人工酶
第七章化学人工酶和酶的非水相催化解析
1983年，Rupley等人从溶菌酶的结论得知，一个 干燥蛋白的水合过程经过4个步骤： (1)加入的水首先与酶分子表面的带电基团结合， 达到每克蛋白质0~0.07g水。 (2)然后与酶分子表面的极性基团结合(每克蛋白 质0.07~0.25g水)。 (3)多出来的水再凝聚到蛋白质分子表而相互作 用较弱的部位(每克蛋白质0.25~0.38g水)。 (4)最后，酶分子表面完全水化，被一层水分子 所覆盖(每克蛋白质0.38g水，大约300个水分子)。
第二节 非水介质中的酶催化反应
1984年A. Zaks 和A.M Klibanov 首 次发表了关于非水相介质中脂肪酶的催 化行为及热稳定性的研究报道，引起了 广泛的关注。传统的酶学领域迅速产生 一个全新的分支非水酶学。 现在非水酶学方法在多肽合成、聚 合物合成、药物合成以及立体异构体拆 分等方面显示出广阔的应用前景。
一、半合成酶
半合成酶 将具有一定结构和功能的物质与特异的 蛋白质结合，便可形成新的生物催化剂—— 半合成酶。
一、半合成酶
1．将具有催化活性的金属或金属有机物与 具有特异性的蛋白质相结合，形成半合 成酶。 Gray与Margalit将电子传递催化剂 [Rn(NH3)5]3+，与巨头鲸肌红蛋白结合， 产生半合成的无机生物酶。肌红蛋白传 递氧气， Rn(NH3)5]3+能氧化各种有机物 (如抗坏血酸)。这种人工酶的催化效率是 钙一咪唑复合物的200倍，接近天然的抗 坏血用人工方法合成 具有催化活性的多肽。 1977年人工合成一个八肽具有溶菌酶的活 性。
三、设计要点
设计前： 酶活性中心-底物复合物的结构 酶的专一性及其同底物结合方式的能力 反应的动力学及各中间物的知识
三、设计要点
设计中： 为底物提供良好的微环境（疏水性） 应提供形成离子键、氢键的可能性，以利 于结合底物 催化基团必须相对于结合点尽可能同底物 的功能团相接近 应具有足够的水溶性，并在接近生理条件 下保持其催化活性
生物酶催化和人造酶的发展和应用
总之，生物酶催化和人造酶的发展对于推动科学技术进步和人类社会的发展至关重要。需要进一步的深ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ研究和技术创新，将人造酶技术应用到社会生产和人类健康中，为推动全球可持续发展做出新的贡献。
1、改进人工酶的催化效率。目前，人造酶在催化效率上还存在一定的差距，需要进一步的改进。例如，通过挖掘生物酶未被利用的结构域，或是利用计算机辅助设计方法，寻找新型酶底部和酶体。
2、解决人工酶在实际应用中的稳定性问题。目前，人工酶在实际应用中，往往面临着稳定性差、活性退化等问题。因此，科学家们正在研究如何进行智能修饰和精细控制，提高酶的稳定性和活性。
在医疗领域中，人造酶的主要应用是制造药物，例如抗癌药物。药物本身就是一种分子，而且是一种可以催化反应的分子。借助人造酶的催化作用，药物可以更快速、更高效地发挥作用，同时也可以降低副作用。在环保领域中，人造酶也可以帮助处理各种废水废气等污染物，使之转化为对环境无害的物质。
三、人造酶技术的研究方向
当前，人造酶技术的研究方向主要包括以下几个方面：
生物酶催化和人造酶的发展和应用
酶是生物体内常见的一种催化剂。生命是基于无序的原子和分子自组织而成，在利用物质能量和信息的同时，也需要维持生命活动的完整性。而酶通过降低反应的激活能，促进化学反应的进行，发挥着重要的生物调节作用。随着科学技术的不断发展，酶催化作用也逐渐得到了更加深入的研究，同时也促进了人造酶的发展和应用。
二、人造酶的发展与应用
