Real-time qPCR手册---手把手教你从菜鸟到高手_生物吧
Real-Time PCR操作手册 0904
7 合成引物： 送往 Sangon 合成引物，大约需三个工作日。
8 引物稀释： 原液 100 μM 工作液 5 μM mixture Forwad primer Reverse primer ddH2O
5 μl 5 μl 90 μl
三） 推荐反应体系
试剂 2 × SYBR Green PCR Master mix cDNA (1-100 ng RNA 反转录所得 cDNA) H2O 5 μM Primer mix 终体积
此时可以设计 Real-time PCR 反应程序，点击兰色行的加号添加反应循环步骤，点击白色行加号添加每 一个循环内的步骤。 上图为 real-time PCR 的默认程序， ① 将第二个循环中第一步 95℃的时间调整为 15 秒，第二步改为 60℃（这些条件都需要根据所用的试 剂不同做出相应的调整）， ② 另外我们需要添加熔解曲线步骤，点击红圈标出的加号，添加第三个循环，并把 dwell time 改为 1， setpoint 列改为 95℃， ③ 再点击加号添加第四个循环，并把 dwell time 改为 1，setpoint 列改为 55℃，
5 选择引物序列： 打开 Map 标签页，查看找到的引物序列，此时引物有红蓝两色显示，在 optimal primer pairs only 前
打勾，则只显示红色并基本上按得分高低排列引物，此时尽可能选择靠近 3’端的引物；再打开 Result 标签页，复制 Forwad primer 和 Reverse primer 序列到 Word 文档中，比对引物查看其是否跨越至少 1 个 外显子，再打开 Primer 标签页查看选中的序列的罚分值，若引物正好跨越外显子，且得分比较低（红 色基本可用）则可用。
Real-Time PCR 操作手册
Real-timeqPCR数据分析方法
Real-timeqPCR数据分析方法
基线（baseline)：通常是3－15个循环的荧光信号，同一次反应中针对不同的基因需单独设置基线。
阈值（threshold)：自动设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。
手动设置：置于指数扩增期，刚好可以清楚地看到荧光信号明显增强。
同一次反应中针对不同的基因可单独设置阈值，但对于同一个基因扩增一定要用同一个阈值。
Ct值：与起始浓度的对数成线性关系
分析定量时候一般取Ct:15-35.太大或者太小都会导致定量的不准确。
相对定量：通过与内参基因Ct值之间的相差来计算基因之间的表达差异,一般是
2-△△Ct。
或者是考虑扩增效率的Pfaffl法。
qPCR操作步骤
QPCR（Real-time Quantitative PCR Detecting System）即实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统。
标准的两步法：RNA提取→随机引物反转录→反转录产物10倍稀释→real-time PCR.注意：1 高质量的RNA获取，这里的高质量不是强调RNA降解，而是强调RNA 的纯度，不能含有基因组DNA,以及其他杂质污染。
基因组DNA的存在会导致定量偏高，给你错误的结果，所以一般用于定量PCR的RNA必须使用DNase处理，消除DNA污染。
而RNA中的杂质的污染会限制real-time PCR的反应，导致扩增失败，给你假阴性的结果。
RNA的降解不是关键，一个是因为定量PCR的引物扩增目的长度本身很短，150-250个bp，并不用于扩增目标基因的全长。
此外是因为存在内参基因，所以RNA降解会通过内参基因的测定来平衡。
毕竟一旦发生降解，所有的RNA以同样的速度降解，而相对比率不会改变。
2 减少加样误差，在使用SYBR Green MIX的时候，一定要先按照反应的量（比如8个孔）把所有的试剂一次性配成MIX然后分装，留出5微升的反应体系给模板，使用5微升是因为只有5微升以上，加样枪的误差才会比较小，如果你仅仅是吸取一微升的话，手重一点或者轻一点都会造成极大的加样误差，严重影响你的定量精确度。
3 选择合适的内参基因，一般用于定量PCR的内参基因有好几种，但却没有完全通用的内参基因。
具体到不同来源的细胞，比如不同组织来源，或者是动物等等，内参基因会有差异，最好的办法是，在你的样品上先测试内参基因，找到变化最小，最稳定的一个。
4 合适的引物设计，避免出现引物二聚体，非特异性扩增等。
Q-PCR实验流程：一、①实验前准备，每天早上到实验室后，先把超净工作台的紫外灯打开15-20分钟。
②超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套，RNA抽提需带口罩。
Agilent Real-time qPCR 检测 操作手册说明书
Real-time qPCR 检测操作手册1/ 6一、实验概述Real-time Quantitative PCR Detecting System ，即实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统，简称qPCR 。
