排卵障碍相关疾病发生机制探究

项目名称：排卵障碍相关疾病发生机制研究首席科学家：陈子江山东大学起止年限：2012.1至2016.8依托部门：教育部山东省科技厅一、关键科学问题及研究内容(一)解决的关键科学问题本项目拟通过基础与临床的紧密结合，探讨卵泡发育及排卵障碍的发生机制，阐明神经内分泌、卵巢局部因子以及遗传等因素在排卵障碍性疾病发生发展中的作用及相互关系；建立常见排卵障碍性疾病的资源库，为发展新型的疾病干预措施提供理论依据。

拟解决的科学问题为：1）排卵障碍的神经内分泌调控机制是什么？2）卵巢局部因子在卵泡及排卵障碍中的作用机制是什么？3）人多囊卵巢综合征和原发性卵巢功能不全等排卵障碍疾病发生的遗传机制是什么？(二)主要研究内容围绕拟解决的关键科学问题，利用多囊卵巢综合征和原发性卵巢功能不全大鼠或小鼠动物模型，研究多囊卵巢综合征和原发性卵巢功能不全形成过程中内分泌激素、神经递质、卵巢钠肽系统以及胰岛素及相关因子在排卵障碍中的作用机制。

筛选钠肽系统和神经递质受体类药物靶点。

利用体外培养模型和基因敲除小鼠模型，阐明卵泡发育过程中特异表达基因在卵泡发育和卵子排放过程中的作用机理，以及这些基因与临床排卵障碍疾病的相关性。

建立常见排卵障碍性疾病资源库，建立完善标本库管理模式及共享体系；全面筛查多囊卵巢综合征基因、RNA及蛋白变异，探讨相关基因的分子作用机制；构建PCOS风险预测模型。

探索POI与卵泡发育相关基因（包括课题1、2中涉及的候选基因）的关系; 利用高通量基因组技术-GWAS和第二代测序等技术对POI进行易感基因定位和功能研究; 建立POI风险预测模型。

二、预期目标总体目标阐明排卵障碍的发生机制，深入了解相关神经内分泌因子和卵巢局部因子在卵泡发育和排卵过程中的作用；建立常见排卵障碍性疾病资源库，为研究排卵障碍的发生机制奠定基础；实现排卵障碍性疾病发病机制的理论创新；建立风险预测模型，探寻药物作用靶点，为排卵障碍疾病的早期预警和干预措施的建立提供重要科学依据。

五年预期目标1.建立常见排卵障碍性疾病资源库，完善资源库管理模式及共享体系。

2.利用相关疾病动物模型，阐明排卵障碍形成过程中相关神经递质、卵巢钠肽系统以及胰岛素相关因子的作用及机制。

3.建立基因敲除小鼠模型和卵巢体外培养模型，阐明卵巢局部因子Wt1、Notch信号通路和水通道蛋白在排卵障碍中的作用。

4.筛选出10-15个人类排卵障碍相关基因，制备相关动物模型，阐明2-3个关键基因在排卵障碍中的作用及分子机制。

5.建立多囊卵巢综合征和原发性卵巢功能不全的疾病风险预测模型，根据动物模型筛选药物靶点，为发展新型的疾病干预措施提供理论依据。

6.在本领域主流杂志发表论文50篇以上，争取发表10分以上文章4篇以上，申请国家专利10项左右，国际专利2项以上。

7.在排卵障碍研究领域造就一支高水平的科研队伍，培养博士约50-60名，硕士研究生50-80名，博士后研究人员约20名，杰青2名，在国内创建一流的网络式合作研究平台。

三、研究方案(一) 学术思路 功能验证相关基因筛查疾病资源库动物模型候选基因神经内分泌遗传因素卵巢局部因子PCOS POI PCOS本项目以建立疾病资源库为前提，借助高通量基因组学和蛋白质组学技术筛选疾病相关基因，利用疾病小鼠模型进行蛋白功能和机理研究，阐明神经内分泌、卵巢局部因子以及遗传和环境因素在PCOS 、POI 发生发展中的作用，为排卵障碍疾病的早期预警和干预措施的建立提供重要科学依据。

