论分子生物学技术在中医药研究中的应用PPT

于是一些人对该技术格格不入，学不进去。 以上的认识对不对呢？是否准确地了解中医药学术发 展史，是否了解分子生物学及其技术发展的背景和进展， 是否了解当今医学研究发展的现状？回答大多是否定的。
（1）振兴中医的重要机遇 分子生物学、细胞生物学以其实验条件便于控制、实 验稳定、重复性好、实验周期短、仪器试剂（包括各类试 剂盒）发展快，手段丰富、国际研究普遍（使新方法、新 技术层出不穷）、研究积累快、参考文献丰富，可以观察人 体的不同组织的细胞、分子（这又强于动物实验），给应用 该方法技术研究创造了绝佳的条件。 业已进行的研究揭示和开拓出生命科学广大的未知领 域。 由于分子生物学新兴、发展快，给国内外、中西医创 造了同等的发展和应用的机会，再次使中、西医有可能站 到同一起跑线上。抓住这个千载难逢的机会，充分利用它、 驾御它，必将给中医学研究与发展注入强大的生命。
金元后期，朱丹溪提出阳常有余，阴常不足，治疗主 张滋阴泻火，留有著名的大补阴丸。在明代李时珍《本草 纲目》“黄柏”条下，也记载有长期服用单味黄柏以延缓衰 老的论述。然而，明末的张介宾则极力反对，认为阳气是 人体的大宝，不应该采用寒性药物大肆克伐，而力主温补。 就这样，中医界寒温之争持续了几百年。几百年来，临床 上有人禀承丹溪学说，也有人推衷景岳学说，没有定论。
通过几十年的研究，中药所面临的问题已经暴露得十 分清楚，比如天然中药材的质量稳定性不易控制、占用耕 地；中药有效成分和若干有效成分最佳组合的研究与探索； 中药有效成分产率、得率的提高；以及中药服用安全、方 便，等等，均有赖于大量的中药学和中医基础理论研究与 发展。而已有的研究表明，在所有研究手段中，分子生物 学方法与技术是十分重要、有效的手段。
为了进一步了解二仙汤的作用机制，我们采用了分子 生物学实验技术观察了二仙汤对老年大鼠下丘脑、垂体 GnRH 含量的变化。研究发现，24 月龄老年大鼠下丘脑 GnRH mRNA 含量（Northern blot）较 5 月龄青年大鼠下降、垂体 GnRH（下丘脑合成的 GnRH 通过垂体门脉系统直接释放到垂 体）含量也下降；而经过二仙汤的治疗，同龄老年大鼠下 丘脑 GnRH mRNA 含量、垂体 GnRH 含量较老年对照大鼠增加， 表明二仙汤治疗更年期综合征取效的部分机制与该处方延 缓下丘脑 GnRH 神经元的衰老，并增进其功能有关。
分化成熟，标志之一是该启动子被一些不明的核蛋白所活
跃，GnRH 基因出现表达。
GnRH 基因
启动子
GnRH 基因序列
增强子 增强子
鉴此，研究人员推测两个细胞系 中调节 GnRH 基因启动子的核蛋白构 成会有所不同，由于这些核蛋白的构 成不同，导致两个细胞系 GnRH 表达 的多寡。我们采用分子生物学足迹法 （Footprint）技术发现，来源于 GT1-7 和 Gn10 两个细胞系的核蛋白在 GnRH 启动子，尤其是其增强子上结合的数 量以及所结合的 DNA 序列确实有所异 同，可以推测，这些不同的结合蛋白 可能是调节 GnRH 表达数量多寡的重 要蛋白，由此也提示两个细胞系中基 因的表达有所差异。
中药的研究有赖于中医基础理论的研究。假如不加强 分子生物学技术对中医基础理论的研究，没有强大的基础 研究的积累和支撑，药物的研究、开发将成为无本之木。
