蛋白质活性测定方法
蛋白酶活性的测定方法及原理
6
考X马-光斯胶亮片蓝法法
• 酶的底物明胶涂抹在X-光胶片上，当待测酶液 滴加到X-光胶片上时，酶将X-光胶片上的明胶 水解，用水冲洗胶片，即可看到胶片上明胶被 酶水解的地方，出现透明的圆圈。酶活性的高 低与透明圆圈的面积成正比。测定圆圈的面积 以测定蛋白酶的活性。。
④PH对酶活力的影响：酶在最适PH范围内表现出活性，大于或小于最适PH，都会降低酶活性。 ⑤激活剂对酶活力的影响：某些无机阳离子、阴离子、有机化合物可作为激活剂，能够激活酶，使其表现出催化活性或强化其催化活性。 ⑥抑制剂对酶活力的影响：酶的抑制剂能够减弱、抑制甚至破坏酶的活力，它可降低酶促反应速度。
标准曲线的绘制
L-酪氨酸标准溶液按下表配制
试管0
100μg/ml
酪氨溶液
O
（ ml ）
蒸馏水 （ ml ）
10
酪氨酸实际
浓度
ห้องสมุดไป่ตู้
O
（μg/ml ）
试管1 1 9 10
试管2 2 8 20
试管3 3 7 30
试管4 4 6 40
试管5 5 5 50
分别取上述溶液各1.00ml(须做平行试验)，各加入0.4mol/L碳酸钠溶液5.00ml。福林试剂使用溶 液1.00ml,置于40+0.2℃水浴中显色20min,取出用分光光度计于波长680nm,比色，以不含酪氨酸 的0管为空白管调零点，分别测定其吸光度值，以吸光度值为纵坐标，酪氨酸的浓度为横坐标， 绘制标准曲线或计算回归方程。计算出当OD为1时的酪氨酸的量（μg），即为吸光常数K值，其 K值应在95~100范围内。
蛋白酶活性的测定方法及原理
罗老师
组员
宁陈
陈王
舒丽
简述几种测定蛋白质方法及原理
简述几种测定蛋白质方法及原理蛋白质是生物体内最重要的分子之一，其功能多种多样，涉及到生命的方方面面。
了解蛋白质的性质、结构和功能非常重要。
为了实现这一目标，科学家们开发了多种方法来测定蛋白质的存在和浓度，以及研究其结构和功能。
在本文中，我们将简要介绍几种常见的测定蛋白质方法及其原理。
一、低丰度蛋白质检测方法在复杂样品中，许多蛋白质的浓度很低，因此需要采用高灵敏度的方法进行检测。
以下是两种常见的低丰度蛋白质检测方法。
1. Western blotting方法Western blotting方法是一种常用的蛋白质检测方法，通过将蛋白质转移到固体支持体上，然后使用特异性抗体来探测目标蛋白质的存在。
这个方法的原理是在电泳分离后，将蛋白质转移到聚丙烯腈膜或硝酸纤维素膜上。
样品经过特异性抗体结合，最后通过酶标记二抗或荧光二抗来使目标蛋白质可见。
2. 质谱法质谱法是一种利用质谱仪测定蛋白质质量的方法。
这种方法的原理是将蛋白质分解成肽段，然后通过质谱仪测定这些肽段的物质质量。
质谱法可以提供非常准确和高灵敏度的蛋白质测定结果，适用于分析复杂样本中的低丰度蛋白质。
二、蛋白质浓度测定方法蛋白质的浓度是研究蛋白质的基础，因此准确测定蛋白质浓度非常重要。
以下是两种常见的蛋白质浓度测定方法。
1. 比色法比色法是一种通过测量某种化学试剂与蛋白质之间的化学反应来测定蛋白质浓度的方法。
布拉德福德比色法使用染料染色蛋白质产生吸光度，再根据标准曲线定量测定蛋白质浓度。
这种方法简单、快速且灵敏度较高，适用于大多数蛋白质样品。
2. BCA法BCA法是一种利用受体配合反应来测定蛋白质浓度的方法。
在这种方法中，受体配体（biotin-avidin 或biotin-streptavidin）与蛋白质中的特定残基（如组氨酸等）结合生成复合物，然后通过比色反应测定复合物的吸光度。
