《中国药典》薄层色谱的基本要求

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薄层色谱法

薄层色谱法
Ø 蒸气熏蒸显色:可用双
槽展开缸或适宜大小的干燥
器代替,如碘蒸汽。
l检视装置
为装有可见光、 254nm(荧光萃灭)及 365nm紫外光光源及相 应的滤光片的暗箱, 可附加摄像设备供拍 摄图像用,暗箱内光 源应有足够的光照度。
l薄层色谱扫描仪
系指用一定波长的光对薄层板上有吸收的斑点, 或经激发后能发射出荧光的斑点,进行扫描,将 扫描得到的谱图和积分数据用于物质定性或定量 的分析仪器。
薄层色谱法可针对不同的样品采用不同的显色 方法和显色剂进行显色,从而可以专门针对某一 化合物进行检视,或对紫外光和可见光下无吸收 的化合物进行检视。极大的提高了薄层检视的专 属性与灵敏性。这是薄层色谱法灵活性的一个集 中体现。即同一薄层板可生成可见光、紫外光谱、 荧光光谱和荧光淬灭光谱。
主要的显色方法有:喷雾显色、浸渍显色与蒸 气熏蒸显色。
四、点样操作
l 点样前薄层板准备
Ø薄层板表面应均匀、平整、光滑,无麻点、无气 泡、无破损及污染。铝基片薄层板可根据需要剪 裁,但须注意剪裁后的薄层板底边的硅胶层不得 有破损。
Ø临用前一般应在110℃活化30分钟。聚酰胺薄膜不 需活化。
Ø如在存放期间被空气中杂质污染,使用前可用异 丙醇、二氯甲烷、甲醇或二者的混合溶剂(8:2) 在展开缸中上行展开预洗,取出,晾干,110℃活 化,置干燥器中备用。(注意标记方向)
有的品种可以熏以试剂或试液的蒸气(如碘蒸气、氨蒸 可采用摄像设备拍摄, 以光学照片或电子图像 的形式保存。也可用薄 层扫描仪扫描记录相应 的色谱图。(在紫外光 下拍摄时,应使用适宜 的滤光片滤除紫外光。)
八、系统适用性试验
按各品种项下要求对实验条件进行系统适用性试 验,即用供试品和对照品对实验条件进行试验和调整, 应达到规定的检测灵敏度、分离度、重复性和比移值 要求。

薄层色谱法确认方案

薄层色谱法确认方案

亳州市远光中药饮片厂薄层色谱法确认方案文件编号:QY·TS·05·002-01批准日期:年月日实施日期年月日薄层色谱法确认方案1、确认的目的;2、确认的范围;3、实施人员及人员职责;4、确认方案的培训;5、实施过程中出现变更和偏差处理;6、样品信息;7、试验所用仪器及试剂;8、确认项目及方法;9、结论评估及判定;10、再确认;11、风险评估。

1、确认的目的:建立薄层色谱法确认方案,在试验中严格按照标准操作,保证试验结果的真实可信,以确认杂质测定法按《中国药典》2015版一部的测定方法符合我厂的检验需要。

2、确认范围:《中国药典》2015版一部中的用于薄层色谱鉴别的薄层色谱法。

3、确认小组成员及职责4、确认方案的培训:确认方案的批准后,必须对所有确认实施人员进行该方案及相关操作规程的培训,培训合格后方可进行确认方案的实施。

5、实施过程中出现变更和偏差处理:在实施过程中,出现变更和偏差时,要及时上报确认小组,由确认小组进行风险评估,然后报验证委员会的评估结论审批。

6、样品信息:本次试验用山药作为供试品,用两个人分别做两组试验来确认薄层色谱法是否符合我厂需要。

对照药材必须为国家法定标准物质并且在有效期内。

7、试验所用仪器及试剂:7.1试验所用仪器必须经过校验,并且在校验有效期内。

试验用仪器使用前必须挂有“已清洁”、“完好”标志。

保证试验的正常运行。

7.2试验所用试剂必须在有效期内以保证试验的正常运行,降低风险。

8、确认项目及方法:8、1确认项目为山药的薄层鉴别。

8、2确认的方法为按照《中国药典》2015版一部中关于山药的薄层鉴别方法:取本品粉末5g,加二氯甲烷30ml,加热回流2小时,滤过,滤液蒸干,残渣加二氯甲烷1ml使溶解,作为供试品溶液。