（3）继承和发展中医基础理论的需要 中医药的作用发挥，脏腑病机的变化、不同治法（具 体落实到中药复方及其有效成分，针灸、推拿等治疗方法） 的作用环节和最终作用的发挥，均落实到人体基因转录与 表达的调控。 已有的研究表明，中医药的取效，往往是通过对基因 的转录与表达调控实现的。甚至，一些基因缺失或突变所 引起的疾病，中医药通过对其它有关基因的转录调控，进 行补偿，可以达到治疗疾病的目的。 因此，深入研究对于阐明中医药的作用机制、阐明生 命的调控原理，均具有重要的科学意义。作为对中医学优 秀遗产的继承和发展，这部分的研究具有广阔的天地，是 中医基础理论研究的重头。
另一方面，还应该看到，证的临床研究局限性与困难 日益明显。主要表现在限于种种困难，证治的动态演变观 察研究难以深入；临床证治的干扰因素多且复杂，严重影 响到证治疗效的观察、评估；由于受到实验室检查经费昂 贵、病员顾虑，医从性差等因素的限制，临床病人证治的 实验室检查、复查均十分困难，观察难以完整，广种薄收； 由于创伤性检查在在我国目前临床上难以展开，因此细胞 水平、分子水平，尤其是细胞、分子的调控研究无法进行， 致使研究深入不下去。而采用分子生物学、细胞生物学技 术能在很大程度上弥补其不足。
1970 年，Baltimore 和 Temin 发现了逆转录酶 ——长期的基础研究积累迎来了突飞猛进的高潮。
1973 年，Cohen 把质粒作为基因工程的载体使用 ——基础研究向应用研究的拓展。 （以上被称为生物工程技术的的三大发明）
有人统计，自 1957-1982 的 25 年间，从事核酸研究而 获得诺贝尔奖的有 29 位！
（2）保持中医药优势的需要 几千年来，中医在运用天然药物方面积累了丰富的经 验。其中一些天然动植物药物的粗制品，比如水蛭素、蛇 毒抗栓酶类制剂已经成为我国传统医药产业的一些产品。 但是当国外采用了分子生物学技术和生物工程，生产出水 蛭素、类凝血酶素，既降低了成本，又提高了质量的稳定 性。反销我国和国际市场，对我国传统医药产业形成了巨 大冲击与竞争。有识之士开始呼吁不能坐视祖国医学优秀 遗产的优势失去，主张抓紧采用先进、高效的技术，包括 分子生物学研究天然中药的有效成分，开发新药，不然势 将失去优势。
医学和生命学科的研究探索是没有止境的。依据以上
研究结果，我们自然会关心：GnRH 基因是如何表达的？近
十年来所采用的分子生物学技术研究表明，GnRH 基因有
3000bp 左右的启动子，在这些启动子上一些区域在特定的
细胞系中对于 GnRH 基因的高表达十分重要，被称之为增强
子。GnRH 细胞在胚胎初始由鼻小坑向下丘脑迁徙，并逐步
我们采用另一项 1992 年发展起来的 DDPCR 技术研究证 实，GT1-7 和 Gn10 两个细胞系中确实有许多基因表达不同， 有的仅仅在其中一个细胞系中表达，而另一细胞系阙如； 大多基因在两个细胞系中表达的数量明显不同。在这些差 异表达的基因中，有一个基因产物称之为 Ark，仅仅在 Gn10 中表达。之前的研究表明 Ark 是一个跨膜蛋白，但是采用 报道基因技术研究发现，一旦使 Ark 基因在 GT1-7 细胞中 表达增加，便会明显地抑制 GnRH 基因的表达。该现象不但 观察到了 Ark 的新功能，同时也提示同一基因产物在细胞 中可能存在的多种功能。
3．分子生物学的发展历程 1871 年，首次发现 DNA（鲑精 DNA）。
1943 年，证明 DNA 为遗传分子，而不是蛋白（1944，O T Avery）——敏锐的洞察力、对新现象的捕捉能力。
1953 年，DNA 双螺旋模型提出（J D Watson（美）和 F H C Crick（英），1962 年或诺贝尔生理学、医学奖）。从而 为分子生物学这一学科奠基