BCA法具有高灵敏度和较低的非特异性反应。
三、蛋白质结构分析方法蛋白质的结构直接影响其功能和性质，因此了解蛋白质的结构是非常重要的。
蛋白质测定方法
蛋白质测定方法蛋白质是生物体内重要的有机物质，它们参与了生物体内的许多生命活动，对于研究蛋白质的结构和功能，以及蛋白质在生物体内的定量分析，蛋白质测定方法显得尤为重要。
本文将介绍几种常用的蛋白质测定方法，以供参考。
首先，最常用的蛋白质测定方法之一是比色法。
比色法是通过蛋白质与某些化学试剂反应后产生有色产物，再利用分光光度计测定其吸光度从而确定蛋白质的含量。
这种方法操作简单，灵敏度高，广泛应用于蛋白质的测定中。
其次，还有一种常用的蛋白质测定方法是BCA法。
BCA法是利用蛋白质与BCA试剂在碱性条件下发生还原反应生成紫色螯合物，然后利用分光光度计在562nm波长处测定其吸光度，从而确定蛋白质的含量。
与传统的Lowry法相比，BCA法对于一些干扰物质的敏感度更低，且操作更简便。
另外，还有一种常用的蛋白质测定方法是荧光法。
荧光法是利用蛋白质与荧光素染料结合后发生荧光信号来测定蛋白质的含量。
与比色法相比，荧光法对于一些有色干扰物的影响更小，灵敏度更高，可以用于测定含量较低的蛋白质样品。
此外，还有一种常用的蛋白质测定方法是Western blotting。
Western blotting是一种通过电泳分离蛋白质，然后转膜到膜上，再用特异性抗体结合蛋白质进行检测的方法。
这种方法可以用于确定蛋白质的相对分子质量和定量分析。
总的来说，蛋白质测定方法有很多种，每种方法都有其特点和适用范围。
在选择合适的蛋白质测定方法时，需要根据实验的具体要求和条件来进行选择。
希望本文介绍的几种常用的蛋白质测定方法能够对您有所帮助。
蛋白质测定方法及原理
蛋白质测定方法及原理蛋白质是生物体内组成和调节生命活动的重要基质，因此对蛋白质浓度进行准确的测定具有重要意义。
目前常用的蛋白质测定方法主要有生物学法、光学法和化学方法等。
生物学法是一种常用的蛋白质测定方法，通过测定蛋白质与其他生物体成分之间的相互作用来间接推断蛋白质的浓度。
常见的生物学法包括胱氨酸法、比色法和酶标记法等。
胱氨酸法是一种通过测定蛋白质中胱氨酸的含量来推断蛋白质浓度的方法。
胱氨酸是蛋白质的主要成分之一，它的浓度与蛋白质的浓度呈正相关关系。
因此，可以通过测量胱氨酸的含量来推断蛋白质的浓度。
胱氨酸法的原理是将待测蛋白质与胱氨酸反应生成蛋白胱氨酸络合物，然后用氧化剂将络合物氧化为带有色度的化合物。
根据带色化合物的吸光度，可以推算蛋白质的浓度。
比色法是一种通过测量溶液中蛋白质与试剂之间的染色反应来推测蛋白质浓度的方法。
常见的比色试剂有布拉德福德试剂、联苯胺蓝试剂和阿氏试剂等。
比色试剂与蛋白质之间发生染色反应后，可以测量溶液的吸光度，并通过标准曲线法来推算蛋白质的浓度。
酶标记法是一种通过酶标记的反应来测定蛋白质浓度的方法。
其原理是将酶与蛋白质反应生成酶标记的复合物，然后用底物与酶反应，使酶催化底物生成可检测的产物。
通过测量产物的光吸光度或荧光强度，可以推断蛋白质的浓度。
光学法是一种通过测量蛋白质溶液对光的吸收或散射来推断蛋白质浓度的方法。
其中，紫外可见光吸收法是一种常用的光学法。
蛋白质溶液对特定波长的光具有吸收作用，且吸收作用与蛋白质浓度成正比。
因此，通过测量蛋白质溶液对光的吸收，可以推算蛋白质的浓度。
