纤维素降解菌
纤维素降解菌菌落特征
纤维素降解菌菌落特征摘要纤维素是一种常见的生物质，具有广泛的应用前景。
纤维素降解菌是一类能够分解纤维素的微生物，对于纤维素的降解起着关键作用。
本文将详细介绍纤维素降解菌菌落特征，包括形态、生长条件、代谢途径等方面，为深入研究纤维素降解机制和应用提供参考。
1. 引言纤维素是一种由葡萄糖分子构成的多糖，广泛存在于植物细胞壁中。
由于纤维素的高强度、低能值等特点，其降解一直是科学家们的研究热点。
纤维素降解菌是能够分解纤维素的微生物，可以将复杂的纤维素分解成较简单的可利用碳源，具有重要的应用价值。
2. 纤维素降解菌的形态特征纤维素降解菌在形态上具有一定的特征，如形状、大小等。
主要表现为以下几个方面：2.1 菌落形态纤维素降解菌菌落形态多样，包括分散菌落和粘附菌落。
分散菌落呈点状或星状，边界清晰，颜色多为白色或淡黄色。
粘附菌落则呈不规则形态，边界模糊，颜色多为淡黄色或褐色。
2.2 菌体形状纤维素降解菌的菌体形状主要有纤维状、棒状、球状等。
纤维状的菌体长而细，类似于纤维素的形态；棒状的菌体较短而粗，类似于棒状杆菌；球状的菌体则呈圆形或卵圆形。
2.3 纤维素降解菌的其他形态特征除了上述形态特征外，纤维素降解菌还具有菌落大小、菌体长度等变异性。
不同的纤维素降解菌在形态特征上存在一定的差异，这也为纤维素降解机制的研究提供了基础。
3. 纤维素降解菌的生长条件纤维素降解菌的生长需要适宜的条件，包括温度、pH值、营养物质等。
以下是纤维素降解菌生长的一些关键条件：3.1 温度纤维素降解菌的适宜生长温度一般在30-40摄氏度之间。
温度过高或过低都会抑制其菌落形成和生长，影响纤维素降解效率。
3.2 pH值纤维素降解菌对pH值的适应范围较广，一般在5-9之间。
过低或过高的pH值都会对纤维素降解菌的生长产生不良影响。
3.3 营养物质纤维素降解菌对不同的营养物质有不同的需求。
一般需要提供适量的碳、氮、矿物质等营养物质，以维持其正常的生长和代谢。
降解纤维素菌株的筛选
２ 和 Ｐ－ １、 Ｐ－ ２ 都 能 在 羧 甲 基 纤 维 素 琼 脂 培 养 基 上 生
长 ， 且长势良好 ； Ｔ－ １、 Ｔ－ ２ 和 Ｐ－ １、 Ｐ－ ２ 也 都 能 使 滤 纸 条 溃 烂 ， 但 在 ＣＭＣ平 板 上 Ｔ－ １、 Ｔ－ ２ 的 菌 落 直 径 要 比 Ｐ－ １、 Ｐ－ ２ 的菌落大 ， 接种 Ｔ－ １、 Ｔ－ ２ 的 滤 纸 条 培 养 基中 的 滤 纸 条 崩 溃 程 度 明 显 高 于 接 种 Ｐ－ １、 Ｐ－ ２ 的 滤 纸 条 培 养 基 ， 而 且 Ｔ－ １、 Ｔ－ ２ 使 滤 纸 条 崩 溃 的 时 间 也 比 Ｐ－ １、 Ｐ－ ２ 短。由此初步判断 Ｔ－ １、 Ｔ－ ２ 对 滤 纸 条 的 降解性能比 Ｐ－ １、Ｐ－ ２强。
Ｐ－ １ 具有较高 的 滤 纸 酶 活 和 。其 中 又 以 Ｔ－ １ 的 滤 纸 酶
活力和羧甲基纤维素酶活力最高 ， 培养 １５６ｈ 时 Ｔ－ １ 的 羧甲基纤维素酶活达到 ６８．６１Ｕ／ｇ， 此后一直维持较稳
Ｎｏ． ８． ２００６
５１
基础理论
６４８．８０Ｕ／ｇ和 ５７３．５７Ｕ／ｇ， 并 且 在 整 个 发 酵 过 程 中 Ｐ－ １、 Ｐ－ ２ 所产 β － 葡萄糖苷酶都能保持在较高、较稳定的水
（２） 滤 纸 条 培 养 基 ： （ＮＨ４）２ＳＯ４ １ｇ， ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ，
・ ＭｇＳＯ４ ７Ｈ２Ｏ ０．７ｇ， ＮａＣｌ ０．５ｇ， 蒸 馏 水 １０００ｍＬ， 新 华 定量滤纸条 ６ｃｍ× １ｃｍ。 以上培养基均在 １２１℃湿热灭菌 ３０ｍｉｎ后使用。
１．２．３
固态发酵产酶培养基渣 ７ｇ， 麸皮 ３ｇ， （ＮＨ４）２ＳＯ４
的 柠 檬 酸 缓 冲 液 ）０．７５ｍＬ， 加 入 粗 酶 液 ０．２５ｍＬ， ５０℃ 恒 温 水 浴 保 持 １ｈ， 加 入 ＤＮＳ试 剂 ， 于 沸 水 浴 中 放 置
纤维素降解菌的筛选及其产酶特性
纤维素降解菌的筛选及其产酶特性杨艳;姜立春;林寿露;杨熙;彭显清;彭正松;阮期平【摘要】The optimal CY10 producing strain of enzyme producing conditions are the experimental basis for the biodegradation of cellulose.A cellulose - degrading bacterial strain was isolated from the rottenwood and its some important culture conditions and enzymatic properties were studied. The optimal enzyme producing condi-tions for this degrading bacterial strain were acquired as follows:wheat bran(as carbonsource)concentration 20 g / L,yeast powder(as nitrogens ource)concentration 5. 0 g / L,culture temperature 30 ℃,initial pH 6. 