生物技术课件-02基因工程常用工具酶

性内切酶及对其功能研究的突出贡献获得诺贝尔奖金 限制性核酸内切酶（限制酶）：在细胞内能够识别双
链DNA分子中的特定核苷酸序列，并对DNA分子进 行切割的一种酶。 功能：降解不同源DNA，而不降解同源DNA。
根据限制性核酸内切酶的限制修饰活性、 相对分子量大小、酶蛋白结构、切割位点 及限制作用所需的辅助因子等，将限制性 核酸内切酶分为三类：I型酶，II型酶，III型 酶。
（DDT：二硫苏糖醇 BSA：牛血清蛋白）
在DNA分子双链的特异性识别序列部位， 切割DNA分子，产生链的断裂。
2个单链断裂部位在DNA分子上的分布， 通常不是彼此直接相对。断裂结果形成的 DNA片段，具有互补的单链延伸末端。
绝大多数的Ⅱ型限制性核酸内切酶都能够 识别由4-8个核苷酸组成的特定的核苷酸序 列。限制性核酸内切酶就是从其识别序列 内切割DNA分子的，因此这些识别序列又叫 核酸内切酶的切割位点或靶序列。
5’-GG CC-3’源自5’-GG- -CC-3’-CC GG-5’
33’’-CC- -GG-5’
5’粘性末端（如EcoR Ⅰ）
5’-GAATTC-3’
5’-G- -AATTC-
3’-CTTAAG-
33’’-CTTAA- -
5’
G-5’
3’粘性末端（如Pst Ⅰ）
同裂酶：来源不同的限制酶识别相同的核 苷酸靶序列。产生同样的切割，形成同样 的末端。 如：HpaⅡ和MspⅠ均可切割C CGG。
同尾酶：来源不同，识别的核苷酸靶序列 也不相同，但切割后DNA分子产生的粘性 末端相同的限制性核酸内切酶。
5’-GGATCC3’
3’-CCTAGG5’ BamHⅠ
5’-TGATCA3’
3’-ACTAGT5’ BclⅠ
5’-AGATCT3’
3’-TCTAGA5’ BglⅡ
BamHⅠ BclⅠ BglⅡ三种酶 可产生相同的5’GATC粘性 末端，由这种同尾酶产生的 DNA片段可因粘性末端的互 补而彼此再连接起来。
识别序列有连续的（如GATC）和间断的(如 GANTC)两种，它们都呈回文结构。
A B C C’ B’
A’
或
A’ B’ C’ C BA
A B N B’ A’
A’ B’ N’ B A
不同核酸内切酶的特异识别位点
5’…… C T G C A G……3’ 3’ ……G A C G T C ...…5’
2.1.1.1 细菌的限制—修饰作用
1952年，Luria和Human，
1953年，Bertani和Weigle
发现细菌的限制（restriction）现象：
感染

E.coli k
Phageλ（k）

（k）』
不感染
E .coli B『E .coli B 限制 λ
噬菌体侵染细菌
限制性核酸内切酶（restriction endonucleases）：简称工具酶，是一类能够识 别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由 此切割DNA双链结构的核酸内切酶。
限制性核酸内切酶主要从原核生物中分离出来。
仅II型限制型核酸内切酶已有2000多种，可以识 别200多个不同的DNA序列。
特性
限制和修 饰活性
识别与切 割位点
Ⅰ型
单一功能
Ⅱ型
单一功能
Ⅲ型
双功能
分别，随机切 割，相距较远
同一位点 相距5-10bp
对基因工 程中意义
无用
非常有用 意义不大
2.1.3 限制性核酸内切酶的命名
Escherichia Coli Ry13
EcoR I
属名 种名 株系 编号 若种名头2个字母相同则其中一个可用种名的第一 和第三个字母。
PstⅠ
5‘…… G A A T T C ……3’ 3’ ……C T T A A G ……5’
EcoR Ⅰ
HindⅢ切割位点
DNA
HindⅢ
AAGCTT TTCGAA
A
B
DNA
C
D
A
AGCT
TT T C G A
A
核酸内切酶HindⅢ对双链DNA分子的切割作用
平齐末端（如SmaⅠ、AluⅠ、HaeⅢ）
R-M系统是细菌安内御外的积极措施。细菌R-M系统 的限制酶可以降解DNA，为避免自身DNA的降解， 细菌可以修饰（甲基化酶）自身DNA，未被修饰的外 来DNA则会被降解。
个别噬菌体在被降解之前已经发生了修饰，则可免予 被降解。
1968 Linn和Arber从E.coli B中发现限制酶Ⅰ 1970 Smith（美）在流感嗜血杆菌发现限制酶Ⅱ 1978 W. Arber，H. O.Smith，Nathans因发现限制
50μL Buffer中，含1μg底物DNA，于最适反应条件 和温度下，保温1小时，能使1μg DNA完全降解所需 的酶蛋白量即为一个酶单位，用U表示。
buffer （pH=8.0） ： 50mmol/L Tris-HCl 10mmol/L MgCl2 1mmol/L DTT或巯基乙醇 100μg BSA/ml
世界大型工具酶生产厂商： （1） Novo Nordisk （诺和诺德公司，丹麦） （2） Gist Broccdes（荷兰） （3） Cultot （科特公司，芬兰） （4） Genencor International （杰能科公司，美国） （5） Solvay （苏尔威公司，比利时） （6） Clr Hansen （汉森公司，丹麦） （7） Rhone Ponlene （罗兰，普朗克公司，法国） （8） Quest （荷兰）
基因工程的重要特点之一是在体外实行DNA分子的切 割和重新连接。因此，工具酶是DNA体外操作必不可 少的工具。
取得编码某种药物的目的基因，大多需要工具酶－限 制性核酸内切酶
将目的基因与载体DNA连接在一起，也需要工具酶－ DNA连接酶。
目前，许多厂商都在生产各种优质工具酶，简化了分 子克隆操作，拓宽了基因工程的研究领域。
仍有少量phage λ (K)可在 E. coli B中生 存，是因为这些phage对自身进行了修饰。
普通的phage λ (K) 1
10-4（限制作用）
大肠杆菌K
大肠杆菌B
1 修饰的phage λ (K)
细菌中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，构 成了寄主控制的限制—修饰系统(R-M Restrictionmodification system)。