化学方法是一种通过化学反应来测定蛋白质浓度的方法。
常用的化学方法包括低里氏法、尿素硝酮反应法和近红外光谱法等。
这些方法通过测量蛋白质与特定试剂之间的化学反应产物的吸光度、荧光强度或反应物质的浓度，来推断蛋白质的浓度。
总之，蛋白质的测定方法多种多样，根据具体的实验要求和条件选择合适的方法是准确测定蛋白质浓度的关键。
蛋白质的测定
4、蛋白质分析的重要性
生物活性测定 功能性质调查 营养标签
总蛋白质含量 氨基酸组成 蛋白质的 Nhomakorabea养价值5、蛋白质的测定方法
利用蛋白质共性的方法 利用特定氨基酸残基法
凯氏定氮法 杜马斯法 福林酚法 染色法
第二节 蛋白质的定性测定
一、蛋白质的一般显色反应 电泳或纸层析之后用一些染料与蛋白质结合并 变色。书中列举了 5 种染料。 二、复合蛋白质的显色反应 （一）糖蛋白的显色（3种方法） （二）脂蛋白的显色（2种方法）
A540
取两组测定的A540值的平均值，即A540为纵坐标，蛋 白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。
2、样品测定
取4支试管分成两组，按下表平行操作：
0
1
样品稀释液/ml
0.5
蒸馏水/ml
1.0
0.5
双缩脲试剂/ml
4.0
4.0
A540
3、计算
取两组测定的平均值计算：
固体样品蛋白质的含量(%) Y N 100% c
有干扰
杜马斯
福林-酚
总氮量
蛋白氮
高温装置、GC 分光光度计
不需要
福林-酚试剂
3min 高
简单快速 高
较小
酸类及柠檬 酸类
其他方法
染色法 紫外 吸收法
水杨酸比色法
采用凯氏定氮法测一样品的粗蛋白含量，根据下 列记录的数据计算：
水份含量=8.0%，1 号样品重量=1.015g，2号样 品重量=1.025g，用于滴定的标准HCl浓度 =0.1142mol/L，1号样品所用的HCl溶液的毫升数 =22.0mL，2号样品的HCl溶液的毫升数=22.5mL， 空白的HCl溶液的毫升数=0.2mL，分别以样品的干 基和湿基计算粗蛋白质含量，假定该蛋白质含有 17.5%的氮。
蛋白质的测定方法有哪些
蛋白质的测定方法有哪些蛋白质测定是一个重要的生物化学实验，用于确定样品中蛋白质的含量和纯度。
目前常用的蛋白质测定方法主要有生物化学方法、光谱法、免疫学方法和质谱法等。
下面将详细介绍这些方法。
1. 生物化学方法：生物化学方法是一种常用的蛋白质测定方法，主要包括低里氏法、比色法和滴定法等。
低里氏法基于酵素反应测定蛋白质含量，其中最常用的是双维小麦胚芽过氧化物酶法。
比色法是通过染色剂和蛋白质的反应来测定蛋白质浓度，常用的比色剂有考马斯亮蓝G-250和布拉德福棕色R-250等。
滴定法是通过滴加蛋白质溶液的滴定剂，如硝酸银溶液和碘溶液等，来测定蛋白质的含量。
2. 光谱法：光谱法是利用蛋白质在特定波长下吸收光线的特性来测定蛋白质的含量和纯度。
UV-Vis吸收光谱法是最常用的光谱法之一，根据蛋白质在280 nm处吸收的特性来测定蛋白质浓度。
近红外光谱法也可以用于蛋白质浓度的测定，因为蛋白质的结构可以在近红外区域引起光的散射和吸收。
3. 免疫学方法：免疫学方法是利用抗体与特定蛋白质发生特异性反应来测定蛋白质的含量和纯度。
常用的免疫学方法包括酶联免疫吸附法（ELISA）、免疫印迹法（Western blotting）和免疫沉淀法等。
ELISA是一种高灵敏度的蛋白质测定方法，通过抗原与特异性抗体在单克隆板上的特异性结合来测定蛋白质的含量。