5,cul-ture time 42 h. The optimum temperature and optimal pH value for the activities of CMC enzyme and filter - paper enzyme produced by this degrading bacterium were 45 ℃ and 6. 5,resp ectively. Under these conditions,the CM-Case and FPase activity of CY10 strain were 21. 26 U/ mL and 23. 57 U/ mL,respectively. Therefore,the CY10 strain has a good prospect in the biodegradation of cellulose.%优化纤维素降解菌株 CY10产酶条件，为该菌株在纤维素的生物降解方面提供实验依据.通过单因素试验对 CY10菌株产酶条件进行优化，依据纤维素酶（CMCase）和滤纸糖化酶（FPase）活力大小确定最适培养时间、初始 pH、碳源、氮源、温度、接种量及装液量等.结果表明：菌株 CY10产酶的最适初始 pH 为6.5，碳源为麦麸（2.0%），氮源为酵母粉（0.5%），在30益培养42 h；该菌株所产 CMC 酶和滤纸酶的酶活性最适温度为45益，最适 pH 为6.5.在此条件下，CY10菌株的 CMCase 和 FPase 活力分别达到21.26 U/ mL 和23.57 U/ mL.为此，菌株CY10在纤维素的生物降解方面具有较好的应用前景.【期刊名称】《绵阳师范学院学报》【年(卷),期】2016(035)005【总页数】7页(P65-71)【关键词】纤维素降解菌;纤维素酶;培养条件;优化;酶学性质【作者】杨艳;姜立春;林寿露;杨熙;彭显清;彭正松;阮期平【作者单位】西华师范大学西南野生动植物资源保护教育部重点实验室，四川南充637009; 绵阳师范学院分子生物学与生物制药重点实验室，四川绵阳 621006;绵阳师范学院分子生物学与生物制药重点实验室，四川绵阳 621006;绵阳师范学院分子生物学与生物制药重点实验室，四川绵阳 621006;绵阳师范学院分子生物学与生物制药重点实验室，四川绵阳 621006;绵阳师范学院分子生物学与生物制药重点实验室，四川绵阳 621006;西华师范大学西南野生动植物资源保护教育部重点实验室，四川南充 637009;绵阳师范学院分子生物学与生物制药重点实验室，四川绵阳 621006【正文语种】中文【中图分类】Q939.9纤维素是地球上分布最广泛、含量最丰富的可再生有机资源，其不断通过光合作用得以补充[1].在自然环境中，纤维素类物质形态稳定且降解缓慢，目前对其利用很不充分，除小部分用于堆肥、畜禽饲料外，大部分作为燃料直接燃烧，不仅造成资源浪费，同时也会污染环境[2].因此，人类对于纤维素资源的利用程度比较有限，还处在一种低值化、无序化状态[3].对纤维素降解问题的研究能够为解决环境问题和纤维素资源的开发利用问题提供重要的理论依据.如能科学合理利用纤维素不仅可以减少废弃物对环境的污染，还可以提供一种可再生资源.采用合适的方法与技术对这些可再生的纤维素资源降解为可利用的生物有机质，对解决当今所面临的食物短缺、能源危机和环境污染问题具有重大的现实意义[4].目前，对于纤维素分解菌选育应用研究较多的是细菌、放线菌与真菌，尤以曲霉、木霉和青霉较为普遍[5-8].我国是农业大国，秸秆是我国丰富的可再生资源，但是每年大部分的秸秆被焚烧和废弃，尤其是在东北地区，不仅造成资源的浪费，同时也造成严重的环境污染.因此，开发高效利用纤维素类可再生资源的微生物技术，利用工农业废弃物等发酵生产人类急需的燃料、饲料及化工产品，具有极其重要的意义和发展前景.本研究综合利用羧甲基纤维素钠(CMC-Na)水解圈测定法和胞外酶活测定法，针对纤维素降解问题，进行了纤维素降解菌的筛选，并对其产酶条件优化及酶学性质进行了初步研究.1.1 材料1.1.1 样品采集腐烂的枝条与朽木.1.1.2 主要试剂及仪器羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、刚果红、DNS溶液，醋酸钠缓冲溶液，新华滤纸；可见光分光度计、高速低温离心机、超净工作台、恒温培养摇床、超低温冰箱等.1.1.3 培养基牛肉膏蛋白胨培养基(g/L)：牛肉膏5.0，蛋白胨10.0，NaCl 10.0，琼脂20.0，pH 7.2-7.4.羧甲基纤维素钠培养基(g/L)[9-10]：CMC-Na 10.0，KH2PO4 1.5，NaH2P O4·7H2O 2.5，MgSO4·7H2O 0.3，FeSO4·7H2O 0.005，ZnCl2 0.0017，MnSO4 0.001 6，(NH4)2SO4 1.5，pH 7.0.产酶发酵培养基(g/l)[9]：NaCl 5.0 g、K2HPO4 1.0 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、CaCl2 0.3 g，FeSO4·7H2O 5.0 mg，MnSO4 1.6 mg，ZnCl2 1.7 mg，CoCl2 2.0 mg，pH 调至7.2.以上培养基均121 ℃灭菌20 min.1.2 实验方法1.2.1 菌株的筛选用无菌生理盐水浸泡采集腐烂的枝条、朽木样品，在摇床振荡3 h.取样品悬液，用无菌水梯度稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的浓度，吸取稀释浓度为10-3、10-4、10-5的稀释液，涂布于羧甲基纤维素钠培养基上，置于30 ℃培养箱中培养36-60 h.