随着对生物酶催化原理的深入研究，科学家们开始研制人造酶。人造酶的研制可以通过结构模拟、化学修饰等方法使其具有特定的催化能力，从而应用到化学反应、医疗、环保等领域中。
人工合成酶的设计与制备
人工合成酶的设计与制备酶是生物学中极其重要的一类生物大分子，是生命体系中的核心。
它们能够在细胞内参与代谢过程中的催化反应，常常起到高效催化剂的作用，相应地，合成酶的设计与制备也是近年来的追求之一。
从分类上来看，酶可以分为天然酶和人工合成酶，人工合成酶最大的特点是经过人工重组和设计，能够更好地满足实验或生产操作的需要，同时也可以优化该酶的性能，进而实现更高效率和高产的催化反应。
一、人工合成酶的设计原理人工合成酶的设计是从天然酶的结构和性能出发，结合计算机预测和仿真技术，通过不同的策略来设计出具有所需性质的新型酶，从而改善传统酶的不足之处。
人工合成酶的设计原理主要有以下几种：1、重组酶法重组酶法是通过基因重组技术将源自于不同菌株或不同类型的酶基因融合到一起，从而得到具有新特性的合成酶。
这种方法可以充分利用天然生物系统中的遗传物质优化酶的性能，而且结构稳定，催化效率高，成本低廉，被广泛应用于工业生产和科学研究领域。
2、模拟计算法模拟计算法是建立于天然酶基础上的计算机模拟，通过DNA shuffling, error-prone PCR 和overlap-extension PCR等技术，将源自于不同酶的进化优化的片段融合在一起，制备出重组的新酶。
这种方法可以有效降低生产成本和提高酶的活性和稳定性，成为人工合成酶设计的重要策略。
3、结构框架改变法结构框架改变法主要是通过改变酶的空间结构，控制催化反应所需的位置，从而实现酶活性调节。
相比其他的合成酶制备法，结构框架改变法最大的特点是能够快速地确定酶的结构，并在较短的时间内设计出符合需求的新型酶。
二、人工合成酶的制备方法人工合成酶的制备方法是指将经过设计和重组的DNA片段植入到宿主细胞中，利用细胞内自身的加工调节机制来制备出具有所需特性的人工酶。
人工合成酶的制备方法总体上分为以下几步：1、酶基因克隆首先，要确定需要改造的天然酶的基因。
从不同微生物、植物和动物的DNA库中克隆出酶基因，得到包含酶基因双链DNA片段的质粒或染色体。
蛋白质工程和人工酶的研究和应用
蛋白质工程和人工酶的研究和应用蛋白质是生命活动中不可或缺的物质，在细胞内发挥着重要的催化、运输、信号传递等功能。
近年来，随着生物技术的发展，人们开始重视对蛋白质的研究和应用。
其中，蛋白质工程和人工酶的研究和应用成为热门话题。
本文将以此为主题，探讨蛋白质工程和人工酶的研究进展、应用现状及前景展望。
一、蛋白质工程的研究进展为了实现人类对蛋白质的更深入理解、更高效利用和更精确控制，人们提出了蛋白质工程的概念，即应用基因重组、突变、构建等手段对蛋白质进行修饰和改造，使其具有更好的性能和功能。
蛋白质工程的研究涉及到许多领域，如基础科学、医药学、食品工业等，这里介绍其中几个重要的方向。
1. 基因重组技术利用基因重组技术可以将两个不同物种的基因进行重组，产生具有新性状的蛋白质。
例如，将鼠的免疫球蛋白基因和人的免疫球蛋白基因进行重组，可以产生人-鼠嵌合型免疫球蛋白，用于治疗某些疾病。
此外，还可以将两种酶基因进行重组，产生具有更高催化效率的蛋白质。
2. 突变技术通过突变技术可以产生蛋白质的不同形态或性质，如改变酶的催化活性、选择性、稳定性等。
例如，将胰岛素的丝氨酸替换为脯氨酸，就可以得到抗胰岛素的药物。
此外，还可以利用突变技术优化抗体的结构和亲和力，用于治疗癌症等疾病。
3. 构建技术构建技术可以通过合成不同肽段或蛋白质区域实现蛋白质的修改和修饰，如纯化、过滤、结晶等，从而达到改变蛋白质功能和结构的目的。
