胰蛋白酶活性测定
胰蛋白酶的制备及活力的测定-1
胰蛋白酶的制备及活力的测定-1目的要求1．学习胰蛋白酶的纯化及其结晶的基本方法。
2．了解酶的活性与比活性的概念。
实验原理胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物胰脏中，在Ca2+的存在下，被肠激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活，从肽链N端赖氨酸和异亮氨酸残基之间的肽键断开，失去一段六肽，分子构象发生一定改变后转变为有活性的胰蛋白酶。
胰蛋白酶原的分子量约为24000，其等电点约为pH8.9，胰蛋白酶的分子量与其酶原接近（23300），其等电点约为pH10.8，最适pH7.6～8.0，在pH=3时最稳定，低于此pH时，胰蛋白酶易变性，在pH>5时易自溶。
Ca2+离子对胰蛋白酶有稳定作用。
重金属离子，有机磷化合物和反应物都能抑制胰蛋白酶的活性，胰脏、卵清和豆类植物的种子中都存在着蛋白酶抑制剂。
最近发现在一些植物的块基（如土豆、白薯、芋头等）中也存在有胰蛋白酶抑制剂。
胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的键具有高度的专一性。
此外还能催化由碱性氨基酸和羧基形成的酰胺键或酯键，其高度专一性仍表现为对碱性氨基酸一端的选择。
胰蛋白酶对这些键的敏感性次序为：酯键> 酰胺键> 肽键。
因此可利用含有这些键的酰胺或酯类化合物作为底物来测定胰蛋白酶的活力。
目前常用苯甲酰-L-精氨酸-对硝基苯胺（简称BAPA）和苯甲酰-L-精氨酸-β-萘酰胺（简称BANA）测定酰胺酶活力。
用苯甲酰-L-精氨酸乙酯（简称BAEE）和对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯（简称TAME）测定酯酶活力。
本实验以BAEE为底物，用紫外吸收法测定胰蛋白酶活力。
酶活力单位的规定常因底物及测定方法而异。
从动物胰脏中提取胰蛋白酶时，一般是用稀酸溶液将胰腺细胞中含有的酶原提取出来，然后再根据等电点沉淀的原理，调节pH以沉淀除去大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量糜蛋白酶原和弹性蛋白酶原）沉淀析出。
【医学】胰蛋白酶的活力的测定
操作方法
取2个光程为1厘米的带盖石英比色杯，分别加入25℃予
热过的2.8ml底物溶液。向一只比色杯中加入0.2ml 0.001mol/L HCl，作为空白，校正仪器的253nm处光吸收零点。再在另一 比色杯中加入0.2ml待测酶液，立即混匀并记时，每半分钟读 数一次，共读3~4分钟。 绘制酶促反应动力学曲线，从曲线上求出反应起始点吸 光度随时间的变化率（即初速度）A253/min。
国际系统分类
酶原与酶原激活 无活性的酶前身物称酶原。由无活性酶原 转变为有活性酶的过程称酶原激活。 同工酶 分子结构不同、理化性质也不同，但催化同一化学 反应的一组酶，如乳酸脱氢酶（LDH）。 别位酶 多亚基组成，其中有催化亚基、有调节亚基，小分
子化合物结合调节亚基后分子构象改变，引起催化活性改变。
五、酶的活力测定
酶活力（enzyme activity），是指酶催化一定化学反 应的能力。 酶活力单位（国际单位） 标准状态下，每分钟使一微克 分子作用物发生转变的酶量。人们普遍 采用是习惯用法，如 a-淀粉酶，可用每小时催化1克可溶性淀粉所需要的酶量来表 示。
胰蛋白酶活力单位的定义规定为：以 BAEE 为底物反应液 pH8.0 ，
25℃，反应体积 3.0ml ，光径 1 厘米的条件下，测定 A253 ，每分 钟使A253增加0.001，反应液中所加入的酶量为一BAEE单位。
酶活力与ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ反应速度
初速度 研究酶反应的动力学以酶促反应的初速度为准