(二) 技术途径基于我们前期工作基础，集成各种新技术和新模型，将基础研究与临床研究紧密结合，开展基因功能与发病机制研究。

一方面以神经内分泌和卵巢局部信号通路为切入点，利用动物模型和体外培养体系，探讨神经递质、内分泌因子、钠肽系统、胰岛素及相关因子、雄激素、Notch 、Wt1、水通道蛋白等对卵泡发育和排卵的调控机制。

另一方面结合临床排卵异常疾病，借助生物芯片、深度测序、荧光原位杂交、比较基因组杂交芯片等高通量基因组技术，阐明PCOS、POI的致病机理。

各课题组在已有的工作基础上，发挥各自的技术特点和优势，集中目标，重点突破。

在基因水平、蛋白质水平、细胞与组织水平和整体水平上，综合应用生物信息学、分子生物学、生殖生物学以及系统生物学等多学科交叉手段，各课题间既有侧重点又有交叉，系统深入地研究排卵障碍的分子机理。

(三)可行性分析1.研究队伍本项目汇集了6家科研单位和医院的学术带头人，主要参加单位包括山东大学、中国科学院动物研究所、中国农业大学、吉林大学、安徽医科大学、南京医科大学。

团队包括中科院院士1名、国家杰出青年基金获得者2名、中科院百人计划获得者2名、长江学者特聘教授2名、国家百千万人才2名、教育部百篇优秀博士论文获得者1名等，具备取得重大创新的科学积累和人才基础。

参加人员长期从事生殖生物学和生殖疾病相关研究，积累了丰富的基础研究和临床实践经验，具有较强的独立研究能力；结构合理的优秀科研团队确保研究方案的顺利实施；优秀的中青年学术骨干，具备良好的大型科研课题实施的工作能力，掌握实验涉及的所有先进技术，保证了项目的实施和技术问题的解决。

2.研究基础1)技术力量和研究平台：主要组成人员具有长期从事生殖调控和排卵障碍疾病机理研究的背景，建立了较为系统的卵泡发育、成熟、排卵和闭锁等方面的研究平台，包括卵泡体外培养系统、疾病动物模型、基因敲除小鼠模型等；已经收集近万例临床PCOS患者和近千例POI患者标本，具备较成熟的基因组学、蛋白质组学、生物信息学技术平台，为易感基因筛查和发病机制研究提供了前期基础。

2)工作基础：项目组前期关于排卵调控和排卵障碍机理等多项研究成果在国际知名杂志Science、Nat Genet、J Clin Invest、Am J Hum Genet、Dev Cell、Proc Natl Acad Sci U S A、Mol Endorinol、Endorinology、Hum Reprod、J Cell Physiol、Mol Cell Endocrinol、Fertil Steril等刊物上发表，产生了重要的国际影响。

本项目是对这些原创性研究的进一步深入和转化，保证了项目预期目标和研究方案的可行性。

3.实验平台项目组包括中国科研院动物研究所生殖生物学国家重点实验室、生物膜与膜生物工程国家重点实验室，山东大学国家辅助生殖与优生工程技术研究中心、实验畸形学教育部重点实验室和生殖内分泌教育部重点实验室，中国农业大学农业生物技术国家重点实验室和南京医科大学生殖医学国家重点实验室，实验室装备先进，技术力量雄厚，保证了实验需要的所有技术平台，具备项目实施需要的技术和设备力量(四)创新点与特色1.从学术思路来看：通过基础研究和临床研究的互动，转化或反转化，沿着从临床疾病到分子机理，再回到临床实践的多个层次开展系统研究。

以建立排卵障碍性疾病资源库为前提，以研究卵泡发育及排卵的调控机制为基础，以阐明排卵障碍性疾病的发生机制为核心，为发展新型的疾病干预措施提供理论依据，达到基础理论和疾病防治的重要创新。

2.从研究内容和技术手段来看：本项目创新性的综合运用高通量的全基因组和蛋白质组学技术平台，进行排卵障碍相关基因的筛查和功能研究；从神经内分泌和卵巢微环境等关键环节入手，制备疾病小鼠模型，阐明卵泡发育和排卵的分子机制，寻找合适的信号调控通路和药物作用靶点，为排卵障碍疾病的早期预警和干预措施的建立提供重要科学依据。