是一种在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程，最后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法，实现了PCR 从定性到定量的飞跃。
二、实验流程三、实验材料： 1.主要试剂试剂名称 试剂来源 Cat.No. Trizol 上海普飞 3101-100 M-MLV promega M1705 dNTPs promega U1240 oligo dT 上海生工 B0205 Bulge-LoopTM miRNA广州锐博 详见实验报告 qPCR Primer Set Rnase Inhibitor promega N2115 Primer(R&F) 上海生工 详见实验报告 SYBR Master MixtureTAKARADRR041B2/ 6样本收集Trizol 法抽取RNARNA 反转录获取cDNAReal-time qPCR2.主要器材器材名称来源Cat.NoNanodrop 分光光度计Thermo 2000/2000C稳压电泳仪上海天能EPS-600超细匀浆机FLUKO公司F6/10Real time PCR 仪器Agilent公司MX3000p反转录耗材Axygen四、实验步骤：1.总RNA 抽提（1）收取样品，Trizol 裂解。
细胞样品：收集细胞（6 孔板 80%细胞密度），2000 rpm 离心5min，去上清，细胞沉淀中加入1mL Trizol，充分混匀后室温静置 5 min，然后转移至新的 1.5 mL EP 管中；组织样品：将待研磨的组织样品从液氮或者-80℃冰箱中取出，无菌刀片于干冰上将组织样品切割成约 3 mm×3 mm×3 mm 大小，置于装有 1 mL Trizol 裂解液的 1.5mL EP 管中。
Real-Time PCR详细介绍
荧光定量PCR实验指南来源：易生物实验浏览次数：901网友评论0 条荧光定量PCR实验指南关键词：荧光实验指南第一部分一、基本步骤：1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对；2、引物、探针的设计；3、引物探针的合成；4、反应体系的配制；5、反应条件的设定；6、反应体系和条件的优化；7、荧光曲线和数据分析；8、标准品的制备；二、技术关键：1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对；从/网点的genbank中下载所需要的序列。
下载的方式有两种：一为打开某个序列后，直接点击“save”，保存格式为“.txt”文件。
保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。
然后，再打开DNAstar软件中的Editseq软件，点击“file”菜单中的“import”，打开后点击“save”，保存为“.seq”文件。
另一种直接用DNAstar软件中的Editseq软件，点击“file”菜单中的“openentrezsequence”，导入后保存为“.seq”文件，保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。
然后要对所有的序列进行排序。
用DNAstar软件中的Seqman软件，点击“sequence”菜单中的“add”，选择要比较的“.seq”的所有文件，点击“add”或“adda ll”，然后点击“Done”导入要比较的序列，再点击“assemble”进行比较。
横线的上列为一致性序列，所有红色的碱基是不同的序列，一致的序列用黑色碱基表示。
有时要设定比较序列的开始与结尾。
有时因为参数设置的原因，可能分为几组(contig)，若想全部放在一组中进行比较，就调整“project”菜单下的“parameter”，在“assembling”内的“minimum math percentage”默认设置为80，可调低即可。
再选择几个组，点击“contig”菜单下的“reassemble contig”即可。
realtime pcr操作流程
realtime pcr操作流程英文回答：Real-time PCR, also known as quantitative PCR (qPCR), is a widely used technique in molecular biology to detect and quantify DNA or RNA molecules. It is a sensitive and accurate method that allows researchers to measure gene expression levels, identify genetic variations, and detect pathogens.The general workflow of a real-time PCR experiment involves several steps:1. Sample preparation: This step involves extracting DNA or RNA from the sample of interest. Various methods can be used for sample preparation, such