18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0 5 10 时间 15 20
用于判断和确定酶活型中心的主要方法：
1、专一性研究 通过研究酶的专一性底物的结构特点，来判断 和确定活性中心的结构特点。
7 胰蛋白酶活力的测定
中国海洋大学实验报告姓名庞裕智专业年级生命基地班2011 题目胰蛋白酶活力的测定学号040312011025 科目生物化学实验时间周一90节同组者田特一、实验目的学习和掌握胰蛋白酶活力测定的方法。
二、实验原理福林—酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸，在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原为蓝色化合物（钨蓝和钼蓝）。
蛋白质中含具酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），用胰蛋白酶水解蛋白底物，生成含酚基的氨基酸与福林—酚试剂反应，生成蓝色化合物，在一定的范围内，蓝色化合物颜色的深浅与酶活力的大小成正比。
三、实验仪器1、试管2、7220分光光度计3、恒温水浴锅四、实验试剂、1、福林试剂B：见福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度部分(冰箱中)2、0.55mol/L碳酸钠溶液：58.3g无水碳酸钠溶于蒸馏水，稀释并定容至1000ml3、10%三氯乙酸溶液4、0. 2mol/L磷酸缓冲液(pH7.5)：5、0.5% 酪素溶液：称取0.5g酪素，以0.5mol/L氢氧化钠1ml湿润，再加少量0. 2mol/L 磷酸缓冲液稀释。
在水浴中煮沸溶解，冷却，稀释并容至100ml，冷藏在(冰箱)里。
6、500ug/L酪氨酸溶液7、胰蛋白酶溶液(冰箱中)五、实验步骤标准曲线的制作：按下表加入试剂：滤除去沉淀，取清液1ml，加入0.55mol/L碳酸钠5ml，再加入福林试剂1ml，于37 ℃水浴中显色15分钟，测OD680。
以光密度为纵坐标，酪氨酸的微克数为横坐标绘制标准曲线。
样品测定：取干燥的试管2支，按下表加入试剂六、实验结果酶活力：在37℃下每分钟水解酪素产生lug酪氨酸为一个活力单位。
样品中含酶活力单位=A/15 ╳FA—样品测定光密度查曲线得相当酪氨酸ug数F—酶液稀释倍数由标准曲线知，当OD680=0.244时，样品中酪氨酸的微克数为A=181ug ∴样品中胰蛋白酶活力单位为181/15×13=156.87七、实验分析1.注意事项（1）胰蛋白酶一定要刚提取的新鲜酶；（2）要在酶的最适温度40℃下反应；（3）要在酶的最适PH为7.5调节下反应；（4）催化反应的时间控制精确；（5）向样品测定的1号试管加入三氯醋酸时要快；（6）加入各种药品的量要精确，特别是酶。
胰蛋白酶比活力测定的实验操作
胰蛋白酶比活力测定的实验操作胰蛋白酶（trypsin）是一种重要的消化酶，用于蛋白质的降解。
测定胰蛋白酶的比活力可以评估其酶活性及纯度。
下面是测定胰蛋白酶比活力的实验操作步骤。
实验所需材料：1.胰酶溶液2. Brain Heart Infusion (BHI)培养基3. 丙氨酰-L-苯丙氨酰-L-色氨酸对(L-Tyr-L-Phe)4.0.1M氢氧化钠（NaOH）溶液5.0.1M硫酸（H2SO4）溶液实验步骤：1.准备酶样品：取适量的胰酶溶液，可以是商业制备的纯胰蛋白酶或者胰腺提取物。
2. 酶样品稀释：将胰酶溶液与BHI培养基按照一定比例混合，使得最终浓度在0.5-1.2mg/mL之间。
3.加入底物：向每个试管中加入20μL的丙氨酰-L-苯丙氨酰-L-色氨酸对底物。
4.孵育反应：将试管置于37℃恒温培养箱中，在设定的时间内进行酶催化反应。
5.终止反应：用加入2NNaOH溶液终止酶反应，使底物水解停止。
6.酶解产物的提取：将反应液离心，取上清液转移到新的离心管中。
