实验十猪胰蛋白酶的纯化及其活性测定
胰蛋白酶或抑制剂分离、纯化综合分析
实验胰蛋白酶或抑制剂分离、纯化在动物胰脏中，胰蛋白酶是以无活性的酶原状态存在的。
在生理条件下，胰蛋白酶原随胰液分泌至十二指肠后，在小肠上腔有Ca2+的环境中，为肠激酶或胰蛋白酶所激活，其肽链N -端的赖氨酸与异亮氨酸之间的一个肽键被水解，失去一个酸性6肽，其分子构象发生一定的改变后转变为具有催化蛋白质水解活性的胰蛋白酶。
胰蛋白酶原分子量约为24 000，其等电点为pH8.9；胰蛋白酶的分子量约为23 400，其等电点为pH 10.8。
胰蛋白酶在pH3.0时最稳定，其浓溶液可贮存于冰箱（0℃以下）数周而活性无显著丧失。
pH＜3时，胰蛋白酶易变性。
PH＞５时，胰蛋白酶易自溶。
胰蛋白酶催化活性的最适pH为7.6～7.8。
重金属离子、有机磷化合物和反应产物都能抑制胰蛋白酶的活性。
胰脏、卵清和大豆中也含有一些蛋白质对胰蛋白酶活性具有抑制作用。
实验（一）胰蛋白酶活性测定[原理]胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸（如精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的肽键具有高度的专一性。
此外，胰蛋白酶也能催化由碱性氨基酸的羧基所形成的酰胺键和酯键，有高度的专一性仍表现为对碱性氨基酸羧基一侧的选择对此等化学键的催化水解活性的敏感度为：酯键＞酰胺键＞肽键。
因此，可以利用含有这些化学键中任一种键型的底物来研究胰蛋白酶的专一催化活性。
本实验方法一采用N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯[（BAEE），N-benzoyl-L-arginine ethyl ester]作为底物，水解反应如下：N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）在波长253nm下的紫外光吸收远远弱于N-苯甲酰-L-精氨酸[（BA），benzoyl-L-arginine]的紫外光吸收。
在胰蛋白酶的催化下，BAEE随着酯键的水解，水解产物BA逐渐增多，反应体系的紫外光吸收亦随之相应增加，以△A253nm计算胰蛋白酶的活性。
胰蛋白酶的BAEE单位定义为：以BAEE为底物，在一定反应条件下，每分钟使△A253nm 增加0.001的酶量为一个BAEE单位。
胃蛋白酶
计、凝
胶成像仪、核酸蛋白质分析仪。
四、实验方法
1
．猪胰蛋白酶的分离纯化
（
1
）粗猪胰蛋白酶的提取
取猪胰脏，除去脂肪和结缔组织，切碎，称重约
50g
加入
5
倍体积预冷的
pH2.5
乙酸酸化水
用组织捣碎机捣碎
离心
10000 rpm
，
15 min
用
4
层纱布过滤得上清液（
收集约
1.5 mL
，作为留样
1
，测蛋白含量，及时
SDS
化）
将研细的固体无水氯化钙慢慢加入酶原溶液中，
边加边搅拌均匀，
使溶液中最终
含有
0.1 mol/L CaCl
2
加入极少量猪胰蛋白酶（约
2-5mg
），轻轻搅拌均匀
用
5 mol/L NaOH
调
pH
为
8.0
于
25
℃下活化
4~6
小时（
2
小时取样一次），测定酶活性增加的情况
4
活化完成后，用
2.5 mol/L H
3
C
6
H
5
O
7
·
2
H
2
O/L
）混匀，
用酸度计检查
pH
值是否为
6.0
。
（
10
）
8
％三氯乙酸
（
11
）
10 mg/mL
酪蛋白溶液：
取酪蛋白
1g
，
加
11
M
Tris
－
HCl
缓冲液，
pH8.0
40
mL
胰蛋白酶抑制剂的分离纯化和活性测定
胰蛋白酶抑制剂的分离纯化和活性测定
五、结果与分析
说明现象 解释原因
胰蛋白酶抑制剂的分离纯化和活性测定
六、讨论与心得
试分析实验过程中影响胰蛋白酶抑制剂分 离提纯效果的因素有哪些？ 实验心得及改进意见。
胰蛋白酶抑制剂的分离纯化和活性测定
胰蛋白酶抑制剂的分离纯化和活性测定
三、试剂与仪器
（二）材料与器材
❖ 新鲜材料 ❖ 绞碎机 ❖ 纱布 ❖ 台式高速冷冻离心机 ❖ 微量移液器 ❖ pH值试纸 ❖ 恒温水浴锅 ❖ 电子天平 ❖ 玻璃试管、烧杯、量筒 ❖ 离心管
胰蛋白酶抑制剂的分离纯化和活性测定
四、实验方法
（一）胰蛋白酶抑制剂的提取和纯化
一、实验目的
（1）了解胰蛋白酶抑制剂的制备方 法； （2）了解胰蛋白酶抑制剂抑制活性 测定的原理和方法； （3）掌握离心机和微量移液器的使 用方法。
胰蛋白酶抑制剂的分离纯化和活性测定
二、实验原理
胰蛋白酶抑制剂是对胰蛋白酶有抑制活性的蛋白 质。
利用蛋白质可溶于水或提取液中的性质，可用水 或提取液从富含胰蛋白酶抑制剂的材料中抽提胰 蛋白酶抑制剂，利用盐析使胰蛋白酶抑制剂沉淀 出来，得到含有胰蛋白酶抑制剂的蛋白质制品。