3.从临床意义看：排卵障碍的病因学探讨是目前生殖领域关注的焦点，本项目首次对大样本中国汉族PCOS、POI进行GWAS分析和外显子测序，完成致病基因的精细定位和功能研究，建立风险预测模型，实现早期预警，使遗传信息与临床表型成功对接，使生物信息的临床价值最大化。

预期结果为新型预防措施制定、诊断和治疗技术的建立提供依据，对提高女性身心健康水平及和谐社会建设具有重要意义。

（五）课题设置本项目申请团队凝集了国内生殖医学临床与基础研究的优势力量，围绕要解决的关键科学问题和研究目标，本项目设置以下四个研究课题：1.排卵障碍的神经内分泌调控机制2.卵巢局部因子在卵泡发育及排卵障碍中的作用机制3.人多囊卵巢综合征关联基因筛查及其分子机理研究4.人原发性卵巢功能不全的相关基因筛选及功能研究课题1：排卵障碍的神经内分泌调控机制研究目标利用多囊卵巢综合征和原发性卵巢功能不全大鼠或小鼠动物模型，研究多囊卵巢综合征和原发性卵巢功能不全形成过程中内分泌激素、神经递质、卵巢钠肽系统以及胰岛素及相关因子在排卵障碍中的作用机制。

筛选钠肽系统和神经递质受体类药物靶点，为多囊卵巢综合征和原发性卵巢功能不全的临床治疗重要的理论和实验基础。

研究内容1.植物性神经递质与内分泌因子相互作用调控卵泡发育和排卵的分子作用机制卵泡发育过程的不同阶段不仅受一系列特定基因程序性表达的调控，同时也受来自下丘脑、垂体和卵巢本身所分泌激素和神经递质的调节。

如果神经内分泌紊乱将导致卵子发生失败、卵母细胞早熟或不成熟、不排卵和卵泡闭锁，进而引起不育，如多囊卵巢综合征和原发性卵巢功能不全。

因此研究多囊卵巢综合征和原发性卵巢功能不全发生过程中神经递质与内分泌因子（FSH/LH、Leptin）如何相互作用调控卵泡发育和排卵，并阐明其具体分子作用机制，对于排卵障碍疾病的治疗和预防、延缓绝经期到来、提高生活质量也具有重要的临床指导价值。

首先，建立PCOS、POI大鼠模型，研究神经递质、内分泌因子（FSH/LH、Leptin）及其受体在卵泡发育和排卵过程中的表达模式和相互作用关系。

其次，利用体外卵泡培养方法，通过添加神经递质或内分泌因子受体激动剂或阻断剂，深入研究神经内分泌因子在多囊卵巢和原发性卵巢功能不全形成过程中的调控关系和分子作用机制。

并利用PCOS、POI动物模型以及钠肽系统基因突变小鼠，结合神经递质受体阻断剂，阐明神经递质与钠肽系统的调控关系，并找到可能的通过神经干扰改善PCOS、POI发生的方法。

最后，利用人类临床组织标本，检测分析神经递质受体表达模式的变化；并通过体外细胞培养方法，验证在动物模型取得的实验结果在人类临床是否适用。

2.促性腺激素-心钠肽系统调节卵母细胞成熟以及排卵的细胞内信号通路卵泡发育和排卵如果出现异常将会导致女性生殖相关疾病的发生，如PCOS和POI严重影响女性的生育能力。

那么在卵泡发育和排卵过程中，卵母细胞和卵泡体细胞如何相互识别和交流、建立细胞内信号通路、如何交流？是哪些基因通过何种机制决定了排卵？在PCOS和POI动物模型中促性腺激素又如何通过钠肽系统介导卵泡体细胞与卵母细胞的相互作用，其中会发生哪些异常调节现象，现象背后的具体细胞和分子机制又如何？针对上述问题，本课题将综合比较目前几种主要的PCOS、POI大鼠动物模型中钠肽系统的表达模式和作用方式发生了哪些异常变化，确定适用于本研究的PCOS、POI动物模型。