实验测量方法：1. 分光光度计法：利用胰酶催化底物水解产生的对分光光度计可见吸收的产物进行测定。
用1cm光程的比色皿，将底物水解产物的吸光度读数记录下来。
2. pH差比色法：用pH差比色法测量胰酶反应液中产生的酪氨酸分解产物。
黄色小麦胚芽酪氨酸（Tyr）的醛缩反应，其产物具有红色或紫色，在526nm处吸收峰。
通过比较不同样品的吸收度可以得出胰酶比活力。
数据处理：1.分光光度计法：根据底物水解产物的吸光度，绘制标准吸光度-底物浓度曲线，利用该曲线确定底物浓度，进一步计算胰酶的比活力。
2.pH差比色法：计算样品吸收值，将其与标准吸光度曲线相对应的底物浓度进行比较，计算胰酶的比活力。
注意事项：1.操作要严格遵守无菌技术，以避免细菌或其他污染物对实验结果的干扰。
2.实验过程中可以选择不同的底物和测量方法，以适应实验目的和条件。
3.实验操作需谨慎，避免接触眼睛和口腔，注意个人安全。
生化实验报告 胰蛋白酶活力测定
胰蛋白酶活力测定一、实验原理1、福林—酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸，在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原为蓝色化合物（钨蓝和钼蓝）。
2、蛋白质中含具酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），用胰蛋白酶水解蛋白底物，生成含酚基的氨基酸与福林—酚试剂反应，生成蓝色化合物，在一定的范围内，蓝色化合物颜色的深浅与酶活力的大小成正比。
二、实验仪器1、试管2、7220分光光度计3、恒温水浴锅三、实验试剂1、福林试剂B：见福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度部分(冰箱中)2、0.55mol/L碳酸钠溶液：58.3g无水碳酸钠溶于蒸馏水，稀释并定容至1000ml3、10%三氯乙酸溶液4、0. 2mol/L磷酸缓冲液(pH7.5)：5、0.5% 酪素溶液：称取0.5g酪素，以0.5mol/L氢氧化钠1ml湿润，再加少量0. 2mol/L磷酸缓冲液稀释。
在水浴中煮沸溶解，冷却，稀释并容至100ml，冷藏在(冰箱)里。
6、500ug/L酪氨酸溶液7、胰蛋白酶溶液(冰箱中)四、实验步骤1、标准曲线的制作：按下表加入试剂：各管中加0.5%酪素2ml，于37℃水浴中反应15分钟，然后加入10%三氯乙酸3ml，过滤除去沉淀，取清液1ml，加入0.55mol/L碳酸钠5ml，再加入福林试剂1ml，于37 ℃水浴中显色15分钟，测OD680。
以光密度为纵坐标，酪氨酸的微克数为横坐标绘制标准曲线。
样品中含酶活力单位=A/15 ╳FA—样品测定光密度查曲线得相当酪氨酸ug数F—酶液稀释倍数由上可知，样品的吸光度y=0.993，则x=0.8μg，即A=0.8μg 故根据公式样品中含酶活力单位=A/15 ╳FA—样品测定光密度查曲线得相当酪氨酸ug数F—酶液稀释倍数胰蛋白酶活力为：0.8 /15 ╳13=0.69六、实验分析1. 测定胰蛋白酶活力的原理?答：蛋白质中含具酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），用胰蛋白酶水解蛋白底物，生成含酚基的氨基酸与福林—酚试剂反应，生成蓝色化合物，在一定的范围内，蓝色化合物颜色的深浅与酶活力的大小成正比。
胰蛋白酶活性测定
胰蛋白酶活性测定在动物胰脏中，胰蛋白酶是以无活性的酶原状态存在的。
在生理条件下，胰蛋白酶原随胰液分泌至十二指肠后，在小肠上腔有Ca2+的环境中，为肠激酶或胰蛋白酶所激活，其肽链 N -端的赖氨酸与异亮氨酸之间的一个肽键被水解，失去一个酸性6肽，其分子构象发生一定的改变后转变为具有催化蛋白质水解活性的胰蛋白酶。
胰蛋白酶原分子量约为24 000，其等电点为pH8.9；胰蛋白酶的分子量约为23 400，其等电点为pH 10.8。