将分离得到的纤维素降解菌点样接种到CMC-Na平板培养基上，30 ℃倒置培养48 h 后，向培养皿中加入适量1.0 mg/mL的刚果红染液，染色30 min，倾去染液，加入适量1.0 mol/L的NaCl溶液，浸泡30 min，依据透明圈与菌体直径比选择高产酶菌株[2].挑取高产菌落进行平皿划线分离，获得一系列单菌落，连续挑选优势单菌落多次划线直至获得各菌株的纯培养，将分离纯化后的菌株斜面接种于牛肉膏蛋白胨培养基上培养2-3 d，观察菌落形态.最后将菌种于斜面上，4 ℃冰箱保存待用.1.2.2 酶活性测定(1)CMC酶活性测定[2, 11]：菌液在4 ℃、8 000 r/min的条件下离心10 min，取0.5 mL上清液(粗酶液)，加入0.5 mL 0.2 %羧甲基纤维素钠(CMC-Na)底物溶液，50 ℃恒温水浴锅中温育1h，然后加入2 mL DNS试剂，再100 ℃沸水浴10 min终止反应，室温冷却后在520 nm下测定光吸收值，酶液沸水浴处理10 min 后作为阴性对照，每个样品做3个平行.(2)滤纸糖化酶(FPase)的测定[12]：菌液在4℃、8 000 r/min的条件下离心10 min，取0.5 mL上清液(粗酶液).将新华滤纸剪成规格为1cm×6cm的长条，放入试管中，取粗酶液1 mL，加入醋酸缓冲液2 mL，50 ℃恒温水浴50 min后取出，加入2mL DNS试剂终止反应，摇匀后于沸水浴中煮沸显色5 min，取出室温冷却后，按DNS法在520 nm下测定光吸收值进行还原糖测定，酶液沸水浴处理10 min后作为阴性对照，每个样品做3个平行.1.2.3 酶活定义酶活力单位定义：每毫升酶液在1 min内催化底物生成1 μg葡萄糖所需要的酶量，即1 U/mL.酶活力计算公式：Y=(A×V×1 000)/(0.5×T)，式中A：从标准曲线查出净葡萄糖的浓度(g/L)；V：总体积；0.5：测定时吸取粗酶液的毫升数；T：反应时间.1.3 培养条件的优化1.3.1 培养时间从6 h开始测量酶活，间隔6 h取样1次，30 ℃、150 r/min 摇床培养60 h，分别测CMC酶活性及滤纸酶活性.1.3.2 碳源及其浓度对产酶活性的影响碳源条件优化，以羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、麦芽糖、乳糖、麦麸、葡萄糖、蔗糖、微晶纤维素(Avicel)和玉米粉作为唯一碳源，30 ℃、150 r/min摇床培养36 h，分别测CMC 酶活性及滤纸酶活性.在碳源确定的基础上，试验分析碳源浓度为5、10、20、30、40、50 和60 g/L的条件下，30 ℃、150 r/min摇床培养36 h，分别测CMC 酶活性及滤纸酶活性.1.3.3 氮源及其浓度对酶活性的影响在碳源及其浓度确定的基础上，试验考察胰蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、NH4Cl、NaNO3、(NH4)2SO4、NH4NO3、KNO3和尿素作为唯一氮源，30 ℃、150r/min摇床培养36 h，分别测CMC酶活性及滤纸酶活性.在氮源源确定的基础上，试验分析氮源浓度为1、3、5、7、9和12 g/L的条件下，30 ℃、150 r/min摇床培养36 h，分别测CMC 酶活性及滤纸酶活性.1.3.4 初始pH对酶活性的影响在碳源及氮源确定的基础上，试验考查初始pH梯度为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5，30 ℃、150 r/min摇床培养36 h，分别测CMC酶活性及滤纸酶活性.1.3.5 培养温度对酶活性的影响在碳源、氮源及初始pH确定的基础上，试验考察培养温度为15、20、25、30、35和40 ℃，150 r/min摇床培养36 h，分别测CMC酶活性及滤纸酶活性.1.3.6 接种量对酶活性的影响在碳源、氮源、初始pH及培养温度确定的基础上，试验考察分别接种不同的菌量(0.1、0.5、1.0、2.0、4.0、5.0 mL)，经发酵36 h后，分别测CMC 酶活性及滤纸酶活性.1.3.7 装液量对酶活性的影响在碳源、氮源、初始pH、培养温度及接种量确定的基础上，试验考察分别接种不同的装液量(25、50、75、100、125 mL)，经发酵36 h 后，分别测CMC酶活性及滤纸酶活性.1.4 酶学性质研究1.4.1 最适温度最适发酵培养条件下得到的粗酶液，将反应体系的温度分别设定为30、35、40、45、50、55、60和70 ℃，测定粗酶液在不同反应温度下的CMC酶活性和滤纸酶活性.1.4.2 最适pH最适发酵培养条件下得到的粗酶液，将反应体系的pH值分别调到5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5，在最适反应温度条件下反应30 min，分别测CMC酶活性和滤纸酶活性.2.1 纤维素降解菌的筛选经过初筛培养获得大量纯培养菌株，在刚果红纤维素培养基上经刚果红染色后，以培养72 h后透明圈直径与菌落直径之比大于2为筛选标准，共有3株菌株有水解圈步筛选得到3株纤维素降解菌，其中菌株CY10透明圈直径与菌落直径最大为5.36，再液体培养测CMC酶活性和滤纸酶活性3.35 U/mL和4.63 U/mL，最终确定酶活性最高的菌株CY10为研究菌株.2.2 发酵条件对纤维素降解菌产酶活性的影响2.2.1 培养时间按照方法1.3.1对产酶时间进行优化.