例如，将含有低氧感受器域的蛋白质进行构建，可以得到与肿瘤发生相关的蛋白质，为癌症治疗提供了新的思路。
二、人工酶的研究进展人工酶，即由非酶性物质构建的具有酶活性的体系，是生物催化领域的一个重要研究方向。
相较于天然酶，人工酶具有更好的稳定性、特异性和选择性，能够用于催化试剂合成、生物转化、环保等多个领域。
1. 化学人工酶化学人工酶是利用小分子化合物模拟酶的活性和选择性，从而实现生物催化的过程。
其中，小分子主要包括有机配体、有机催化剂等。
人工酶的名词解释
人工酶的名词解释人工酶是指由人工合成的具有类似于天然酶的催化活性的化学物质。
酶是生物体中的重要催化剂，能够加速生物化学反应的进行，但传统的天然酶在某些应用领域存在一些局限性，例如不稳定性、受底物特异性限制以及难以得到等。
因此，科学家们致力于开发出具备类似功能的人工酶，以满足特定的实际应用需求。
1. 人工酶的优势人工酶相对于天然酶具有许多优势。
首先，人工酶的合成可以通过化学合成方法进行，因此可以大规模生产，而不像天然酶那样需要依赖于生物体的生长和提取。
其次，人工酶可以以更高的稳定性存在，可以承受更高的温度和pH值等极端条件，这使得它们在工业生产中具有更长久的应用寿命。
此外，人工酶还可以通过结构改造和工程来实现特定的底物选择性，从而提高催化效率和选择性。
2. 人工酶的构建原理人工酶的构建原理主要包括两种方法：模拟天然酶和设计新的催化结构。
模拟天然酶方法是通过研究天然酶的催化机理以及其催化活性中心的结构，设计和合成具有相似结构和功能的人工酶。
这种方法可以使人工酶拥有与天然酶类似的催化性质，但受限于天然酶的结构限制。
设计新的催化结构方法则是根据催化原理，设计具有新颖催化特性的人工酶。
这种方法可以突破天然酶的结构限制，并实现更高的催化效率和底物选择性。
3. 人工酶的应用领域人工酶的研究和应用领域广泛，涵盖了生物医学、环境保护、食品工业等众多领域。
在生物医学领域，人工酶可以用于药物合成、药物代谢、基因修饰等方面。
例如，人工酶可以用于合成抗癌药物，提高药物的选择性和活性。
在环境保护领域，人工酶可以用于水处理、废物降解等方面。
例如，人工酶可以被设计用来降解有毒废物，减少对环境的污染。
在食品工业领域，人工酶可以用于改进发酵过程、提高食品品质等方面。
例如，人工酶可以被应用于面包和酒类的生产，提高发酵效率和口感。
4. 人工酶的前景和挑战人工酶的研究和应用在科学界和工业界具有广阔的前景。
随着科学技术的不断发展，人们对人工酶的研究会越来越深入，其在各个领域的应用也会不断扩展。
人工模拟酶
分子印记技术是在分子识别基础上开展的。 分子印记技术是在分子识别基础上开展的。
分子识别本质上是指主体分子(受体)对客体分子 分子识别本质上是指主体分子(受体) 本质上是指主体分子 (底物)选择性结合并产生某种特定功能的过程。如： 底物)选择性结合并产生某种特定功能的过程。 酶与底物、抗原与抗体、糖与蛋白质等的相互作用。 酶与底物、抗原与抗体、糖与蛋白质等的相互作用。
互作用力形成稳定复合物的化学领域。 互作用力形成稳定复合物的化学领域。
超分子化学： 超分子化学：研究两种或两种以上的化学物通过分子间力
（静电作用、氢键、范德华力等非共价键）相互作用缔结而成 静电作用、氢键、范德华力等非共价键） 的具有特定结构和功能的超分子体系的科学。 的具有特定结构和功能的超分子体系的科学。
杯芳烃的热稳定性及化学稳定性好，可溶性虽较差， ④ 杯芳烃的热稳定性及化学稳定性好，可溶性虽较差，但通过衍 生化后，某些衍生物具有很好的溶解性； 生化后，某些衍生物具有很好的溶解性； ⑤ 杯芳烃能与离子和中性分子形成主一客体包结物，这是集冠醚 杯芳烃能与离子和中性分子形成主一客体包结物， 和环糊精两者之长； 和环糊精两者之长； 杯芳烃的合成较为简单，可望获得较为廉价的产品， ⑥ 杯芳烃的合成较为简单，可望获得较为廉价的产品，事实上现 在已有多种杯芳烃商品化。 在已有多种杯芳烃商品化。