as phenol-chloroform extraction, column-based purification kits, or automated extraction systems. The quality and purity of the extracted nucleic acids are crucial for the success of the PCR reaction.2. Primer design: Primers are short DNA sequences that specifically bind to the target DNA or RNA region of interest. They are designed using bioinformatics tools and should have high specificity and minimal secondary structures. The forward and reverse primers are designed to flank the target sequence, and ideally, they should have similar melting temperatures.3. Reaction setup: The PCR reaction mixture is prepared by combining the extracted nucleic acids, primers, a DNA polymerase enzyme, and a fluorescent dye or probe. The reaction mixture is typically prepared in a PCR tube or plate. It is important to maintain proper aseptic techniques to prevent contamination.4. Thermal cycling: The PCR reaction goes through a series of temperature cycles in a thermal cycler machine. These cycles typically include denaturation, annealing, and extension steps. The denaturation step separates the DNA double strands, the annealing step allows the primers to bind to the target sequence, and the extension stepsynthesizes new DNA strands using the primers as templates. The number of cycles depends on the initial amount oftarget nucleic acid and the desired level of amplification.5. Data collection and analysis: Real-time PCR instruments monitor the fluorescence emitted by the fluorescent dye or probe during each cycle. The fluorescence signal increases proportionally to the amount of amplified DNA or RNA. The data can be plotted in a graph called the amplification curve, which shows the exponential growth of the target sequence. The threshold cycle (Ct) value, which represents the cycle number at which the fluorescence signal crosses a predetermined threshold, is used to quantify the initial amount of target nucleic acid.Real-time PCR is a versatile technique that can be adapted to various applications, including gene expression analysis, pathogen detection, and genetic testing. Itoffers high sensitivity, specificity, and quantification accuracy, making it an essential tool in molecular biology research and diagnostic laboratories.中文回答：实时荧光定量PCR（real-time PCR），也被称为定量PCR （qPCR），是分子生物学中广泛使用的一种技术，用于检测和定量DNA或RNA分子。