另取山药对照药材5g,同法制成对照药材溶液。

照薄层色谱法(附录ⅥB)试验,吸取上述两种溶液各4μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液(9:1:0.5)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%磷钼酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰。

薄层色谱法测定操作规程

薄层色谱法测定操作规程

标准操作规程目的:为规范薄层色谱法测定检查操作,确保实验的准确性,依据《中国药典》2020版四部和《药品生产质量管理规范》(2010年修订),特制定本规程。

适用范围:适用于用薄层色谱法进行鉴别、检查或含量测定。

依据:《中国药典》2020版第四部57页0502“薄层色谱法”《药品生产质量管理规范》2010年修订责任:检验员负责本规程的实施。

内容:1.简述:薄层色谱法系将供试品溶液点样于薄层板上,在展开容器内用展开剂展开,使供试品所含成分分离,所得色谱图与适宜的标准物质按同法所得的色谱图对比,亦可用薄层色谱扫描仪进行扫描,用于鉴别、检查或含量测定。

2.TLC的原理:通常所说的薄层色谱一般是指吸附薄层色谱,可根据TLC所采用的涂层材料性质的不同,其物理化学原理也有所不同,可分为:2.1 吸附薄层色谱:采用硅胶、氧化铝等吸附剂铺成薄层,利用吸附剂表面对不同组分吸附能力的差别达到分离的方法。

最为广泛的方法由于混合物中的各个组分对吸附剂(固定相)的吸附能力不同,当展开剂(流动相)流经吸附剂时,发生无数次吸附和解吸过程,吸附力弱的组分随流动相迅速向前移动,吸附力强的组分滞留在后,由于各组分具有不同的移动速度,最终得以在固定相薄层上分离。

2.2 分配薄层色谱:由硅胶、纤维素铺成薄层,不同组分在指定的两相中有不同的分配系数。

2.3 离子交换薄层色谱:由含有交换活性基团的纤维素辅成薄层。

2.4 排阻薄层色谱:利用样品中分子大小不同,受阻情况不同加以分离,也称凝胶薄层。

3.仪器与材料:3.1 薄层板:按支持物的材质分为玻璃板、塑料板或铝板等;按固定相种类分为硅胶薄层板、键合硅胶板、微晶纤维素薄层板、聚酰胺薄层板、氧化铝薄层板等。

固定相中可加入黏合剂、荧光剂。

硅胶薄层板常用的有硅胶G、硅胶GF254、硅胶H、硅胶HF254、G、H表示含或不含石膏黏合剂。

F254为在紫外光254nm波长下显绿色背景的荧光剂。

按固定相粒径大小分为普通薄层板(10~40μm)和高效薄层板(5~10μm)。

《中国药典》薄层色谱的基本要求

《中国药典》薄层色谱的基本要求

点样
点多少? 常规的TLC:0.5-5μl, 高效TLC:HPTLC: < 1μl;
用什么点? 常规:手工一般使用定量毛细管(0.5/1/2和5μl),点样 是毛细管必须完全充满和完全排空,要以垂直方向小心接 触TLC/ HPTLC板面,(玻璃毛细管不易损伤预制板的板面),切忌斑点
或条带在原点因溶剂过大造成原点的扩散,一般建议控制在5μl以下。
新增薄层色谱鉴别要求
供试品溶液的制备:应尽可能除去干扰,同时方法尽量简便,
首先进行提取、纯化选择,如回流、超声提取方法,溶剂、时间, 酸碱处理,溶剂萃取,柱子纯化等的选择
对照品选择:尽量采用以对照品和对照提取物或对照药材同时进行
对照。当对照品不易获得时,可采用对照提取物或对照药材为对照
薄层板的选择:吸附剂的比较,选硅胶G板还是GF254板
所需硫酸浓度(V/V)
硫酸(ml)
水(ml)
100
95.5
68
100
57
100
50
100
பைடு நூலகம்
39.5
100
34
100
27.5
100
10.8
100
显色
对同一薄层板在UV254、365nm、可见光(衍生前和/或 后)下观察——给出丰富的化学结构类型信息;
TLC板上常含有UV指示剂(F-254),在UV254nm激发 下产生有色荧光。对UV254nm有吸收的物质存在于斑点 上时发射的荧光会减弱(荧光淬灭);
同板多个样品平行比较
成本相对低廉、色谱生成快速、同板可以 同时产生多达16~18个样品色谱,共平行 直观地比较,色彩丰富的图像给人的视觉 冲击远远大于较为“呆板”的轮廓色谱图, 可以迅速地、粗略地,而且颇为有效地评 价样品色谱图像之间的相试程度。