酶活性测定结果如图1所示，该菌培养6 h 即可检测到酶的产生，随着培养时间的延长，发酵液中CMC酶活性和滤纸酶活性逐渐增强.当培养到42 h时，CMC酶和滤纸酶活性达到最高值，分别为2.70U/mL和4.02 U/mL；后随着培养时间的延长，发酵液中CMC酶和滤纸酶活性反而呈下降趋势.因此，CY10菌株最适培养时间为42 h.2.2.2 碳源按照方法1.3.2，分析碳源对产酶的影响，在发酵培养基中分别加入1.0 %不同的碳源，考察碳源对产酶的影响，其结果如图2所示.碳源是维持菌体细胞生长和代谢的重要能源物质[2].当碳源为麦麸时，CMC酶和FPA酶活性均达到了较高的酶活性，分别为4.61 U/mL和6.52 U/mL；当乳糖、葡萄糖、麦芽糖和微晶纤维素作为碳源时，CMC酶活性和滤纸酶活性都较弱，均低于3.0 U/mL.因此，选用麦麸作为该菌培养的最适碳源.为确定碳源不同浓度对酶活性的影响，分析了麦麸浓度不同梯度对产酶活性的影响.结果见图3所示，随着麦麸浓度的增加，该菌的CMC酶活性和滤纸酶活性逐渐升高，当其浓度为20 g/L时，滤纸酶活性和CMC酶活性达到最高值，分别为4.6U/mL和6.2 U/mL当麦麸浓度高于2.0 %时，CMC酶活性和滤纸酶活性均有所降低.因此，选用20 g/L作为该菌培养时的最适碳源浓度.2.2.3 氮源按照方法1.3.3，分析氮源对产酶的影响，在发酵培养基中分别加入0.3 %不同的氮源，考察氮源对产酶的影响，其结果如图4所示.微生物的生长代谢离不开氮源，氮源是组成蛋白质和核酸的主要物质.当氮源为无机氮如(NH4)2SO4、NH4NO3、NH4Cl和NaNO3时，CMC酶活性和滤纸酶活性均较弱，且低于2.0 U/mL；当氮源为有机氮时，该菌发酵液的CMC酶活性和滤纸酶活性相对于无机氮来说均有明显的增高，当酵母粉作为氮源时，CMC酶活性和滤纸酶活性都达到最高，分别为3.23 U/mL和3.86 U/mL.因此，选用酵母粉作为该菌的最适培养氮源.为确定氮源不同浓度对酶活性的影响，分析了酵母粉浓度不同梯度对产酶活性的影响.结果见图5所示，随着酵母粉浓度的增加，该菌的CMC酶活性和滤纸酶活性逐渐升高，当其浓度为5.0 g/L时，滤纸酶活性和CMC酶活性达到最高值，分别为9.65 U/mL和10.52 U/mL；当酵母粉浓度高于0.5 %时，CMC酶活性和滤纸酶活性均有所降低.因此，选用5.0 g/L作为该菌培养的最适氮源浓度.2.2.4 初始pH不同的微生物对pH条件的适应范围与能力都有所不同，为此按照方法1.3.4分析不同初始pH对菌株CY10产酶活性的影响.酶活性测定结果见图6所示，当初始培养pH低于5.5时，不利于酶的生产；当pH在5.5-7.5时，该菌生产的CMC酶活性和滤纸酶活性相对较高，当pH为6.5时，产酶活性达到最高分别为14.56 U/mL和18.23 U/mL；当pH大于6.5时，随着初始pH的升高，该菌生产的酶的CMC酶活性和滤纸酶活性都呈下降趋势；当pH高于8.5对酶活力造成很大影响.因此，选用pH6.5作为该菌初始培养的pH.2.2.5 培养温度按照方法1.3.5分别设计在不同培养温度条件下培养，见图7.结果表明，在15-30 ℃范围内，酶活性随着温度的升高而不断增大，当温度升至30 ℃时，菌株CY10达到最大的产酶能力，CMC酶活性和滤纸酶活性分别达到17.88 U/mL和19.35 U/mL，当温度升高到35 ℃以后酶活开始快速下降，这可能是由于随着温度的上升，酶结空间构受到影响，导致酶活降低.微生物都在一定的温度范围之间生长和繁殖会较快，在最适培养温度下，生长繁殖最快.因此，选择30 ℃作为产酶的最适温度.2.2.6 接种量按照方法1.3.6分别接种不同的菌量，经发酵培养后测其酶活，结果见图8.当接种量在0.2%-1.0%(0.1-0.5 mL/50mL)范围内，随着接种量增加，菌株产酶活性上升较快；在接种量为1.0%-8.0 %范围内，随着接种量增加，酶活性增加缓慢，当接种量为8.0 %时，CMC酶活性和滤纸酶活性最大，分别为20.28 U/mL和21.13 U/mL；当接种量高于8.0 %时，酶活呈下降趋势.因此，选择8.0 %作为产酶的最适接种量.2.2.7 装液量按照方法1.3.7分别在摇瓶内设置不同装液量，发酵培养后，见图9.结果表明，随着装液量增加其酶活逐渐升高，当装液量达到为50 mL/250 mL时，菌株CY10 CMC酶活性和滤纸酶活性达到最大值分别为18.39 U/mL和19.89 U/mL；当装液量高于50 mL时，其产酶活性逐渐降低，装液量增加到一定程度不利于CY10对酶的合成和分泌，其生长和代谢活动不能获得充足的氧气供应，因此酶活性降低.因此，选择50 mL/250 mL作为产酶最适装液量.2.3 酶学性质研究2.3.1 温度按照方法1.4.1，考察温度对酶反应的影响，见图10所示.该菌株CY10在30-45 ℃期间，随着温度的升高酶活性逐渐升高，在45 ℃生产的CMC酶和滤纸酶最适反应达到最大分别为19.56 U/mL和21.35 U/mL；当温度高于45 ℃，随着温度的升高，滤纸酶活性和CMC酶活性都急剧下降；到温度为70 ℃时，CMC酶活性和滤纸酶活性都为都降到最低为5.82 U/mL和6.86 U/mL.因此，CMC酶活性和滤纸酶反应最适温度为45 ℃.2.3.2 最适pH按照方法1.4.2，考察pH对酶反应的影响，见图11所示.随着反应液pH 的升高，该菌滤纸酶和CMC酶的逐渐升高，当pH为6.5时，滤纸酶活性和CMC酶活性最高分别为20.96 U/mL和22.58 U/mL；反应液pH继续升高后，滤纸酶活性和CMC酶活性明显下降.