胰蛋白酶在pH3.0时最稳定，其浓溶液可贮存于冰箱（0℃以下）数周而活性无显著丧失。
pH＜3时，胰蛋白酶易变性。
PH＞５时，胰蛋白酶易自溶。
胰蛋白酶催化活性的最适pH为7.6～7.8。
重金属离子、有机磷化合物和反应产物都能抑制胰蛋白酶的活性。
胰脏、卵清和大豆中也含有一些蛋白质对胰蛋白酶活性具有抑制作用。
[原理]胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸（如精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的肽键具有高度的专一性。
此外，胰蛋白酶也能催化由碱性氨基酸的羧基所形成的酰胺键和酯键，有高度的专一性仍表现为对碱性氨基酸羧基一侧的选择对此等化学键的催化水解活性的敏感度为：酯键＞酰胺键＞肽键。
因此，可以利用含有这些化学键中任一种键型的底物来研究胰蛋白酶的专一催化活性。
本实验方法一采用N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯[（BAEE），N-benzoyl-L-arginine ethyl ester]作为底物.N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）在波长253nm下的紫外光吸收远远弱于N-苯甲酰-L-精氨酸[（BA），benzoyl-L-arginine]的紫外光吸收。
在胰蛋白酶的催化下，BAEE随着酯键的水解，水解产物 BA逐渐增多，反应体系的紫外光吸收亦随之相应增加，以△A253nm计算胰蛋白酶的活性。
胰蛋白酶的BAEE单位定义为：以BAEE为底物，在一定反应条件下，每分钟使△A253nm增加0.001的酶量为一个BAEE单位。
胰蛋白酶活性测定之欧阳光明创编
实验一胰蛋白酶活性测定欧阳光明（2021.03.07）实验目的：掌握测定胰蛋白酶浓度、活性、比活的原理与方法。
实验原理：胰蛋白酶相对分子量23.7 KD，主要水解肽链中碱性氨基酸与其它氨基酸相连接的肽键，此外还能水解碱性氨基酸形成的酯键，如把人工合成的N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（N-benzuyl-L-argine ethyl ester, BAEE）水解为H-苯甲酰-L-精氨酸（BA）。
胰蛋白酶所催化的上述反应中，产物BA对253 nm 的光吸收远大于BAEE，因此可以在实验起始点把253 nm 的消光值调为零，然后记录反应体系对253 nm 的消光值的增量，并把这个增量作为测定胰蛋白酶的活性指标。
酶活单位定义：在底物BAEE浓度1mmol/L，光程 1 cm，波长253nm，温度250C，测量体积3mL,.条件下吸光值每分钟递增0.001（A/min=0.001）为1个BAEE酶活单位。
胰蛋白酶制剂中蛋白质浓度含义：胰蛋白酶含量一般E1%表达。
这个值的含义是：浓度为1% 酶蛋白，在1cm光径下，对紫外280nm的消光值。
不同厂家、不同产品的E1%值有很大差别。
E1%值越高，表明酶制剂中酶蛋白含量越高。
由于酶制剂中蛋白质含量各不相同，所以用酶制剂配制E1%的蛋白质溶液时，按照厂家对产品的E1%的测定值配制溶液。
在本实验中，胰蛋白酶酶蛋白样品采用SIGMA 公司生产的产品,生产公司对展品的描述是对280nm紫外吸收值15.3，配制胰蛋白酶标准溶液可根据厂家的这个说明。
器材以试剂：器材，电子天平，紫外分光光度计，微量加样器。
试剂：标准胰蛋白酶，N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯，HCI, Tris。
1．胰蛋白酶活性测定：1）配制E1%的胰蛋白酶溶液每组取E1%=15.3的胰蛋白酶样品10mg 放到1ml去离子水中，充分溶解后，放入冰中保存。