《中国药典》薄层色谱的基本要求剖析

《中国药典》薄层色谱的基本要求剖析

新增薄层色谱鉴别要求
供试品溶液的制备:应尽可能除去干扰,同时方法尽量简便,
首先进行提取、纯化选择,如回流、超声提取方法,溶剂、时间, 酸碱处理,溶剂萃取,柱子纯化等的选择
对照品选择:尽量采用以对照品和对照提取物或对照药材同时进行
对照。当对照品不易获得时,可采用对照提取物或对照药材为对照
薄层板的选择:吸附剂的比较,选硅胶G板还是GF254板
确定供试品取样量、提取和纯化方法、点样量等条件 选择合适的对照物质,确定对照物质用量、 浓度、溶剂、点样量等
中药材薄层色谱鉴别
多来源药材、饮片的色谱行为是 否一致 混淆品的区别 斑点是否重叠
专属性
重复性
验证 耐用性
不同品牌的薄层板或自制薄层板考察 考察至少2~3个品牌或厂家的薄层板,
重现性
不同温度、湿度考察,在5℃~35℃ 考察高低2个温度;在低相对湿度 (RH)15~30%和高相对湿度75~90% 各考察一个相对湿度
供起草用样品的要求
注意
中药材、饮片要求专家鉴定
对于具有多种不同规格的中成药,应收齐全部规格的样品
试验用样品必须采用合格原辅料依法生产的样品,收集的每批 样品均要有该企业的原辅料和成品的自检报告及详细生产工艺
供起草用样品的要求
阴性对照样品
生产单位应尽可能提供
研究单位自制
阴性样品系指按处方除去被测定的药味,按制法制备的 样品,注意应包括所有的辅料和工艺步骤,制中药标准制定技术要求
原则
保证用药安全 科学、先进、规范、适用 促进标准国际化
中药标准制定技术要求
中药标准制定 《国家药品标准工作手册》中药质量标准 研究制定技术要求 方法学验证 中药质量标准方法学验证指导原则 (中国药典2010版一部)

03薄层色谱法检验操作规程

03薄层色谱法检验操作规程

目 的:建立薄层色谱法的标准操作规程。

范 围:本规程适用于薄层色谱法。

职 责:检验员、QC 主任。

依 据:《中国药典》2010年版。

内 容:方法一(中国药典2010年版一部)1 简述薄层色谱法系指以适宜的固定相涂布于玻璃板、铝箔片或聚酯薄膜上使成一均匀的薄层,将供试品与相应的对照物点于薄层板的一端,以适宜的溶剂置展开容器内展开,使供试品所含的相应成分分离,采用适宜的显色剂或显色方法显色,将供试品色谱与对照物色谱相比较,或采用薄层扫描仪扫描,以进行鉴别、检查或含量测定的方法。