qPCR操作步骤教案资料
q P C R操作步骤QPCR（Real-time Quantitative PCR Detecting System）即实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统。
标准的两步法：RNA提取→随机引物反转录→反转录产物10倍稀释→real-time PCR.注意：1 高质量的RNA获取，这里的高质量不是强调RNA降解，而是强调RNA的纯度，不能含有基因组DNA,以及其他杂质污染。
基因组DNA的存在会导致定量偏高，给你错误的结果，所以一般用于定量PCR的RNA必须使用DNase 处理，消除DNA污染。
而RNA中的杂质的污染会限制real-time PCR的反应，导致扩增失败，给你假阴性的结果。
RNA的降解不是关键，一个是因为定量PCR 的引物扩增目的长度本身很短，150-250个bp，并不用于扩增目标基因的全长。
此外是因为存在内参基因，所以RNA降解会通过内参基因的测定来平衡。
毕竟一旦发生降解，所有的RNA以同样的速度降解，而相对比率不会改变。
2 减少加样误差，在使用SYBR Green MIX的时候，一定要先按照反应的量（比如8个孔）把所有的试剂一次性配成MIX然后分装，留出5微升的反应体系给模板，使用5微升是因为只有5微升以上，加样枪的误差才会比较小，如果你仅仅是吸取一微升的话，手重一点或者轻一点都会造成极大的加样误差，严重影响你的定量精确度。
3 选择合适的内参基因，一般用于定量PCR的内参基因有好几种，但却没有完全通用的内参基因。
具体到不同来源的细胞，比如不同组织来源，或者是动物等等，内参基因会有差异，最好的办法是，在你的样品上先测试内参基因，找到变化最小，最稳定的一个。
4 合适的引物设计，避免出现引物二聚体，非特异性扩增等。
Q-PCR实验流程：一、①实验前准备，每天早上到实验室后，先把超净工作台的紫外灯打开15-20分钟。
②超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套，RNA抽提需带口罩。
real time-QPCR实验指导
实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR，简称RT-QPCR, 属于Q-PCR的一种，目前该技术已得到广泛应用，如：扩增特异性分析、基因定量分析、基因分型、SNP分析等。
荧光定量PCR最常用的方法是DNA结合染料SYBR GreenⅠ的非特异性方法和Taqman 水解探针的特异性方法。
本视频使用LightCycler® 480 SYBR Green I Master试剂盒介绍SYBR Green I 的非特异性方法。
SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的荧光染料，可与所有的各种序列的双链DNA 分子结合。
在游离状态下，SYBR Green I 发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合，嵌入至dsDNA，荧光大大增强。
因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA 的数量相关，PCR 扩增不同时期中，dsDNA 含量不同，SYBR Green I 荧光信号强度不同。
可以根据荧光信号检测出PCR 体系存在的双链DNA 数量，并可根据对照进行相关的计算和分析。
实验前准备实验开始前，需准备好实验所需的各种试剂和耗材。
试剂包括：特异性PCR引物，新鲜提取备用的总RNA。
使用的试剂盒有：用于合成cDNA第一链的罗氏试剂盒Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit，包含了cDNA反应所需要的所有实验组分以及相关的正对照反应组分。
配套LightCycler® 480使用的试剂盒LightCycler® 480 SYBR Green I Master，包含了PCR所需的各种实验组分，如1号管中包含热启动Taq DNA Polymerase 及反应缓冲液，dNTP mix，SYBR Green I染料和MgCl2正式试验开始前，冰上解冻各个试剂及试剂盒组分，置于冰上待用。
注意：SYBR Green I Master需避光放置。
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Real-time qPCR手册---手把手教你从菜鸟到高手时间:2012-03-05 21:22来源:生物吧作者:刘浩点击: 13338 次由于Real-time qPCR的众多优点，现在已经是生命科学领域的一项常规技术。
越来越多的研究文章中涉及RT-PCR的实验，也基本上被real-time qPCR所代替。
由于real-time aPCR 输出的数据不同于常规的由于Real-time qPCR的众多优点，现在已经是生命科学领域的一项常规技术。
越来越多的研究文章中涉及RT-PCR的实验，也基本上被real-time qPCR所代替。