胶束模拟酶一方面利用增溶、增稳的增效作用， 胶束模拟酶一方面利用增溶、增稳的增效作用，使酶 活性呈现“超级活性” 另一方面， 活性呈现“超级活性” 。另一方面，利用胶束介质 尤其是反相胶束介质） （尤其是反相胶束介质）模拟天然酶在生物体内活体 细胞中的微环境。 细胞中的微环境。
X X X X X X X X X
（2）胶束酶
人工酶
分子印迹酶
印迹底物及其类似物
• 将 4(5)-乙烯基咪唑聚合可以得到一种模
拟氨基酸酯水解酶的印迹聚合物，可选
择性水解与印迹分子结构相关的氨基酸 酯底物 [N-Boc-氨基酸对硝基苯酯]
• 由于底物在单体聚合时可能发生水解，
因此用其结构类似物 [N-Boc-氨基酸-2吡啶甲酰胺] 为印迹分子 • 聚合后抽提除去模板，在聚合物孔穴内 的特定距离位置留下咪唑基（聚合物骨 架），能起到催化基团的作用
分子印迹酶
什么是“分子印迹酶（molecular imprinting enzyme）”？
• 通过分子印迹技术可以产生类似于酶的活性中心的空腔，对底
物产生有效的结合作用，并可以在结合部位的空腔内诱导产生 催化基团，并与底物定向排列
• 分子印迹酶面临的最大挑战之一是如何利用分子印迹技术来模
拟复杂的酶活性中心部位，使其最大限度地与天然酶相似，即 选择合适的印迹分子是关键的一环 – 底物 – 底物类似物 – 酶抑制剂 – 反应过渡态类似物
• 维生素 B6 通常以磷酸化的形式参与转氨酶的催化反应
• 维生素 B6 自身即能实现转氨基作用，但缺乏底物结合位点， 高效的转氨酶模型必须具有合适的底物结合部位，环糊精的空 腔能够为底物提供良好的结合位点 • 1980 年报道了第一个人工转氨酶模型，它具有良好的底物选 择性，可以使反应加速 200 倍
分子印迹酶
印迹过渡态类似物
• 利用分子印迹技术印迹磷酸单酯（充当
酯水解过渡态类似物），通过与含脒基 （催化部位）的功能单体结合，形成稳 定的复合物。此印迹酶表现出很强的酯 水解活性 • 适当地设计模板分子和催化基团，将稳
N H O N H O CH3 N H O P N H O O CH3
第七章酶的模拟
52%
策略：
一系列端基为咪唑基、羧基、羟基或氨 基的长链化合物溶于水，形成“簇”， 每个簇为一多组分混合体系，每一个组 分含有一个潜在的催化基团，可与相邻 的催化基团协同作用。
五、抗体酶（Abzyme） 又称催化抗体（catalytic antibody）
理论基础：过渡态理论。
制备方法： 1.过渡态类似物设计
1986年Schultz以对硝基苯酚磷酸胆碱酯（PNPPC）作为相应 的羧酸二酯的过渡态类似物。
诱导产生的抗体酶使水解反应速度加快12000倍。
利用过渡态类似物制备抗体酶
③ 从聚合物中除掉印迹分子。
2．分子印迹酶 印迹底物及其类似物 印迹过渡态类似物
3．生物印迹酶 利用配体诱导酶活性中心构象发生变
化，形成一种高活性的构象形式，此种 构象形式因酶在有机介质中的高度刚性 或通过交联固定而得到保持。
有机相生物印迹酶 水相生物印迹酶
枯草杆菌蛋白酶从含有竞争性抑制剂的水溶液 中冻干出来后，再将抑制剂除去，该酶在辛烷 中催化酯化反应的速度比不含抑制剂的水溶液 中冻干出来的酶高100倍
cavity
பைடு நூலகம் 1． 水解蛋白酶的模拟
利用β-CD作为酶的结合部位，而连在其 侧链上的羧基、咪唑基及CD本身的一个 羟基共同构成催化中心，实现了胰凝乳 蛋白酶的模拟。