2 仪器与材料2.1 薄层板按照固定相的种类,薄层板可分为正相薄层板(如硅胶薄层板、聚酰胺薄膜)、反相薄层板(如C 18键合相薄层板)等。

硅胶薄层板是目前使用最广的薄层板,如硅胶G 、硅胶GF 254、硅胶H 和硅胶HF 254等。

高效薄层板所使用的固定相较普通薄层板平均粒度小,颗粒分布范围窄,因此在相对短的展开距离中可以达到更好的分离效果。

目前使用的薄层板有市售薄层板和自制薄层板两种。

一般市售薄层板分离效果较自制薄层板好。

如需特殊薄层板(如改性板)时,可采用自制薄层板。

2.2 点样器2.2.1 手动点样主要用微升毛细管、微量注射器或配合与之相应的手动点样仪等。

2.2.2 自动点样采用半自动点样仪或全自动点样仪,按预设程序自动点样。

2.3 展开容器 又称展开缸,为大小适宜的密闭展开容器。

有双槽展开缸及平底展开缸等。

此外,也有自动展开仪器,可将薄层板按预定程序单次或多次展开,提高薄层展开的重现性。

2.4 显色设备包括喷雾显色、浸渍显色以及蒸气熏蒸显色的设备。

2.4.1 喷雾显色多用玻璃喷雾瓶或其它专用的喷雾设备,喷雾形成的雾滴应细小并且均匀。

2.4.2 浸渍显色多在盛有显色剂的展开缸中进行。

2.4.3 蒸气熏蒸显色可在密闭的展开缸、干燥器等设备中进行。

如薄层板需加热,可使用烘箱或专用的薄层加热台。

2.5 检视和记录设备由暗箱及摄像设备组成。

《中国药典》薄层色谱的基本要求

《中国药典》薄层色谱的基本要求

薄层色谱技术在中药标准的优势

薄层色谱独有的特点是分析结果以直观的 彩色图像表达,为其它色谱技术所不能。 而图像给出的多层面的信息是文字难以表 达的,而且丰富多彩的图像可以给分析者 更多的思考判断的空间。
提供直观的彩色图像是薄层色谱独有的特点
离线操作的灵活性


各单元操作既有关联,又相互独立,点样 器材和方法、展开方式、显色试剂选择、 直观比较或扫描比较可根据需要灵活变通。 根据需要操作可以视实际需要和实验室条 件分层次进行和终止,节省分析时间和资 源。 由于是离线操作,所以个人占机时间短。
中成药薄层色谱鉴别

(1)薄层色谱具有分离与鉴别的特性,并具有直观、承载信 息大、专属性强、快速、经济、操作简便等优点,是中成 药鉴别的首选方法。
(2)新建立的薄层色谱应该图谱清晰,斑点明显,分离 度、专属性、重现性与耐用性符合要求,并需要提供图谱;
(3)应尽量与该药材和饮片的薄层色谱鉴别方法一致,如因其他成分 干扰或制剂的提取方法不同,可增加提取纯化处理或展开剂优化。
展开剂的优化

主要考虑两方面:溶剂的极性和溶剂的选择性。
前者要求使待分离的主要物质的Rf值在0.3~0.7之间;当Rf值符合要求 后,进行等强度溶剂替换,直到分离度达到要求为止。



对于硅胶等吸附薄层和正相分配色谱来说,展开 剂的极性越大,溶剂强度就越大,洗脱能力就越 强,即同一物质在薄层板上的Rf值越大。 根据文献和样品所含化合物类型选择,并记录色 谱 纯溶剂→增减溶剂强度→混合,改性试剂,添加 酸碱、水等→获得最佳配比
新增薄层色谱鉴别要求
点样量选择:不同点样量的比较
展开剂选择:对三个以上的展开系统进行考察比较

中国药典2005年版中药薄层色谱鉴别技术

中国药典2005年版中药薄层色谱鉴别技术

中国药典2005年版中药薄层色谱鉴别技术中药的真伪优劣直接关系到人民用药的安全和有效。

在检验中药真伪方面通常采用的检测手段有形态鉴别、理化鉴别和光谱色谱分析等。

而作为色谱技术一个分支的薄层色谱由于其独具的长处而被广泛应用于中药分析。

自从《中华人民共和国药典》(1990年版一部)起,薄层色谱鉴别除有化学对照品作为鉴别药材的指标成分对照品以外,鉴于单一化学对照品不能反映药材的整体特征,一些多种植物共存的化学成分没有专属性,以及没有化学对照品鉴别就无法进行的问题,开始增加了“对照药材”,以药材对照品的色谱整体为特征进行对比鉴别,解决了上述存在的问题,并于1993年出版了《中华人民共和国药典1990年版中药薄层色谱彩色图集》,作为中药薄层鉴别的重要参考资料。