由于real-time aPCR 输出的数据不同于常规的PCR 电泳检测，很多没有做过real-time qPCR的研究者常常感到高深莫测，不知从何入手；甚至一些做过次实验的研究者也会对数据处理分析感到迷惑，不知所措。
本文就从real-time qPCR的发展史说起，包括real-time qPCR的原理，实验设计，实际操作，数据分析，常见问题解答五个方面，手把手教你从各个方面了解real-time qPCR，彻底的从菜鸟到高手！一、Real-time qPCR发展史Real-time qPCR就是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。
由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。
由于常规的PCR 的缺点，real-time qPCR由于其操作简便，灵敏度高，重复性好等优点发展非常迅速。
现在已经涉及到生命科学研究的各个领域，比如基因的差异表达分析，SNP检测，等位基因的检测，药物开发，临床诊断，转基因研究等。
在Real-time qPCR技术的发展过程中，定量PCR仪的发展起了至关重要的作用。
1995年，美国PE公司（已经并入Invitrogen公司）成功研制了 Taqman技术，1996年推出了首台荧光定量PCR检测系统，通过检测每个循环的荧光强度，通过Ct值进行数据分析。
从而荧光定量PCR获得广泛应用。
现在的定量PCR仪有ABI7000、7300、7500，7700、7900HT、StepOnePlusTM、StepOneTM、 PRISM@StepOneTM系列；BIO-RAD的CFX96、iCycler iQ5@、MyiQ@、MJ Research Chromo4TM Opticon 系列；Stratagene MxTM 系列；Roche LightCycler@系列；Eppendorf Masercycler@；Corbett Rotor-GeneTM；Cepheid SmartCycler@和BIOER的LineGene系列。
随国内生命科学的快速发展，科研水平不断提高，发高水平文章已不再是新鲜事。
与其同时，国内公司经过长期不懈的努力，也有自主研发的real-time PCR仪器生产比如西安天隆科技公司的TL系列仪器。
二、Real-time qPCR概述1. Real-time qPCR原理实时PCR就是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。
一般来讲，定量PCR仪包括：实时荧光定量PCR仪主要由样品载台、基因扩增热循环组件、微量荧光检测光学系统、微电路控制系统、计算机及应用软件组成。
其中基因扩增热循环组件工作原理与传统基因扩增仪大致相同，不同厂家不同型号的产品分别采用空气加热、压缩机制冷、半导体加热制冷等工作方式。
独特是这个微量荧光检测系统。
有由荧光激发光学部件、微量荧光检测部件、光路、控制系统组成。
常用的荧光激发方式有两种：卤钨灯和LED；荧光检测元件常用两种方式：光电倍增管和冷光CCD摄像机，光单色元件有滤光片和光栅。
在实时PCR扩增过程中，荧光信号被收集，转化为成为扩增和熔解曲线。
具体数据就是基线，荧光阈值和Ct值。
2. Real-time qPCR的数学原理首先来看一个real-time qPCR中的重要参数Ct值（Ct value），阈值（threshold），和基线（baseline）。
一般来讲，第3-15个循环的荧光值就是基线，是由于测量的偶然误差引起的。
阈值一般是基线的标准偏差的10倍。
在实际操作中也可以手动调节，位于指数期就可以。
Ct值就是荧光值达到阈值时候的PCR循环次数。
所以是一个没有单位的参数。
那么为什么说Ct值跟初始模板的量成反比呢？我们来看PCR的扩增方程：从线性方程上看，斜率（slope）为就可以算出扩增效率（0.99于100%，是由于PCR反应中存在抑制因素；而高于 100%可能一些污染、非特异性扩增或者是引物二聚体造成。
3. Real-time qPCR的种类根据real-time qPCR的化学发光原理可以分为2大类：一类为探针类，包括TaqMan@探针和分子信标，利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加；一类为非探针类，其中包括如SYBR@Green I或者特殊设计的引物(如LUX@Primers) 通过荧光染料来指示产物的增加。
3.1 Taqman@探针法Taqman@探针是最早用于定量的方法。
就在PCR扩增时加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸：5’端标记一个报告荧光基团，3’端标记一个淬灭荧光基团。
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，也就是FRET反应；PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。
3.2 分子信标法分子信标：一种在靶DNA不存在时形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针。
在此发夹结构中，位于分子一端的荧光基团与分子另一端的淬灭基团紧紧靠近。
