L（每毫升含0.01毫克酚）；e. 甲苯；f. 0.3％硫酸铝溶液。
4. 标准曲线绘制：取1、3、5、7、9、11和13mL酚工作液，置于50mL容量瓶中，每瓶加入5mL缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，即得0.0002、0.0006、0.0010、0.0014、0.0018、0.0022和0.0026mg ·g -1浓度的酚标准溶液梯度。
(完整word版)最新相关土壤酶测定方法(综合)
土壤蛋白酶活性测定(茚三酮比色法）实验试剂:1、pH7。
6的0.05mol/L的tris—HCL缓冲液（三羟甲基氨基甲烷—盐酸缓冲液):50ml0.2mol/L 的三羟甲基氨基甲烷与27.5ml0.2mol/L的盐酸混合,稀释成200ml。
2、2%酪酸钠溶液:称取2g 酪酸钠，加入10ml0.1mol/L的NaOH溶液，沸水浴处理5min,待膨化后加入pH7.6的tris—HCl缓冲液约80ml，继续沸水浴处理,直至完全溶解，用同样的缓冲液定容至100ml。
3、Tris—HCl—CaCl2混合溶液:用pH7.6的0.05mol/Ltris—HCl缓冲液配制的0。
01mol/L的CaCl2溶液。
4、0。
6mol/L乙酸铅溶液。
5、草酸钠—乙酸混合溶液：每1000ml0。
26mol/L的草酸钠溶液含有240。
7ml0。
2mol/L的乙酸.6、茚三酮—乙醇—抗坏血酸混合试剂:称取2g茚三酮，0。
02g 抗坏血酸，溶于100ml无水乙醇。
7、0。
2％KIO3溶液。
8、pH5.8乙酸-乙酸钠缓冲液：94 ml0。
2mol/L乙酸钠与6ml0。
2mol/L乙酸混合.9、0.01%甘氨酸标准溶液：1g甘氨酸溶于1000ml水，再稀释10倍。
10、甲苯。
以上试剂均为分析纯。
实验仪器:基本仪器如试管、烧杯等、离心机、分光光度计、刻度试管、水浴锅、电子天平、移液管实验步骤1、标准曲线的绘制①分别吸取50 、100、150、200、250、300μl0。
01％甘氨酸标准溶液,置于10 ml刻度试管中(浓度分别相当于NH2 0.107、0。
213、0。
320、0。
426、0。
533、0.639μg/ml），加入2mlpH5。
8的乙酸—乙酸钠缓冲溶液②加入1。
5ml 茚三酮—乙醇—抗坏血酸混合试剂，混合均匀,沸水浴加热16min③取出立即用自来水冷却15min,加入1ml0.2%KIO3并混合均匀，用蒸馏水定容至10ml，1h内在570nm处比色测定吸光值；以氨基氮(NH2）的浓度为横坐标,吸光值为纵坐标,绘制标准曲线.2、培养与测定①称取0.200g土壤,加入2mlTris—HCl—CaCl2混合溶液和1ml甲苯,混合均匀后静置15min以抑制微生物活性；②然后再加入5ml2%的酪酸钠溶液,50℃振荡培养2h。
土壤酶活性测定方法
土壤酶活性测定方法土壤酸性磷酸酶活性的测定1.试剂制备(1)0.115mp-硝基苯磷酸钠溶液取10.67 GP硝基苯磷酸二钠（6H2O，分子量371.1）溶于pH4。
5 5在普通缓冲液中稀释至250ml，在4℃冰箱中保存。
(2)通用缓冲液（ph4.5）（缓冲液久置会有沉淀）储备溶液由以下成分组成：三羟甲基氨基甲烷12.1g顺丁烯二酸11.6g柠檬酸14g硼酸6.3g溶于500ml 1nnaoh（40g定容1L），加入蒸馏水至1L。
取200ml储备溶液，加入0.1nhcl或浓HCl，将pH值调节至4.5。
最后，稀释至1L。
（3）甲苯(4)0.5mol/lcacl2.2h2o溶液：36.75gcacl2。
2H 2O定容500ml（无水CaCl2:11.1g定容200ml）（5）0.5mol/lnaoh 溶液：20gnaoh定容1L 2。
测量步骤取1g土壤，置于50ml三角瓶中，加4ml通用缓冲液（ph4.5）、0.25ml甲苯和1ml0.115mp-硝基苯磷酸钠溶液,摇匀后，置于37℃恒温箱中1h。
培养结束后，加入1ml0 5mol/L氯化钙溶液和4ml 0 5mol/LNaOH溶液，用浓滤纸过滤至50ml容量瓶中，用蒸馏水定容后在410nm处比较颜色。
3.计算方法土壤酸性磷酸酶的活性用单位时间内每克土中的对硝基苯酚的毫克数表示，w（mgg-1h-1）=m1/（m×t）式中：M1——标准曲线上发现的样品中对硝基苯酚的质量（mg）；T-反应时间（H）=1hm-样品土壤重量（g）无土壤ck:用1ml蒸馏水代替1g土壤；每批土样做2个；无基质ck:用1ml蒸馏水代替1mlpnpp。
每个处理做1个。
标准曲线的制备：1）对硝基苯酚标液：1g对硝基苯酚定容1l，低温保存。