2)按照表1 的要求配制试验体系所需其它各种溶液.3)按照表1的顺序进行测定标准胰蛋白酶的活性。
实训三胰蛋白酶的制备及活力的测定
实训三胰蛋白酶的制备及活力的测定目的要求1．学习胰蛋白酶的纯化及其结晶的基本方法。
2．了解酶的活性与比活性的概念。
实验原理胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物胰脏中，在Ca2+的存在下，被肠激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活，从肽链N端赖氨酸和异亮氨酸残基之间的肽键断开，失去一段六肽，分子构象发生一定改变后转变为有活性的胰蛋白酶。
胰蛋白酶原的分子量约为24000，其等电点约为pH8.9，胰蛋白酶的分子量与其酶原接近（23300），其等电点约为pH10.8，最适pH7.6～8.0，在pH=3时最稳定，低于此pH时，胰蛋白酶易变性，在pH>5时易自溶。
Ca2+离子对胰蛋白酶有稳定作用。
重金属离子，有机磷化合物和反应物都能抑制胰蛋白酶的活性，胰脏、卵清和豆类植物的种子中都存在着蛋白酶抑制剂。
最近发现在一些植物的块基（如土豆、白薯、芋头等）中也存在有胰蛋白酶抑制剂。
胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的键具有高度的专一性。
此外还能催化由碱性氨基酸和羧基形成的酰胺键或酯键，其高度专一性仍表现为对碱性氨基酸一端的选择。
胰蛋白酶对这些键的敏感性次序为：酯键> 酰胺键> 肽键。
因此可利用含有这些键的酰胺或酯类化合物作为底物来测定胰蛋白酶的活力。
目前常用苯甲酰-L-精氨酸-对硝基苯胺（简称BAPA）和苯甲酰-L-精氨酸-β-萘酰胺（简称BANA）测定酰胺酶活力。
用苯甲酰-L-精氨酸乙酯（简称BAEE）和对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯（简称TAME）测定酯酶活力。
本实验以BAEE为底物，用紫外吸收法测定胰蛋白酶活力。
酶活力单位的规定常因底物及测定方法而异。
从动物胰脏中提取胰蛋白酶时，一般是用稀酸溶液将胰腺细胞中含有的酶原提取出来，然后再根据等电点沉淀的原理，调节pH以沉淀除去大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量糜蛋白酶原和弹性蛋白酶原）沉淀析出。
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实验一胰蛋白酶活性测定实验目的：掌握测定胰蛋白酶浓度、活性、比活的原理与方法。
实验原理：胰蛋白酶相对分子量23.7 KD，主要水解肽链中碱性氨基酸与其它氨基酸相连接的肽键，此外还能水解碱性氨基酸形成的酯键，如把人工合成的N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（N-benzuyl-L-argine ethyl ester, BAEE）水解为H-苯甲酰-L-精氨酸（BA）。
胰蛋白酶所催化的上述反应中，产物BA对253 nm 的光吸收远大于BAEE，因此可以在实验起始点把253 nm 的消光值调为零，然后记录反应体系对253 nm 的消光值的增量，并把这个增量作为测定胰蛋白酶的活性指标。
酶活单位定义：在底物BAEE浓度1m mol/L，光程1 cm，波长253nm，温度25 0C，测量体积3mL,.条件下吸光值每分钟递增0.001（A/min=0.001）为1个BAEE酶活单位。
胰蛋白酶制剂中蛋白质浓度含义：胰蛋白酶含量一般E1%表达。
这个值的含义是：浓度为1% 酶蛋白，在1cm光径下，对紫外280nm 的消光值。
不同厂家、不同产品的E1%值有很大差别。
E1% 值越高，表明酶制剂中酶蛋白含量越高。
由于酶制剂中蛋白质含量各不相同，所以用酶制剂配制E1%的蛋白质溶液时，按照厂家对产品的E1% 的测定值配制溶液。