因此，该菌株CMC酶和滤纸酶反应的最适pH为6.5.采用微生物降解纤维素是纤维素再生资源利用的较好方式，本研究从腐朽木材或枝条中分离到1株活性较高纤维素降解菌，并对其培养条件和酶学性质进行了研究.研究结果表明，该菌株最适培养条件为：碳源麦麸(2.0 %)，氮源酵母粉(0.5 %)，培养温度30 ℃，培养pH6.5，培养时间42 h，接种量8.0 %，装液量50mL/250 mL；该菌株CY10所产滤纸酶和CMC酶，酶活性最适温度为45 ℃，最适pH为6.5.【相关文献】[1] Adsul MG,Bastawde KB,Varma AJ,et al.Strain improvement of Penicillium janthinellum NCIM 1171 for increased cellulase production[J].Bioresource Technology,2007,98(7):1467-1473.[2] 郝月,杨翔华,张晶,等.秸秆纤维素分解菌的分离筛选[J].中国农学通报,2005,21(7):58-60.[3] 钟国祥,姚健,张诚,等.纤维素降解菌的筛选及其酶学性质研究[J].江西农业学报,2015,27(6):85-89.[4] 徐昶，龙敏南，乌小兵，等.高产纤维素酶菌株的筛选及产酶条件研究[J].厦门大学学报:自然科学版,2005,44 (1):107-111.[5] 宋颖琦,刘睿倩,杨谦,等.纤维素降解菌的筛选及其降解特性的研究[J].哈尔滨工业大学学报,2002,34(2):197-200.[6] 郭建华,奚家勤,宋纪真,等.纤维素降解菌哈茨木霉TC10-13产酶条件优化[J].南方农业学报,2015,16(1):79-84.[7] 陈兴,王文元,汪显国,等.烟叶纤维素降解菌的筛选、鉴定及其产酶条件优化[J].云南大学学报(自然科学版),2015,37(2):323-328.[8] 刘韫滔,淑霞,龙传南,等.纤维素降解菌L-06的筛选、鉴定及其产酶条件的分析[J].生物工程学报,2008,24(6):1112-1116.[9] Yan-Ling Liang,Zheng Zhang,Min Wu,et al.Isolation,Screening,and Identification of Cellulolytic Bacteria from Natural Reserves in the Subtropical Region of China and Optimization of Cellulase Production by Paenibacillus terrae ME27-1[J].BioMed Research International,2014,2014(6):512497-512497.[10] 沈萍,范秀容,李广武.微生物学试验( 第三版)[M].北京:高等教育出版社,1999:214-215.[11] 邬敏辰,李江华.里氏木霉固体发酵生产纤维素酶的研究[J].江苏食品与发酵,1998(2):2-6.[12] 蒋传葵,金承德,吴仁龙,等.工具酶的活力测定[M].上海:上海科学出版社,1982:79-81.[13] 刘晓梅,邹亚杰,胡清秀,等.菌渣纤维素降解菌的筛选与鉴定[J].农业环境科学学报,2015,34(7):1384-1391.。
纤维素降解菌的分离与鉴定
培养基的配置和分装
纤维素琼脂培养基： • (NH4)2SO4 2 g , • MgSO4· 7g， • H2O 1g, • NaCl 1g, • CaCO3 2g, • 水 500mL ,
• 121 ℃ 灭菌20 min，倒平板后,盖上不平板大小一致的无菌滤纸
（注意：滤纸要用秲醋酸浸泡一夜 ，用碘液检查是否有淀粉 ，若已去除完全 ， 则用 2％苏打水冲洗至中性，干热灭菌 后备用 ）。
环境中纤维素降解菌的筛选和初步鉴定
生物技术班
实验目的 实验原理 实验器材 实验步骤 实验结果与分析
实验目的 • 从环境中筛选出能降解纤维素的菌株 • 初步鉴定出菌株所属的类型
试验原理
• 纤维素酶酶系组成及降解机理 纤维素酶酶系包括内切葡聚糖酶(Cx酶）、外切 葡聚糖酶(Cl酶)，[来自真菌简称CBH，来自细菌简 称Cex)]和B．葡聚糖苷酶l，也称纤维二糖酶，简 称BG)。滤纸酶(FPase)活力代表了三种酶协同作用 后的总酶活力。 纤维素是有许多葡萄糖分子通过β-1，4一糖苷 键连接起来的大分子物质，对其的水解需要上述 三种酶的共同作用。酶的种类完整性、各种酶之 间的比例兲系等都会影响到纤维素酶的整体活力 。
分离
（1）无菌条件下，取富集后的培养液将土壤悬液秲释成101~10-7系列浓度。
（2）分别用秱液器精确地吸取各秲释菌液0.2 ~0.3 mL，对号 先后涂布于编好号刚果红培养基平板,（涂布时涂布棒要从 浓度小的梯度开始，将加入平板培养基上的土壤秲释液在 整个平板表面涂匀，涂完一个平板用酒精灯灭菌）。置于 30 ℃ 培养箱中，倒置培ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ一周。
初筛
以下各步骤均在无菌条件下进行。 （1）称取土壤样品10 g，倒入含有90 mL水和玱璃珠的三角 瓶中振荡5 min，使土样充分打散。（注意：等水冷却了 再倒入土样。） （2）取 5 mL悬液加入盛有 50 mL富集培养基 (纤维素琼脂培 养基 )的三角瓶,在 28 ℃和 150 r/min下, 振荡培养 3~ 5 d后 秱取 5mL培养液至另一盛有新鲜富集培养基的三角瓶中继 续培养。