分子信标的茎环结构中，环一般为15-30个核苷酸长，并与目标序列互补；茎一般5-7个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。
荧光基团连接在茎臂的一端，而淬灭剂则连接于另一端。
分子信标必须非常仔细的设计，以致于在复性温度下，模板不存在时形成茎环结构，模板存在时则与模板配对。
与模板配对后，分子信标的构象改变使得荧光基团与淬灭剂分开。
当荧光基团被激发时，它发出自身波长的光子。
3.3 SYBR@Green 法SYBR@Green I是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料，与双链DNA结合后，其荧光大大增强。
这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。
SYBR@Green I 的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。
在PCR反应体系中，加入过量SYBR@Green 荧光染料，SYBR@Green 荧光染料特异性地掺入DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR@Green 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
3.4 LUX@Primers法LUX@ (light upon extention) 引物是利用荧光标记的引物实现定量的一项新技术。
目标特异的引物对中的一个引物3’端用荧光报告基团标记。
在没有单链模板的情况下，该引物自身配对，形成发夹结构，使荧光淬灭。
在有目标片断的时候，引物与模板配对，发夹结构打开，产生特异的荧光信号。
4. Real-time qPCR和常规PCR的区别实时检测（在对数扩增时期）而不是终点检测敏感性高需要样品少特异性高精确定量据分析（这一部分单独说明）。
1. 实验材料的处理和准备以最基本的基因表达差异分析为例。
实验材料分为对照组（CON）和处理组（TRT）。
组内要有生物重复，可以数据分析此处理是否有统计意义。
在材料收集过程中，尽量避免RNA的降解（尤其对于绝对定量的样品）。
一般传统的收集材料的方法是样品采集立刻液氮速冻，然后迅速转移到超低温冰箱保存，但这种方法携带不方便，由于对于异地取材。
现在新技术的发展，也有一些非液氮类的样品储存液，比如百泰克的RNAfixer 。
2. 引物设计一般real-time PCR引物的设计遵循下面一些原则：扩增产物长度在80-150bp。
引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
产物不能形成二级结构。
产物长度一般在15-30碱基之间。
G+C含量在40%-60%之间。
碱基要随机分布。
引物自身不能有连续4个碱基的互补。
引物之间不能有连续4个碱基的互补。
引物5’端可以修饰。
引物3’端不可修饰。
引物3’端要避开密码子的第3位。
Taqman@探针的设计稍有不同，一般有公司设计合成。
遵循下面以下原则：尽量靠在上游引物；长度30-45bp，Tm比引物高至少5℃；5’端不要是G，G会有淬灭作用，影响定量四、Real-time qPCR操作过程1. RNA提取和反转录在抽提RNA过程中任一环节的不正确操作都可能导致RNA酶的污染。
由于RNA酶的活性很难完全抑制，预防其污染是十分必要的。
在实际的操作中应遵循下面一些原则：1. 全程佩戴一次性手套。
皮肤经常带有细菌和霉菌，可能污染RNA的抽提并成为RNA酶的来源。
培养良好的微生物实验操作习惯预防微生物污染。
2. 使用灭菌的，一次性的塑料器皿和自动吸管抽提RNA，避免使用公共仪器所导致的RNA酶交叉污染。
例如，使用RNA探针的实验室可能用RNA酶A或T1来降低滤纸上的背景，因而某些非一次性的物品（如自动吸管）可能富含RNA酶。
3. 在提取裂解液中，RNA是隔离在RNA酶污染之外的。
而对样品的后续操作会要求用无RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。
玻璃器皿可以在150°C的烘箱中烘烤4小时。
塑料器皿可以在0.5M NaOH 中浸泡10分钟，用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。
当然，这些也不是绝对的要求。
如果是操作熟练。
完全可以用初次开封的离心管和枪头，新过滤的超纯水，进行RNA的提取。
2.Mix配制一般来讲，进行real-time qPCR MasterMix都是2×的浓缩液，只需要加入模板和引物就可以。
由于real-time qPCR灵敏度高，所以每个样品至少要做3个平行孔，以防在后面的数据分析中，由于Ct相差较多或者SD太大，无法进行统计分析。
通常来讲，反应体系的引物终浓度为100-400mM；模板如果是总RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情况下是1ul或者1ul的10倍稀释液，要根据目的基因的表达丰度进行调整。
当然这些都是经验值，在操作过程中，还需要根据所用MasterMix，模板和引物的不同进行优化，达到一个最佳反应体系。