在本实验中，胰蛋白酶酶蛋白样品采用SIGMA 公司生产的产品,生产公司对展品的描述是对280nm紫外吸收值15.3，配制胰蛋白酶标准溶液可根据厂家的这个说明。
器材以试剂：器材，电子天平，紫外分光光度计，微量加样器。
试剂：标准胰蛋白酶，N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯，HCI, Tris。
1．胰蛋白酶活性测定：1）配制E1%的胰蛋白酶溶液每组取E1%=15.3的胰蛋白酶样品10mg 放到1ml去离子水中，充分溶解后，放入冰中保存。
2)按照表1 的要求配制试验体系所需其它各种溶液.3)按照表1的顺序进行测定标准胰蛋白酶的活性。
表1 胰蛋白酶活性测定加样顺序试剂步骤1：空白调零步骤2：样品测定0.1 mol/L Tris-HCl 缓冲液,pH 8.0 , 1.5 mL 1.5 mL2.0 m mol/L BAEE 1.5 mL 1.5 mL250C预热5min 250C预热5min胰蛋白酶:10mg/mL 0 L 10 L蒸馏水10 L 0 L充分摇匀充分摇匀步骤1：A253 nm/min 调0 -----------步骤2：A253-nm/min -------------- 记录在步骤2样品测定中，加入酶液后立即盖上盖迅速混匀计时，每半分钟读数一次，共读3～4min。
测得的结果要使△A253nm/min控制在0.05～0.100之间为宜，若偏离此范围则要适当增减酶量（5 L -20L之间，空白试验相应增减等体积水）后重新测定，一直到△A253nm/min值落在0.05～0.100之间为止。
3分别求算：1)标准胰蛋白酶溶液（浓度10mg/mL）的酶活和比活：计算方法：i)胰蛋白酶活性单位数计算：ii)胰蛋白酶比活计算: (用BAEE单位数/mg胰蛋白酶表示比活)实验二胰蛋白酶动力学测定实验目的：初步掌握以下几个酶动力学参数测定与求算方法：米氏常数Km,最大反应速度Vmax,转换数cat,特异性常数cat,/Km。
实验原理：已知胰蛋白酶遵守米氏方程，可以通过测定底物浓度与反应速度间的关系测定与求算这个酶的诸动力学参数。
胰蛋白酶可以水解碱性氨基酸的羧基所生成的肽键、酰胺建和酯键。
在本实验中，利用胰蛋白酶水解酰胺键活性的性质，以苯甲酰-L-精氨酰-对硝基苯胺（BAPA）作底物测定这个酶的动力学参数，反应式如下：反应最适pH8.1,最适温度25 0C。
反应产物之一：对硝基苯胺(p-Nitroaniline，4 -NA)呈黄色，对405nm波长光的摩尔吸光系数为9870，但底物BAPA和另一个产物BA对405nm波长的光基本不吸收，因此本实验测定光波的波长设在405nm上，把起始反应的吸光值调为0，记录消光值的变化。
L-BAPA最大浓度低于5104mol/L时这个酶促反应符合米氏方程，可用Hanes作图法求动力学参数。
Hanes作图法是单倒数作图法，把米氏方程变形为：在实验中设定一系列底物浓度[S i]，测定每一个底物浓度条件下的反应速度i,然后用[Si]/i 对[Si]作图，可以得到一条线段，线段在y轴的截距是K m/V max, 线段的延长线在x轴的截距是-Km，据此可以得到K m和V max值；cat=V max / [E t]。
[E t]是酶的初始浓度，已在实验设定为已知,因此cat可以得出；特异性常数Km/cat可根据上述已知数计算出来。
器材与试剂：器材：756紫外-可见分光光度计，恒温水浴锅，分析天平，秒表，容量瓶，移液器。
试剂：1．0.1mol/L pH8.1的Tris-HCI缓冲液（含0.4%CaCl2）：取0.2mol/L Tris（Mr=121.14）100mL与0.2mol/L HCI 52.4mL混匀，加入0.8gCaCl2,蒸馏水定容到200mL（pH值需用计pH校正）。
2．1mmol/L DL-BAPA（Mr=434.9）水溶液：称取43.49mg BAPA，蒸馏水溶解并加热到80 0C以上，完全溶解后置冰水中冷却，定容到100mL。