纤维素降解菌系的筛选及降解稻草条件研究
纤维素降解菌系的筛选及降解稻草条件研究摘要:以已分离的11株纤维素降解菌为材料,采用滤纸崩解法和透明圈法,初步筛选出4株纤维素降解能力较强的菌株｡将这4株单菌进行两两组合,研究混合菌系在9d内的CMC酶活和FPA酶活与单菌发酵之间的异同｡结果表明,混合菌发酵CMC酶活和FPA酶活均优于单一菌株;同时筛选出一组具有高降解能力的混合菌体系;并对该混合菌系降解稻草的最适反应温度､最适初始pH值､产生还原糖的时间进行了研究,结果表明,在30℃､pH值4.5､发酵96 h时混合菌降解稻草的效果最好｡关键词:纤维素降解菌;筛选;CMC酶活;FPA酶活;还原糖含量;降解条件Screening of Cellulose Degrading Microorganism and the Degrading Condition of Rice StrawAbstract: Four strains with strong degradation ability to cellulose materials were screened out of 11 bacteria using filter paper degradation method and clear halo method. Then a mixed germ with higher degradation ability was obtained as the CMC and FPA enzyme activity of mixed bacteria and pure bacterium was compared. The optimum degrading condition of the mixed germ to rice straw was 30℃, pH 4.5, and fermentation for 96 h.Key words: cellulose degrading microorganism; screening; CMC enzyme activity; FPA enzyme activity; degrading condition纤维素是地球上最廉价､最丰富的可再生资源｡全世界每年纤维素及半纤维素的生成量为850亿t｡利用微生物产生的纤维素酶来分解和转化纤维素是纤维素利用的有效途径｡纤维素的生物降解对开辟新能源和防止其污染环境有重要意义,一直是生物技术领域的研究重点[1,2]｡在长期生产实践中发现该生物过程是微生物单独作用不能完成或只能微弱进行的,必须依靠两种或两种以上的微生物共同作用才能完成,微生物混合培养或混合发酵已越来越受重视[3]｡而且国内对产纤维素酶能力较强的单一菌种研究较多,菌种混合发酵的研究较少[4,5]｡本试验在纤维素降解单一菌株研究的基础上,着力于筛选降解纤维素的混合菌系,旨在为纤维素的高效转化提供依据｡1材料与方法1.1菌种纤维素降解菌分别来自枯树根､烂菜叶､牛粪和牛胃中｡1.2培养基制备PDA培养基:马铃薯200 g,蔗糖20 g,琼脂粉20 g,水1 000 mL,pH值6.5｡滤纸条鉴定培养基:(NH4)2SO4 0.10%, KH2PO4 0.10%, MgSO4·7H2O 0.05%,K2HPO4 0.20%,酵母膏0.01%,滤纸条(规格为1 cm×7 cm)1块,pH值6.5｡纤维素刚果红培养基:(NH4)2SO4 0.20%,MgSO4·7H2O 0.05%,KH2PO4 0.10%,NaCl 0.05%,CMC-Na 2.00%,刚果红0.02%,琼脂2.00%,pH值6.5｡液体发酵培养基:KH2PO4 1.00 g, NaCl 0.10 g, MgSO4·7H2O 0.30 g, NaNO3 2.50 g, FeCl3 0.01 g,CaCl2 0.10 g,秸秆木质纤维素20.00 g,pH值7.20~7.40｡1.3菌种初筛透明圈直径(H)与菌落直径(D)比值的测定:将11株保藏菌种(菌种名称分别为N1､N2､N3､N4､N5､N6､N7､N8､N9､N10､N11)活化后分别接种到PDA培养基上,30℃培养3d｡将每一株菌分别转接到纤维素刚果红培养基上,30℃培养4 d后,加入适量1 mol/L的NaCl溶液,浸泡1 h,根据H与D比值的大小进行初筛｡单菌株滤纸失重率的测定:将透明圈大的菌种接种于滤纸条鉴定培养液中,以不接种处理作对照,28℃摇床培养8 d,分别在2､4､6､8 d时测其失重率｡滤纸失重率的测定:用滤纸过滤发酵液,将残留物80℃烘干称重,用减重法计算出滤纸失重率｡失重率=(培养前底物干重-培养后底物干重)×100%/培养前底物干重｡将单菌株滤纸失重率较大且H/D值大于2.0的菌株作为复筛菌种｡1.4复筛将初筛所得单菌种进行两两组合,对单菌种和不同组合菌种测定羧甲基纤维素酶活和滤纸酶活｡以体积比为1∶1的接种比例､10%的接种量分别接入固态培养基中｡1.4.1羧甲基纤维素酶活测定①酶液的制备:将发酵液于4 000 r/min,4℃,离心20 min,取上清液,备用｡②纤维素酶活力的测定方法(DNS法):取A､B､C共3支50 mL 比色管,在A､B管中分别加入1.5､0.5 mL的1% CMC-Na溶液(用pH值4.8的醋酸-醋酸钠缓冲液配制)适当稀释的酶液, C管中加入1.5 mL的pH值为4.8的醋酸-醋酸钠缓冲液和0.5 mL酶液,50℃下保温30 min,然后在3支比色管中分别加入2.5 mL的DNS试剂,沸水浴5 min后放入水中冷却,终止反应,定容至25 mL,摇匀,在波长520 nm处测定吸光值(C管作空白对照),并从葡萄糖标准曲线上查出相应的葡萄糖含量,再折算成酶活力单位｡