上海第二医科大学进而采用细胞生物学的研究方法， 发现与若干常用经典温肾中药复方相比，二仙汤能使 GnRH 细胞系 GT1-7 的 GnRH 分泌峰提前，并维持时间最长。
这些研究采用了细胞生物学和分子生物学技术加深了 我们对中药复方作用机制的认识。如果不借助分子生物学、 细胞生物学的技术和方法，我们便难以高效、准确、深入 地观察到中药复方作用的分子机制，也就无从开展更进一 步的深入研究，并在此基础上发展和丰富中医药学。
3 个事例：
（1）1976 年，重组 DNA 成功（H Boyer（美）和 S N Colen （美？），1981 年获诺贝尔化学奖）——勇敢的科学精神。
（2）1982 年，美国一制药公司在 2000 升发酵液中提 取出 100 克精制胰岛素！相当于从 1600 磅动物胰腺中的提 取量——效率、成本、质量、竞争。
那么以上的作用是对细胞产生的直接作用，还是间接 的？
研究发现来源于不同部位的 GnRH 细胞系，对 GnRH 的 表达数量有着很大的区别，比如 GT1-7（来源于发生在前脑 的肿瘤，接近 GnRH 细胞迁徙的终点）可以高表达 GnRH，而 Gn10（来源于 GnRH 细胞迁徙途中的肿瘤）GnRH 表达甚微— —这些细胞系成为理想的研究工具。
分子生物学技术在中医药 研究中的应用
上海中医药大学
方肇勤
（2006/4/5）
绪论
一．中医药实验研究为什么要采用分子生物学 技术
1．一些不同的认识 （1）中医是宏观的，讲整体的，讲辨证的，讲阴阳平 衡的。微观的分子生物学是没有办法来研究中医的，不能 研究中医的。 （2）担心采用现代技术研究中医，中医会被西医吃掉； （3）中医的灵魂在临床，不在实验。
——敏锐的洞察力、多学科知识的综合运用。 1961 年 ， 合 成 mRNA ， 破 译 第 一 个 遗 传 密 码 （ M W Nirenberg（美），1968 年获诺贝尔生理学、医学奖） ——基础研究的创新，与推动人类文明的进步。
（以上被称为理论上的三大发现）
1970 年，分离出第一个限制性内切酶（W Arber（瑞士）， 1978 年获诺贝尔医学奖）
（3）荷兰最早把分子生物学产品“猪牛痢疾疫苗”投 放市场，比以上美国的胰岛素早半年——后来居上。
二．分子生物学技术在中医药研究中的实例
但是，如何运用分子生物学方法技术来研究中医，如 何把两者紧密结合起来，这些技术对中医学术发展有什么 帮助，如何找到最佳的切入点，等等。诸如此类的问题、 困惑还萦绕在许多中医工作者和学生的脑海中。
现代临床实验研究方法引入中医临床观察后，发现同 样是老年人，激素水平、神经递质水平存在显著差别，这 些递质、激素在部分人群当中可以长期维持在一个较高的 水平，而部分人群随着衰老则明显下降。其中，这些年大 量实验研究所观察到的与寒证、热证有明显关系的儿茶酚 胺类递质在老年人中波动就很大。
我们采用动物实验研究中药二仙汤（仙茅、淫羊藿、 巴戟天、当归、知母、黄柏）及其寒温两个拆方的作用机 理时发现，温肾药（仙茅、淫羊藿、巴戟天、当归）对老 年和去势大鼠下丘脑-垂体-性腺（去势动物观察肾上腺） 轴兴奋作用突出，而滋阴泻火药（知母、黄柏）对这些轴 的延缓衰老和保护作用突出，部分揭示出寒、温治法的差 别。联系到临床研究结果，显然，对那些激素、神经递质 水平高、热象明显的老年人，补肾以偏重于滋阴泻火为妥； 而对于那些激素、神经递质水平低、寒象明显的老年人， 补肾以偏重于温肾壮阳为妥。以上中医基础理论研究丰富 了中医学延缓衰老的理论和方法，对临床上延缓衰老的辨 证论治起到了积极的指导作用。