2）取标液0、1、2、3、4、5ml于0-6号硬质试管中，分别加ph6.5通用缓冲液4ml，cacl2.2h2o溶液1ml，naoh溶液4ml，② 混合后，将定量滤纸过滤至50ml容量瓶中。
酸性磷酸酶活性测定方法
实验九 酸性磷酸（酯）酶活性测定1．目的要求掌握酸性磷酸（酯）酶活性测定的原理和方法。
2．方法原理酸性磷酸（酯）酶是一种存在于生物体内水解有机磷酸酯键的酶。
以对硝基酚磷酸钠作为底物，在酸性磷酸酯酶的作用下，在碱性条件下水解生成黄色的对硝基酚，可用分光光度计进行比色测定。
它们在各类种子中普遍存在，且含量较多，在萌发前期，随着种子的萌发进程活性增加，通常酸性磷酸酶活性与种子活力呈正比。
3．主要实验仪器及材料干种子或吸胀种子、电子天平、分光光度计、恒温水浴箱、带塞刻度试管、小烧杯、研钵、塑料管、剪刀。
4．掌握要点掌握常用的测定酸性磷酸（酯）酶活性的方法——对硝基酚磷酸钠法。
5．实验内容（1）酶液提取。
称取1g 样品，用5mL 研磨缓冲液在研钵中冰浴研磨成浆，再用5mL 研磨缓冲液冲洗，转移至离心管中，在20000rpm 下离心10min 。
吸出上清液，即为酶粗提液。
可放在冰箱中储存备用。
（2）活力测定。
取酶液0.1—1mL （视酶含量多少而定），加水至1mL ，然后加入缓冲液1mL 和对硝基酚磷酸钠溶液0.1mL 。
空白对照用1mL 研磨缓冲液代替酶制剂。
充分混匀后，放在30℃恒温箱中保温10min ，时而摇动。
10min 后，加入1m0.5mol/LNaOH 溶液，充分混合，终止反应，并使对硝基酚呈黄色。
在400nm 波长下测吸光度A 。
（3）计算酶活性，以每毫克种子每分钟水解底物的nmol 数表示。
酶活性nmol/min.mg=）（）（试样的g W V V A ⨯⨯⨯min 1011.3019.0 式中0.019为pH=14时，对硝基酚的µmol 吸光系数，即对硝基酚的浓度为1mol/L 时，其A=0.019；3.1为0.0031×1000，反应混合液的体积为3.1，将µmol 化为nmol 乘上1000；V为酶制剂总体积；V1为每次用酶体积。
在实验中要保持酶制剂处于低温下以免酶活性下降，可在冰箱中提取和保存。
三种主要酶活测定方法
土壤纤维素酶活性测定（3,5- 二硝基水杨酸比色法）一、原理纤维素是植物残体进入土壤的碳水化合物的重要组分之一。
在纤维素酶作用下，它的最初水解产物是纤维二糖，在纤二糖酶作用下，纤维二糖分解成葡萄糖。
所以，纤维素酶是碳素循环中的一个重要的酶。
纤维素酶解所生成的还原糖与3,5- 二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸。
颜色深度与还原糖量相关，因而可用测定还原糖量来表示蔗糖酶的活性。
二、试剂1）甲苯2）1%羧甲基纤维素溶液：1g 羧甲基纤维素钠，用50%的乙醇溶至100ml。
3）pH5.5醋酸盐缓冲液：0.2mol/L 醋酸溶液 11.55ml 95% 冰醋酸溶至1L.0.2mol/L 醋酸钠溶液 16.4g C2H3O2Na或27.22g C2H3O2Na.3H2O溶至1L.取11ml 0.2mol/L 醋酸溶液和88ml 0.2mol/L 醋酸钠溶液混匀即成PH 5.5醋酸盐缓冲液. 4）3,5-二硝基水杨酸溶液：称1.25g二硝基水杨酸，溶于50ml 2mol/LNaOH和125ml水中，再加75g酒石酸钾钠，用水稀释至250ml（保存期不过7天），5）葡萄糖标准液（1mg/mL）预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。
准确称取50mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至50mL容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4℃保存期约一星期）。
若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制。
三、操作步骤葡萄糖标准曲线：分别吸1mg/mL的标准葡糖糖溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL 于试管中，再补加蒸馏水至1mL，加DNS溶液3ml混匀，于沸腾水浴中加热5min，取出立即泠水浴中冷却至室温，以空白管调零在波长540nm处比色，以OD值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。
称10g土壤置于50ml三角瓶中，加入1.5ml甲苯，摇匀后放置15min，再加5ml 1%羧甲基纤维素溶液和5ml pH5.5醋酸盐缓冲液，将三角瓶放在37℃恒温箱中培养72h。
土壤磷酸酶测定方法