CMC酶活力定义为:在pH值4.8,50℃条件下,1 mL酶液每分钟水解羧甲基纤维素钠生成1 μg葡萄糖的酶量,称为一个酶活力单位,以U/mL表示｡1.4.2滤纸酶活(FPA)测定取A､B､C共3支具塞比色管,在A､B管中加入pH值4.8醋酸-醋酸钠缓冲液1.5 mL和1 cm×6 cm规格的新华滤纸条(约50 mg),50℃下预热10 min后,加入0.5 mL适当稀释的酶液,C管不加底物作空白对照,50℃下保温60 min,然后在3支比色管中分别加入2.5 mL DNS试剂,沸水浴5 min后立即在水中冷却,终止反应,定容至25 mL,摇匀,在波长520 nm处测定吸光值(C管作空白对照),根据葡萄糖标准曲线计算酶活力｡酶活力定义为:在pH值4.8,50℃条件下, 1 mL酶液每分钟水解滤纸条生成1μg葡萄糖的酶量,称为一个酶活力单位,以U/mL 表示｡1.5菌种降解稻草条件研究还原糖含量测定按照DNS比色法[6]进行｡2结果与分析2.1初筛结果由经过活化的11株菌株在刚果红培养基上的生长情况(表1)可知,菌株N1､N2､N3､N7､N8和N9的滤纸失重率相对较高;从透明圈与菌落圈直径之比来看,菌株N1､N3､N7､N8的H/D都超过2.0｡因此,选取N1､N3､N7､N8号菌株作为复筛对象｡2.2复筛结果发酵过程中菌系CMC酶活的变化情况见表2｡由表2可知,接种后1~2 d内酶活逐渐上升,大部分菌株在3~4 d时酶活出现最高峰值,5~6 d酶活开始下降,7~9 d酶活又缓慢上升｡两种菌株混合培养在一定程度上会提高CMC酶活,组合菌株N7+N8培养4 d时的CMC酶活为195.7U/mL,相当于其菌株单独培养平均酶活的2.36倍｡表3表示的是滤纸酶活在发酵过程中的变化情况,总体的变化趋势是在1~4 d 内先上升,5~7 d上升到峰值,之后再下降｡两种菌混合培养时FPA酶活也有一定程度的提高,组合菌株N7+N8在发酵6d时的FPA酶活为30.5 U/mL,相当于其菌株单独培养平均酶活的1.7倍｡因此,选取组合N7+N8作为最优纤维素降解混合菌系｡2.3组合菌株N7+N8降解稻草的最适温度分别研究了温度在20､30､40､50､60℃时混合菌降解稻草后的CMC酶活､FPA 酶活､产还原糖量(表4)｡由表4可知,CMC酶活､FPA酶活､还原糖含量三者之间存在较明显的正相关性,三者均在温度为30℃时达到最大值｡因此选择30℃作为混合菌降解稻草的最适温度｡2.4组合菌株N7+N8降解稻草的最适pH值分别研究了初始pH值为4.0､4.5､5.0､5.5和6.0时混合菌降解稻草后的CMC酶活､FPA酶活､还原糖量｡由表5可知,初始pH值为4.5时,CMC酶活､FPA酶活､还原糖含量三者均达到最大值｡因此选择4.5为混合菌降解稻草的最适初始pH值｡2.5组合菌株N7+N8降解稻草的最适培养时间在混合菌降解稻草的最优发酵条件下,每隔12 h测定1次其生长状况及产糖情况,研究培养时间对混合菌生长及产还原糖的影响,结果见图1｡由图1可知,混合菌系在培养72 h之前,还原糖产量较低,在培养72~96 h过程中,混合菌系迅速产生还原糖,在96 h时还原糖产生量最高,达1.8 g/L｡3讨论本研究筛选出了一组具有较高纤维素降解活力的混合菌系,该混合菌系的CMC 酶活和滤纸酶活均高于单一菌株;同时研究了该混合菌系降解稻草的最适反应温度､最适初始pH值及培养时间对还原糖量的影响｡本研究虽对上述试验条件进行了探讨,但以下问题有待进一步研究:①所得混合菌系纤维素降解酶活力距离生产要求还有很大的差距,应采用诱变等方法对该菌系进行处理,以提高现有菌系的产酶活力;②在利用单因素法研究温度､pH值､培养时间对产酶的影响的基础上,需进一步研究多因素对发酵产酶的影响,以使理论研究更加贴近实际生产｡参考文献:[1] MANDELS M, STERNBERG D. Recent advances in cellulose technology[J]. J Ferment Technol,1976,54(4):267-286.[2] HARUTA S,CUI Z,HUANG Z,et al. Construction of a stable microbial community with high cellulose-degra-dation ability[J]. Applied Microbiology Biotechnology,2002,59(4-5):529-534.[3] 冯树,周樱桥,张忠泽. 微生物混合培养及其应用[J] .微生物学通报,2001,28(3):92-95.[4] 史玉英,沈其荣,娄无忌,等. 纤维素分解菌的分离和筛选[J]. 南京农业大学学报,1996,19(3):59-62.[5] 洪洞,黄秀莉. 纤维素酶的应用[J].生物学通报,1997,32(12):18-19.[6] 王玉万,徐文玉. 木质纤维素固体基质发酵物中半纤维素､纤维素和木质素的定量分析程序[J].微生物学通报,1987,14(2):81-84.。
纤维素降解菌滤纸条实验结果与讨论
纤维素降解菌滤纸条实验结果与讨论
纤维素降解菌滤纸条实验的结果可能是指菌落的生长和滤纸条的损耗情况。
根据实验结果，可能有以下几种情况：
1. 生长正常：如果纤维素降解菌在滤纸条上生长良好并降解纤维素，滤纸条会被菌落附近的区域逐渐降解掉。
这表明纤维素降解菌能够有效地将纤维素分解为可利用的物质。