组氨酸咪唑基的引入
2．核糖核酸酶的模拟
催化基团所处的位置可对反应的选择性 起作用。
碱性条件下水解，同
时产生Ⅱ和Ⅲ两种产 物，而在A的催化下 水解只生成Ⅲ； B催 化水解反应只生成Ⅱ。
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人工酶的分类
按照人工酶的合成机制分：
单纯酶模型（enzyme-based mimics): 化学方法通过
天然酶活性的模拟来重建和改造酶活性。
机理酶模型（mechanism-based mimics): 通过对酶
作用机制（如识别、结合和过渡态稳定化）的认识，来 指导酶模型的设计与合成
单纯合成的酶样化合物(synzyme): 一些化学合成的，
抗体结合位置或附近引入具有催化功能的基因。
抗体酶的应用前景
1.抗体酶在帮助戒毒方面的应用
Landry等用可卡因水解的过渡态类似物-磷酸单
酯为半抗原，产生的单克隆抗体能催化可卡因的 分解，其催化活性和血液中催化可卡因的丁酰胆 碱酯酶差不多，水解后的可卡因片断失去可卡因 刺激功能。
因此，用人工抗体酶的被动免疫也许能阻断可卡
印记底物及其类似物
印记过渡态类似物
分子印记酶制备中注意的问题：
•交联剂的选择及交联度的控制
分子印记酶制备中注意的问题
功能单体和模板的相互作用
模板分子的选择:底物类似物；过渡态类似物或产物
类似物等。
溶剂的选择：作为反应介质，同时也是致孔剂，在
聚合时控制着非共价键结合的程度。
单体的选择
Under B: 只生成I
胶束酶模型
模拟酶近年来的研究热点
胶束体系形成，胶束的功能化，胶束表面提供与底物的结合位 点，同时利用吸附或共价在胶束上连接催化基团（咪唑、羟基 等）
肽酶模型：模拟天然酶活性部位而人工合成的具有
催化活性Байду номын сангаас多肽。
罗贵民： 根据SOD活性部位的结构，设计合成了一个十六肽，其二级结构与 天然SOD类似，加入铜离子后显示了SOD的酶活性。
因上瘾，达到戒毒目的 。
抗体酶的应用前景
2.抗体酶用于肿瘤治疗
抗体介导前药治疗（ADEPT）技术：即将能水解前
药，释放出肿瘤细胞毒剂的酶和肿瘤专一性抗体相偶联，这 样酶就会通过和肿瘤结合的抗体而存在于细胞的表面。
前药 ( prodrug)是指由具有生物活性的药物经化学修饰后
转变为体外无活性的化合物。这种化合物在体内经酶或非酶
基团相连。
诱导法制备抗体酶
利用过渡态类似物制备抗体酶示意图
抗体酶用于有机酯的水解，过渡态类似物磷
酸盐和磷酸酯作为免疫原诱导产生的单克隆 抗体催化水解反应比未催化反应快104倍。
酯酶催化反应的过渡态类似物设计(方框内为半抗原)
拷贝法
用酶作为抗原免疫动物得到抗酶的抗体，再将此抗体免
疫动物并进行单克隆化，获得单克隆的抗抗体。
为相应的羧酸二酯的过渡态类似物。
诱导产生的抗体酶使水解反应速度加快12000倍。
抗体酶的催化反应类型
转酰基反应 水解反应 Claisen重排反应 酰胺合成反应 Diels-Alder反应 转酯反应 光诱导反应 氧化还原反应 脱羧反应 顺反异构化反应
抗体酶的制备
作用，脱去保护基，释放出母体药物而发挥治疗作用。
• 静脉给药后，当药物扩散至肿瘤细胞的表面或附 近，抗体酶就会将前药迅速水解释放出抗肿瘤药 物，从而提高肿瘤细胞局部药物浓度，增强对肿 瘤的杀伤力，达到提高肿瘤化疗效果的目的。 • 当然前药只能被抗体酶水解而不能被内源性酶水 解，抗体还要尽量减少免疫原性 。
抗体酶（Abzyme)
抗体酶设想
1969年Jencks根据抗体结合抗原的高度特异性，与天然酶
结合底物的高度专一性相类似的特性，在过渡态理论的基 础上首先提出设想：能与化学反应中过渡态结合的抗体， 可能具有酶的活性，催化反应的进行。