在该书的第一章中根据多年的实践经验并参考Friedrich Geiss的《Fundamentals of Thin Layer Chromatography (Planar Chromatography)》一书的内容,从实用的角度叙述了薄层色谱实际操作中的各个环节的注意事项,起到了薄层色谱操作规范化的指导作用。

但是直至中国药典2000年版,中药薄层色谱鉴别基本是以手工点样、实验室自制薄层板为基础的较为粗放的操作进行试验,由于硅胶材料的质量不高和手工操作的个体差异较大,致使色谱质量仍然不高,分离度、重现性均难以达到满意的效果。

尽管自上世纪90年代以来,国外尤其是欧洲国家在薄层色谱技术及相应的仪器开发逐步有了很大发展,目前已经达到单元操作计算机自动化,高质量商品预制薄层板(常规板与高效板)代替了自制薄层板,进入一个高层次的仪器化和微机化的阶段。

美国药典、欧洲药典等对草药(植物药)均采用薄层色谱鉴别,并有规范化的要求,以保证结果的专属性和可重现性,这对药典的实施是非常重要的。

因而我国药典在中药的薄层色谱鉴别的应用和推广也需要在技术层面有明显的提高。

在实验室条件方面。

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供起草标准用样品的要求 中成药薄层色谱鉴别 中药材薄层色谱鉴别
精品课件
中药标准制定技术要求
原则
保证用药安全
科学、先进、规范、适用
促进标准国际化
精品课件
中药标准制定技术要求
中药标准制定 《国家药品标准工作手册》中药质量标准
研究制定技术要求 方法学验证
中药质量标准方法学验证指导原则 (中国药典2010版一部)
尽量采用对照品和对照提取物或对照药材同时进行对照
图谱清晰、斑点明显、分离度与重现性符合要求 根据被测物的特性选择合适的固定相、展开剂及显 色方法等色谱条件
色谱条件的优化应对三个以上的展开系统进行考察
确定供试品取样量、提取和纯化方法、点样量等条件
选择合适的对照物质,确定对照物质用量、 浓度、溶剂、点样量等
阴性对照样品
生产单位应尽可能提供
研究单位自制
阴性样品系指按处方除去被测定的药味,按制法制备的 样品,注意应包括所有的辅料和工艺步骤,制成量应与 原标准相符
精品课件
鉴别
鉴别
显微鉴别 理化鉴别
色谱鉴别
特征图谱鉴别
一般理化鉴别 荧光鉴别 光谱鉴别
薄层色谱鉴别 液相色谱鉴别 气相色谱鉴别
精品课件
中药材薄层色谱鉴别
样品量除满足起草研究、留样观察外,还应有不少 于3倍检验量的样品供复核用
精品课件
供起草用样品的要求
注意
中药材、饮片要求专家鉴定
对于具有多种不同规格的中成药,应收齐全部规格的样品
试验用样品必须采用合格原辅料依法生产的样品,收集的每批 样品均要有该企业的原辅料和成品的自检报告及详细生产工艺
精品课件
供起草用样品的要求
精品课件
供起草用样品的要求
研究用样品应具有代表性,覆盖面要广, 一般至少收集15批以上样品供研究用;
对于多来源品种,每种收集3~5种;相关信息包括:产地 (如有可能表明野生或家种)、收集地、收集时间、收集人
独家生产的应不少于10批,多家企业生产的应尽量收集 每家企业的样品,5家以上企业生产的应至少收集5~10家 企业生产的样品
精品课件
中成药薄层色谱鉴别
(1)薄层色谱具有分离与鉴别的特性,并具有直观、承载信 息大、专属性强、快速、经济、操作简便等优点,是中成 药鉴别的首选方法。
(2)新建立的薄层色谱应该图谱清晰,斑点明显,分离 度、专属性、重现性与耐用性符合要求,并需要提供图谱;
(3)应尽量与该药材和饮片的薄层色谱鉴别方法一致,如因其他成分 干扰或制剂的提取方法不同,可增加提取纯化处理或展开剂优化。
精品课件
新增薄层色谱鉴别要求 点样量选择:不同点样量的比较 展开剂选择:对三个以上的展开系统进行考察比较 显色条件选择:日光、紫外光、显色剂 阴性空白试验:以证明其他药味无干扰 耐用性:不同厂牌的薄层板、温度、相对湿度等