Western blotting是一种常用于检测特定蛋白质的方法，通过电泳分离蛋白质，然后用特异性抗体检测目标蛋白质。
免疫沉淀法利用特异性抗体与目标蛋白质结合，然后通过共沉淀或差速离心的方式将目标蛋白质从混合物中分离出来。
4. 质谱法：质谱法是一种高分辨率的蛋白质测定方法，主要有质谱光查法（MS）和质谱对比法（MS/MS）两种。
质谱光查法通过蛋白质在质谱仪中的分子离子质量和电荷比来确定蛋白质的分子量和浓度。
质谱对比法则是将待测蛋白质与已知质量的蛋白质进行比较，从而确定样品中蛋白质的含量和纯度。
实验设计：卵清蛋白
实验注意事项
1 2 3
蛋白质浓度过大，盐析时发生共沉，分离效果不好。 • 蛋白质浓度太稀，耗盐量过大，蛋白质回收率较低。一 般蛋白质浓度在2.5%～3.0%较适中。
蛋白质提取过程中须注意温度的控制，一般在20℃ 以下进行
调节等电点一定要准确，在本实验中，球蛋白和卵 清蛋白的等电点相差较小，若不准确，会导致蛋白 质不纯。
9 提取液
1.0 3.0
0 4.0 0
0.5 3.5 0.125
1.0 3.0 0.25
1.5 2.5 0.375
2.0 2.0 0.50
2.5 1.5 0.625
3.0 1.0 0.75
4.0 0 1.0
实验步骤
（二）蛋白提取液中蛋白质含量测定 1、提取液分别稀释1倍、10倍、20倍后，取待测蛋白质 溶液1ml，加入蒸馏水3ml，摇匀，按上述方法在280nm 波长处测定光吸收值，并从标准曲线上查出经稀释的待测 蛋白质的浓度。 排除干扰：将待测蛋白质溶液适当稀释，在波长260nm 和280nm处分别测出A值，然后利用280nm及260nm下的 吸收差求出蛋白质浓度。 2.计算：蛋白质浓度（mg/ml）=1.45A280-0.74A260 （式中A280和A260分别是该溶液在280nm和260nm波长下 测得的光吸收值）
.
弃上清液
实验步骤
二.卵清蛋白活性测定：
（一）紫外吸收法测定卵清蛋白的含量 1、标准曲线法 （1）标准曲线的绘制 按下表分别向每支试管加入各种试剂，摇匀。在280nm波长处分别测定各 管溶液的A280值。以A280值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。
试管号 试剂 标准蛋白溶液 /mL 蒸馏水/mL 蛋白质浓度 /mg/mL A280 1 2 3 4 5 6 7 8
蛋白定量的方法
蛋白定量的方法
蛋白定量是指检测样本中蛋白质含量的一种方法，也可以称为“蛋白测定”或“蛋白质测定”。
蛋白定量方法主要分为生物化学法、免疫分析法、流式细胞仪分析法和电泳分析法四大类。
1、生物化学法：生物化学法是目前最常用的蛋白定量方法，主要通过测定蛋白质的酶促反应来实现，如可用葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶等蛋白质的特异酶作为指标，测量不同样本中的酶活性差异来实现蛋白定量。
2、免疫分析法：免疫分析法主要分为免疫印迹法（Western blotting）、免疫沉淀法（Immunoprecipitation）和ELISA三种，它们均利用特异的抗体对特定的蛋白质进行测定，以此来实现蛋白的定量。
3、流式细胞仪分析法：流式细胞仪分析法是一种基于细胞的分析方法，主要利用特定的抗体标记特定蛋白质，通过细胞分析仪分析细胞中标记蛋白质的数量，从而实现蛋白定量。