1986年Lerner和Schultz证实了这一设想。 1986年Schultz以对硝基苯酚磷酸胆碱酯（PNPPC）作
诱导法是利用反应过渡态类似物为半抗原制作单
克隆抗体，筛选出具高催化活性的单抗即抗体酶。
拷贝法主要根据抗体生成过程中抗原-抗体互补性
来设计的，通过酶-抗体-抗体酶的途径来实现。
引入法则借助基因工程和蛋白质工程将催化基因
引入到特异抗体的抗原结合位点上，使其获得催化 功能。
化学修饰法对抗体进行化学修饰，使抗体与催化
具有酶样催化活性的简单分子。
人工酶的分类
按照人工酶的属性分：
主-客体酶模型；环糊精，冠醚，杂环大环化合物 胶束酶模型 肽酶 半合成酶 分子印记酶 抗体酶
核糖核酸酶的模拟
I
II
在碱性条件下： I and II Under A: 只生成II
Breslow 首次设计完成， 水解环状磷酸二酯
半合成酶：
用化学或生物学方法，以天然酶为母
体，引入适当的活性部位或催化基团。
枯草杆菌蛋白酶活性中心的天冬氨酸，组氨酸和221位丝氨酸构成“催化
三联体”。
提高221位丝氨酸羟基的亲核性可提高催化活力。 221位丝氨酸羟基的选择性修饰，在酶活性部位中引入不同官能团，产生
新的活力。
羟基硫代后，硒代后，酶表现出转氨酶的活性，含硒谷胱甘肽过氧化物酶
第五章 人工酶
模拟酶或模型酶，生物有机化学的分支。在分子水平上模拟酶活性部 位的形状、大小及其微环境等结构特征，以及酶的作用机理，用化学 合成方法制成的高效、高选择性、结构较简单、稳定性较高的新型催 化剂，也称酶的合成类似物。
人工酶的理论基础
主-客体化学（host-guest chemistry): Cram 把主体与客体通过配位键或其他 次级键形成的稳定复合物的化学领域。 来源于酶与底物的相互作用，体现为主 体与客体在结合部位的空间及电子排布 的互补，与酶与底物的结合情况类似。 超分子化学（supramolecular chemistry): Lehn提出， 研究两种以 上的化学物质通过分子间弱相互作用缔 结而成为具有特定结构和功能的超分子 体系的科学。
活性。
印记酶
印记酶
印记酶
分子印迹酶：通过分子印迹技术可以产生类似于
酶的活性中心的空腔，对底物产生有效的结合作用， 更重要的是利用此技术可以在结合部位的空腔内诱 导产生催化基团，并与底物定向排列。
生物印记酶：主体分子是生物分子（蛋白质或糖
类）而不是聚合物，在其上进行印记而产生对印记 分子具有特异性识别空腔的过程。这样的人工酶称 为生物印记酶。
对抗抗体进行筛选，获得具有原来酶活性的抗体酶。
引入法
用基因工程方法改造和制备全新的抗体酶是一种很有前途和
发展潜力的抗体酶制备方法。
将催化基因引入到特异抗体的抗原结合位点上，也可以针对
性地改变抗体结合区的某些氨基酸序列，以获得高效的抗体 酶。
化学修饰法
对抗体酶进行结构修饰的关键是找到一种温和的方法在
生物印记酶
生物印记酶：是一种通过酶与配体间的相互作用、诱导，从而改变酶的
构象的方法，其原理是利用酶在水溶液中的柔性，加入手性竞争性抑制剂， 然后将这种酶一抑制剂复合物转入亲脂性溶剂，使酶的三维结构以一种改 性的状态被“冻结”，除去抑制剂的改性酶凭借其“记忆”功能就具有了 对底物的立体选择性
Ohya 等[49]首次用分子印迹对牛血清白蛋白 (BSA)进行了改性, 用N-甲 基-N-(4-硝基苄基)-6-氨基戊 酸作模版, 被印迹的BSA 可显著提高 (4R,4S)-4-氟-4-(4-硝基苯基)-丁-2-酮脱HF 的反应速度, 而以 (4R,4S)-4-羟 基-4-(4-硝基苯)-丁-2-酮为底物时, 被印迹过的酶的活 性被完全抑制