2. 生长不良：如果纤维素降解菌的生长受到限制，可能导致滤纸条上没有或者只有少量的菌落生长。
在这种情况下，滤纸条上的纤维素降解程度可能较低。
3. 滤纸条完全未被降解：如果纤维素降解菌无法降解纤维素或者菌落没有在滤纸条上生长，滤纸条可能完全不被降解。
这可能表示纤维素降解菌对纤维素不具有降解能力，或者实验条件不适合菌落生长及纤维素降解。
对于实验结果的讨论，可以考虑以下几个方面：
1. 与控制组的比较：将实验组的结果与没有加入纤维素降解菌的对照组进行比较。
如果实验组的滤纸条有明显的降解或菌落生长，而对照组没有，可以推断纤维素降解菌在滤纸条降解中起到了重要作用。
2. 影响菌生长和纤维素降解的因素：分析实验过程中可能影响纤维素降解菌生长和滤纸条降解的条件因素，例如温度、pH 值、营养成分等。
可以探讨某些条件对菌落生长和纤维素降解
的影响程度。
3. 结果的可再现性：如果实验结果得到了重复验证，说明该实验结果具有可再现性，对于研究纤维素降解菌的特性和应用具有重要参考价值。
4. 实验结果的意义：讨论实验结果对于纤维素降解领域的研究具有什么意义，以及对于解决环境问题、生物能源开发等方面的应用价值。
需要注意的是，纤维素降解菌滤纸条实验的结果和讨论需要根据具体实验设计和结果来展开，上述内容仅为一般参考。
纤维素降解细菌的筛选及其培养基的优化
纤维素降解细菌的筛选及其培养基的优化自然界中能够降解和利用纤维素的微生物种类繁多，真菌、细菌、放线菌以及部分酵母菌等很多主要的微生物类群中都有，但长久以来人们一直以产酸性胞外纤维索酶的木霉、曲霉等真菌作为主要的研究对象。
近年来，随着纤维素酶在洗涤剂、棉织品水洗抛光整理和制浆造纸等行业上的应用和发展，使得由细菌产生的中性以及碱性纤维素酶得到广泛重视，尤其是细菌产生的胞外纤维素酶拥有简化发酵工艺，节约资源的优势，正逐步显示出它良好的使用性能和巨大的工业价值。
1 材料与方法1．1 材料1．1．1 土壤样品采集造纸厂排水处附近中性偏碱性土壤。
1．1．2 培养基(1)筛选培养基A：蛋白胨10 g，羧甲基纤维素钠10 g，NaC1 5 g，磷酸二氢钾1 g，琼脂18 g，水1 000 ml，pH值调至8。
筛选培养基B：磷酸二氢钾2 g，硫酸铵 1．4 g，硫酸镁 0．3 g，氯化钙 0．3 g，CMC 20 g，琼脂18 g，水1 000 ml，pH值调至8。
(2)斜面培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaC1 5 g，琼脂15～20 g，水1 000 ml，pH值7。
(3)种子培养基：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaC1 10 g，水1 000 ml，pH值7。
(4)基础培养基：羧甲基纤维素钠10 g，蛋白胨10 g，磷酸二氢钾1 g，硫酸镁 0．2 g，NaC1 10 g水1 000 ml，pH值7。
1．2 方法1．2．1 刚果红染色鉴定法1．2．2 粗酶液制备方法将发酵液于4 500 r／rain离心15 rain，取其上清液收集保存。
1．2．3 酶活测定方法0．5 的粗酶液加入1．5 用柠檬酸缓冲液配制的0．51％的CMC．Na溶液，50℃作用15 min，加入DNS 1．5 沸水浴5 rain，540 nm测光吸收，酶活力定义为每1 h 产生1 g还原糖所需的酶量为一个纤维素酶活力单位用1 U／ml表示。
纤维素降解细菌的筛选及酶活测定
纤维素降解细菌的筛选及酶活测定1 材料与方法1．1 含菌样品含菌样品取自校园里的腐烂树叶处的土壤。
1．2 培养基(1)CMC(羧甲基纤维素)培养基：CMC-Na15 g， NH4NO3 1 g，MgSO4 ·7H20 0．5 g，KH2PO4 0.5 g，琼脂2％，H201 000 mL，pH 自然，121 ℃灭菌。
(2)刚果红鉴定培养基：KH2PO4 0.2％，MgSO4 0．05％，(NH )2SO40．1％，琼脂2％，刚果红0．02％，CMC—Na 2％，NaC1 0．05％，pH自然。
(3)液体产酶培养基：CMC—Na 15 g，NH4 NO31 g，KH2PO4 1 g，MgSO4 0．5 g，H20 1000 mL,初始pH值霉菌调为5，细菌调为8 1.3 菌株的筛选初筛采用滤纸条崩解实验及刚果红平板识别，复筛采用液态产酶鉴定。
1.4 CMC酶活力的测定1.4.1 DNS法绘制标准曲线采用3，5一二硝基水杨酸比色定糖法(DNS) 测定酶解液中还原糖含量。
取9支比色管，分别按表顺序加入各种试剂，将各管溶液混匀，用空白管溶液调零，测520 nm处的光密度值，绘制标准曲线1.4.2 测酶活将菌株接种于发酵培养基，30℃，l80 rpm培养4 d，从培养基中取l ml菌液放人试管，加水稀释至5 ml，4000 rpm离心5 min。
移取上清液 0．5 ml于试管中，加入含 0．5％ CMC—Na的柠檬酸缓冲液(0．05 mol／L，pH 4．4)1．5 ml，50℃水浴锅准确作用30 min，在每试管内加 1.5 ml DNS试剂，沸水浴 5 min，立即冷却，520 nm处测定其OD值，对比标准曲线，求葡萄糖含量。
酶活力计算公式：酶活力=葡萄糖量×10(10一稀释倍数)酶活力单位(u)=(1 mg葡萄糖／m1)·30 min。
2.流程分析(1)纤维素降解菌的筛选：将含菌样品富集培养后，取菌液0．1 mL 涂布于羧甲基纤维素平板中，待其长出菌落后，进行平皿划线法分离，分离到一系列纤维素降解菌。