4、电泳分析法：电泳分析法是一种快速、灵敏的蛋白定量方法，其原理是利用电泳将多种不同种类的蛋白质分
子按大小和性质电泳分离出来，然后通过试剂盒进行叠加反应，使相应的蛋白分子变得可见，从而可以实现蛋白的定量。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
核糖核酸酶（RNase）的活性测定
（1）溶液的配制：
①0.1 mol/L pH 5.0的乙酸缓冲溶液：称取5.78 g CH3COONa, 加入1.7 mL CH3COOH, 用蒸馏水稀释至500 mL。
② 0.05 % RNase酵母溶液：称0.05 g RNase酵母，用0.1 mol/L pH 5.0的乙酸缓冲溶液溶解并稀释至100 mL。
测活方法：
（2）用移液管移取已配制好的0.05 %的核糖核酸酵母溶液2.5 ml于比色皿中，加入一定量的样品RNase A溶液，迅速摇匀，以蒸馏水为参比，在300 nm波长下每隔30秒测一次吸光值，共读3分钟，得到一组对应于时间t(min)的At值。
当样品管反应3小时后再测定300 nm处的吸光值A f, A f为最终的光吸收，分别求得一组对应于t的log(A t-A f), 以log(A t-A f)对时间t作图应得到线性关系，画出直线。
求出直线斜率的数值S，将S带入标准曲线，求得活性回收率。
将S带入下列公式中，可求出酶的活力。
单位/ mg = S × (-2.3) ×4 / (样品管中含酶的数量)
胰凝乳蛋白酶（α-Chy）活性测定
用胡梅尔(Hummel)法测定α-胰凝乳蛋白酶[2]：
(1) 原理：α-胰凝乳蛋白酶优先催化水解结合有氨基酸（如酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的L-异构体）的肽键。
我们可以通过在256 nm处测定吸光度增大值的办法来测定反应的速度。
苯甲酰-L-酪氨酸乙酯的水解反应引起吸光度的增大。
(2) 定义：一个凝乳蛋白酶单位相当于在pH值为7.8，温度为25 ℃时，每分钟水解1 μmol苯甲酰-L-酪氨酸乙酯(BTEE)所需的酶量。
(3) 试剂配置方法：
Tris缓冲液(pH: 7.8)取0.969 g三（羟甲基）氨基甲烷和1.47 mg二水氯化钙溶于
80 mL蒸馏水中，用1 N的盐酸将pH值调至7.8，并定容至100 mL。
①盐酸(HCl): 0.001 moL/L
②酶溶液：先用盐酸溶解酶，使溶液浓度达到1 mg/mL，然后再用盐酸稀释，使最终浓度达到0.5～1.0 U/mL。
③底物溶液：取33.5 mg苯甲酰-L-酪氨酸乙酯溶于50 %的甲醇(63 mL甲醇与50
mL 蒸馏水混合)，定容至100 mL 。
（4）操作步骤：用移液管将1.5 mL Tris 缓冲液和1.4 mL 底物溶液滴入一只1 cm 比色皿，并加热至25℃，加0.10 mL 酶溶液，摇匀。
用分光光度计(256 nm)测定反应混合物的吸光度，在约5.0 min 内每隔1.0 min 读取吸光度一次，直到每分钟吸光度的增大值达到稳定为止。
（5）计算
用以下公式计算酶的活性：
U/mg 3E 0.964E w 256=⨯⨯
式中：Ｅ256—在256 nm 处测得的每分钟内吸光度的增大值
Ｅw —每0.10 mL 所用酶液中含酶的重量(mg)
0.964—1 μmol BTEE 的吸光度(256 nm 处)
3—反应液的总体积
胰蛋白酶（Trypsin ）的活性测定