精品课件
注意
(1)使用对照药材应保证药材的主斑点在样品中均有对应斑点(可参 照制法对药材进行前处理),供试品色谱中不能只有对照药材色谱中的 1~2个次要斑点相对应
精品课件
新增薄层色谱鉴别要求
供试品溶液的制备:应尽可能除去干扰,同时方法尽量简便,
首先进行提取、纯化选择,如回流、超声提取方法,溶剂、时间, 酸碱处理,溶剂萃取,柱子纯化等的选择
对照品选择:尽量采用以对照品和对照提取物或对照药材同时进行
对照。当对照品不易获得时,可采用对照提取物或对照药材为对照
薄层板的选择:吸附剂的比较,选硅胶G板还是GF254板
色谱后衍生的专属性
色谱后灵活方便的衍生技术,同一色谱薄层板可 生成可见光谱、紫外光谱、荧光淬灭光谱或荧光 光谱,给出丰富的检测成分的化学类别信息。如 三氯化铝试剂是黄酮类化合物的专属试剂;碘化 铋钾是生物碱类成分的专属试剂;三氯化铁是酚 类成分的专属试剂;醋酐硫酸是三萜类和甾醇类 成分的专属试剂等。硫酸则是许多成分激发产生 荧光的通用试剂,非常方便。
由于是离线操作,所以个人占机时间短。
精品课件
正相色谱流动相(展开剂)的广泛适用性
薄层色谱最常用的是以硅胶板为基础固定相的正 相色谱,有多种组合的有机溶剂展开系统可供选 择;
甲苯系统;三氯甲烷系统;己烷系统;正丁醇系 统;乙酸乙酯系统等等。
酸性、碱性、中性。 高极性、中等极性、低极性。
精品课件
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同板多个样品平行比较
成本相对低廉、色谱生成快速、同板可以 同时产生多达16~18个样品色谱,共平行直 观地比较,色彩丰富的图像给人的视觉冲 击远远大于较为“呆板”的轮廓色谱图, 可以迅速地、粗略地,而且颇为有效地评 价样品色谱图像之间的相试程度。
精品课件
《中国药典》薄层色谱的基本要 求
(2)尽可能采取一个供试液多项多维鉴别使用的薄层色谱方法,达到 节约资源、保护环境、简便实用的目的
精品课件
薄层色谱技术在中药标准的优势
薄层色谱独有的特点是分析结果以直观的 彩色图像表达,为其它色谱技术所不能。 而图像给出的多层面的信息是文字难以表 达的,而且丰富多彩的图像可以给分析者 更多的思考判断的空间。
精品课件
提供直观的彩色图像是薄层色谱独有的特点
精品课件
离线操作的灵活性
各单元操作既有关联,又相互独立,点样 器材和方法、展开方式、显色试实验室条 件分层次进行和终止,节省分析时间和资 源。
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中药材薄层色谱鉴别
验证
专属性 重复性 耐用性 重现性
多来源药材、饮片的色谱行为是 否一致 混淆品的区别 斑点是否重叠
不同品牌的薄层板或自制薄层板考察 考察至少2~3个品牌或厂家的薄层板,
不同温度、湿度考察,在5℃~35℃ 考察高低2个温度;在低相对湿度 (RH)15~30%和高相对湿度75~90% 各考察一个相对湿度
《中国药典》薄层色谱的 基本要求
周 兰
贵州省食品药品检验所中药(民族药)室 2014年5月
精品课件
内容
薄层色谱技术在中药标准的优势 《中国药典》薄层色谱的基本要求 薄层色谱应用的影响因素
精品课件
薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部 附录Ⅵ B),系将供试品溶液点于薄层板 上,在展开容器内用展开剂展开,使供试 品所含成分分离,将所得色谱图与对照物 按同法所得的色谱图比较,并可用薄层扫 描仪进行扫描,用于鉴别、检查或含量测 定的方法。
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