这个浓度为1mmol/L的DL-BAPA溶液命名为第六组母液，按照逐步稀释原则配制下列溶液浓度系列：0.8m mol/L （第五组母液，25mL）；0.6m mol/L （25mL，第四组母液）；0.4m mol/L （25mL，第三组母液）；0.2 m mol/L （10 mL，第二组母液）；0.1 m mol/L （10mL，第一组母液）。
3．60%（V/V）乙酸溶液4．胰蛋白酶溶液，该酶的比活 1.0104 BAEE 单位/mg蛋白实验步骤：1．计算胰蛋白酶加样体积：在本实验中加入胰蛋白酶的量是60g，实验1 已经测到胰蛋白酶的比活和浓度（g/L），根据这些值计算加入体系的酶液体积的L数。
2．实验溶液系统：本实验有6组实验组成。
实验顺序按照表2的加样程序执行。
表2. 测定K m和V max值加样表组BAPA母液浓度（m mol/L）加入BAPA母液（mL）加入Tris-HCI（mL）加入胰蛋白酶（L）加入60%乙酸（mL）反应体系底物BAPA浓度（m mol/L）A4051.0.1样品1,2.0对照1, 2.01.51.6n0.40.4[S1]0.0520.2样品2, 2.0对照2, 2.01.51.6n0.40.4[S2]0.130.4样品3, 2.0对照3, 2.01.51.6n0.40.4[S3] 0.240. 6样品4, 2.0对照4, 2.01.51.6n0.40.4[S4]0.350.8样品5, 2.0对照5, 2.01.51.6n0.40.4[S5]0.46 1 .0样品6, 2.0对照6, 2.01.51.6n0.40.4[S6]0.525 0C 保温5 min后，摇匀，秒表计时，准确反应2min后加入0.4mL 60%的乙酸溶液，摇匀终止反应。
反应溶液总量应达到4mL,不足部分可加蒸馏水补足。
对照试管不加入胰蛋白酶，只加入0.4mL 60%的乙酸溶液。
最后分别记录样品和对照的A405值，每组种两者的差值 A405 代入下式即可得到对应于[S i]的i表2列出的是6个实验，鉴于目前实验室尚没有12个枪头的加样，所以每一个实验都可独立进行。
[需要特别注意：1）比活大于1.0104 BAEE u/mg protein的胰蛋白酶制剂，纯度范围是90%-100%，一般可达到95%-97%。
在计算动力学参数时，如无特殊精确要求，可按照胰蛋白酶100%的近似值计算。
在本试验中，可根据浓度胰蛋白酶浓度10mg/ml，纯度100%, 每个试管要求加入质量数60g，计算出每个试管加入的胰蛋白酶溶液微升数。
2）在进行动力学参数计算时，要进行胰蛋白酶质量-摩尔数转换，如无特殊要求，也可以把胰蛋白酶纯度近似为100%.3）如果有求精确, 但产品说明没有给出胰蛋白酶在固形物中的百分含量，就需配制一定浓度的固形物溶液，首先测定蛋白质浓度，通过求算蛋白质总量，得到蛋白质在酶制剂中的重量比。
然后通过双向电泳，图像扫描，把扫描结果输入计算软件，按照软件步骤，求算胰蛋白酶在全部蛋白样品中的百分比。
把实验设定的每一个[Si]和测定到的对应的Vi换算成[Si/Vi]后,填入表3，作图求Km，Vmax表3. Hanes 作图的数据[ Si]/ I : [S1]/ 1 [S2]/ 2 [S3]/ 3 [S4]/ 4 [S5]/ 5 [S6]/ 6[Si] : [S1][S2][S3] [S4][S5][S6]用[S]/对[S]作图可得到一条线段，线段与轴的截距是Km/Vmax，线段延长线与x轴的截距是-Km,根据方程可以得到Km,Vmax根据cat=V max/[E t]，求算cat 和K m/cat注意：上式的酶浓度单位是mol/L，已知酶浓度是10mg/ml,需要根据胰蛋白酶相对分子量23,7 KD ，纯度100%进行换算。
实验完成后报告胰蛋白酶的动力参数：K m, V max，cat, K m/cat如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合！。