用施韦尔特-竹中（Schwert & Takenaka ）法测定胰蛋白酶[3]：
(1)原理：胰蛋白酶将N-苯酰基-L-精氨酸从BAEE 中释放出来，用分光光度计于253 nm 处跟踪测定由该反应引起的吸光度增大情况。
(2)定义：一个胰蛋白酶单位相当于在规定条件下每分钟使吸光度增大0.001时所需的酶量。
(3)试剂配置方法：
①底物溶液：取30.9 mg BAEE ，280 mg 二水氯化钙和566 mg 三羟甲基甲烷溶于70 mL 蒸馏水中，将pH 值调至7.6。
定容至100 mL 。
②盐酸（HCl ）：0.001 mol/L
③酶溶液：酶用0.001 N 盐酸溶解。
1.0 mL 配制酶溶液中应含有150 U 左右。
(4) 操作步骤：用移液管将2.8 mL 底物溶液滴入1 cm 比色皿，调温至25 ℃。
添加0.20 mL 酶溶液，混合。
用分光光度计于253 nm 处以蒸馏水为参比测定吸光度，直至每分钟吸光度增大值达到恒定为止。
(5) 计算：
用以下公式计算活性:
U/mg E 0.001E w 253=⨯
式中 Ｅ253—每分钟内253 nm 处吸光度的增大值
0.001—一个酶单位每分钟使吸光度增大0.001
E w —0.2 mL 所用的酶溶液中含酶的重量(mg)
Lys 活性的测定
取溶壁球菌干菌粉少许，加入少量0.067 mol/L 的磷酸缓冲液(pH=6.2)，用玻璃棒研磨匀浆，再加入磷酸缓冲液至OD 值为0.6-0.8即可。
用移液管移取3.0 mL 配置好的溶壁球菌菌液于比色皿中，加入一定量的Lys 溶液(酶量在100 ug 左右)，迅速摇匀，以蒸馏水为参比，在450 nm 的波长下每隔30秒测一次吸光值，共读3分钟，以吸光度对时间作图，取最初线性部分，其斜率即为吸光度值的变化率。
在以吸光度值的变化率对加入标准蛋白的质量作图，用同样的方法测定样品的吸光度值的变化率，依据标准曲线求得蛋白的绝对量或浓度，与同时对照的标准蛋白活性绝对值或浓度比较，便可计算出活性回收率。
中国生物制品标准化委员会编. 中国生物制品规程[M]. 北京: 化学工业出版社, α-Amy 活性的测定
（1）溶液的配制：
①0.02mol/L 磷酸缓冲液（PH7.0）：称取1.8g 磷酸氢二钠和1.0g 磷酸二氢钾，用水溶解后定容至1L 。
②0.1%淀粉溶液：称取100mg 可溶性淀粉与50mL 烧杯中，加少量蒸馏水制成糊状，然后转移到盛有80mL0.01mol/L 氢氧化钠的150mL 烧杯中煮沸，冷却后倾入100mL 容量瓶中，用0.01mol/L 氢氧化钠稀释至刻度。
③0.005mol/L 碘液:称取3g 碘化钾和1.3g 碘用水溶解后，稀释至0.05mol/L 碘液，然后再稀释10倍。
④标准酶液：准确称取1.0mg 高纯度α-Amy 于离心管中，加入1mL 水，溶解后，于12000RPM 离心5分钟，上清液转移到另一离心管中备用。
用时稀释100倍。
（2）活性测定
取7支比色管，用移液管准确加入3.0mL0.1%淀粉溶液，5.0mL 磷酸缓冲液，然后分别加入稀释标准酶液0.0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6mL ，在37度温热15分钟后取
出立即冷却，于每个比色管中各加入0.4mL0.005mol/L碘液，用水稀释至刻度，摇匀，以蒸馏水为参比，在波长580nm条件下，用分光光度计测量吸光度，在一定范围内，吸光度减弱的程度与酶活力大小成比例。