磷酸单酯酶（对硝基苯磷酸盐法）(Tabatabai, 1994)1.原理：磷酸单酯酶水解对硝基苯磷酸盐，通过比色法测定反应后释放的对硝基苯酚的含量，来估算磷酸单酯酶的活性。
酸性和碱性磷酸酶的活性可以通过控制反应的pH值来分别测定。
2.试剂: （1）甲苯。
（2）pH 6.5缓冲溶液：取200 ml通用缓冲液至1000 ml烧杯中，用盐酸（0.1 mol ﹒L－1）溶液调至pH6.5，用水定容；或pH 11缓冲溶液：用氢氧化钠（0.1 mol﹒L －1）溶液调至pH11，用水定容。
通用缓冲液：称取12.1g三（羟甲基）氨基甲烷、11.6g丁烯二酸、14.0 g柠檬酸和6.3g硼酸于488 ml氢氧化钠溶液[C（NaOH）＝1 mol﹒L－1]中，然后用水稀释到1L，低温贮存备用。
)（4）对硝基苯磷酸二钠溶液（0.05 mol﹒L－1）：称取0.9303 g六水对硝基苯磷酸二钠溶于40 ml PH 6.5或者11的缓冲溶液，用同一种缓冲溶液稀释至50 ml，低温贮存。
（5）0.5 M CaCl2溶液：称取73.5 g CaCl2﹒2H2O溶解于700 mL水中，用水定容到1L。
（6）0.5 mol﹒L－1 NaOH溶液：称取20 g NaOH 溶解于700 mL水中，用水定容到1L。
（7）对硝基苯酚标准溶液：溶解1.0 g 对硝基苯酚于700 ml 水中，稀释至1L，低温保存。
配置工作曲线用的溶液。
将已经配置好的标准溶液用水稀释100倍，再分别吸取稀释后的标准溶液1 ml、2 ml、3 ml、4 ml、5 ml于50 ml三角瓶中（分别含0 mg、0.01 mg、0.02 mg、0.03 mg、0.04 mg、0.05 mg的对硝基苯酚），分别用水调节至5 ml，再加入1 ml的CaCl2和4 ml 的NaOH溶液，轻摇几秒钟，滤纸过滤，400 nm－420 nm条件下比色。
3. 仪器:50mL三角瓶；培养箱；分光光度计4. 步骤:将1.00 g新鲜土样（< 2 mm）放入50mL三角瓶中，加入0.2 mL 甲苯、4 ml的缓冲液和1 ml的对硝基苯磷酸二钠溶液。
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2.1土壤酸性磷酸酶活性测定
土壤酸性磷酸酶活性测定
土壤有机磷转化受多种因子制约，尤其是磷酸酶的参与，可加速有机磷的脱磷速度。
在pH 4-9 的土壤中均有磷酸酶。
积累的磷酸酶对土壤磷素的有效性具有重要作用。
研究证明，磷酸酶与土壤碳、氮含量呈正相关，与有效磷含量及pH也有关。
磷酸酶活性是评价土壤磷素生物转化方向的强度的指标。
磷酸苯二钠比色法
1.试剂配制
（1）0.5%磷酸苯二钠（用缓冲液配制）。
（2）pH5醋酸盐缓冲液。
a.醋酸盐缓冲液（pH=5.0）
A：0.2mol/L 醋酸溶液（11.5mL，稀释至1000mL）
B：0.2mol/L 醋酸钠溶液（16.4g C2H3O2Na 或27.2g C2H3O2Na·3H2O 定容至1000mL）
14.8ml A + 35.2ml B混合即得
（3）氯代二溴对苯醌亚胺试剂：取0.125g 2,6-二溴苯醌氯酰亚胺，用10ml 96%乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。
保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用。
（4）酚的标准溶液：
酚原液——取1g重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至1L，贮于棕色瓶中。
酚工作液——取10ml 酚原液稀释至1L（每毫升含0.01mg酚）。
（5）甲苯。
（6）0.3%硫酸铝溶液。
标准曲线绘制：取1、3、5、7、9、11、13ml 酚工作液，置于50ml容量瓶中，每瓶加入5ml 缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，30min后比色测定。
以吸光度为横坐标，浓度为纵坐标（mg）绘成标准曲线。
2.操作步骤
称5g风干土置于200ml三角瓶中，加2.5ml 甲苯，轻摇15min后，加入20ml 0.5%磷酸苯二钠（用醋酸盐缓冲液配制），仔细摇匀后放入恒温箱，在37℃下培养24h后于培养液中加100ml 0.3%硫酸铝溶液并过滤。
吸取3ml 滤液于50ml 容量瓶中，然后按绘制标准曲线所述方法显色。
用硼酸缓冲液时，呈现蓝色，在分光光度计上于660nm 处比色。
3.结果计算
磷酸酶活性，以24h后1g土壤中释出的酚的毫克数表示。
酚（mg）=a*8
式中a—从标准曲线上查得的酚毫克数
8—换算成1g 土的系数
1 / 1。