本实验以大豆为主要原料，制备胰蛋白酶抑制剂， 并测定其抑制活性。
胰蛋白酶抑制剂的分离纯化和活制剂的分离纯化和活性测定
p-NA
三、试剂与仪器
（一）试剂
0.2 mol/L Na2HPO4，0.2mol/L NaH 2P04。 0.8mol/L磷酸缓冲液；36mL 0.2mol/LNa2HP04与14mL
在制备过程中通过测定对胰蛋白酶的抑制活性进 行跟踪检测。
胰蛋白酶抑制剂的分离纯化和活性测定
亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介
亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介
第1页
1 内容摘要 亲和层析包含了一整套复杂底物及其配体与生物大分
子之间相互作用时所形成独特生物学特征。在亲和结合过 程中包括到疏水力、静电力、范德华力及空间阻力等原因 影响。
亲和层析概念能够了解为配基以共价键形式与水不溶 性固体载体共价结合， 形成含有高度专一性亲和吸附剂。 以该介质为填料填充亲和层析柱，从复杂混合物中有针对 性分离某一个成份。
亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介
第4页
1. 3试验流程
鸡蛋清
Spharose 4B
猪胰脏
↓
↓
↓
提取
↓ 分离纯化
活化 ↓
提取 ↓
↓ 纯卵粘蛋白(CHOM) →←活化Spharose 4B 胰蛋白酶原粗提液
↓ 偶联
↓ 激活
↓
↓
CHOM-Spharose 4B →← 胰蛋白酶提取液
↓ 亲和层析
亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介
第2页
本试验以亲和层析方法分离纯化猪胰蛋白酶为目标，
从猪胰脏提取液中分离纯化胰蛋白酶，最终得到纯度较高
胰蛋白酶。围绕亲和层析试验所包括蛋白质和酶基础性质
及相关技术进行综合训练。其中主要包含亲和层析介质配
基制备，亲和介质合成，蛋白质和酶分离纯化，酶活性测
定等内容。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
经过综合训练，能够系统掌握蛋白质制备基础原理和
操作，学习怎样进行试验设计，掌握试验过程中关键步骤，
对试验中出现问题进行科学分析。使学生在学习试验技术
同时，自觉培养分析问题和处理问题能力。
亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介
实验十猪胰蛋白酶的纯化及其活性测定
实验十猪胰蛋白酶的纯化及其活性测定一、实验目的1. 学习胰蛋白酶的纯化及其结晶的基本方法。
2. 学习用紫外法测定酶活性，搞清酶活性与比活性的概念。
二、实验原理胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物胰脏中，在Ca2+的存在下，被肠激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活，从肽链N端赖氨酸和异亮氨酸残基之间的肽键断开，失去一段六肽，分子构象发生一定改变后转变为有活性的胰蛋白酶。
胰蛋白酶原的分子量约为24000，其等电点约为pH8.9，胰蛋白酶的分子量与其酶原接近（23300），其等电点约为pH10.8，最适pH7.6～8.0，在pH=3时最稳定，低于此pH时，胰蛋白酶易变性，在pH>5时易自溶。
Ca2+离子对胰蛋白酶有稳定作用。
重金属离子，有机磷化合物和反应物都能抑制胰蛋白酶的活性，胰脏、卵清和豆类植物的种子中都存在着蛋白酶抑制剂。
最近发现在一些植物的块基（如土豆、白薯、芋头等）中也存在有胰蛋白酶抑制剂。
胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的键具有高度的专一性。
此外还能催化由碱性氨基酸和羧基形成的酰胺键或酯键，其高度专一性仍表现为对碱性氨基酸一端的选择。
胰蛋白酶对这些键的敏感性次序为：酯键> 酰胺键> 肽键。
因此可利用含有这些键的酰胺或酯类化合物作为底物来测定胰蛋白酶的活力。
目前常用苯甲酰-L-精氨酸-对硝基苯胺（简称BAPA）和苯甲酰-L-精氨酸-β-萘酰胺（简称BANA）测定酰胺酶活力。
用苯甲酰-L-精氨酸乙酯（简称BAEE）和对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯（简称TAME）测定酯酶活力。
本实验以BAEE为底物，排毒养颜胶囊用紫外吸收法测定胰蛋白酶活力。
酶活力单位的规定常因底物及测定方法而异。
从动物胰脏中提取胰蛋白酶时，一般是用稀酸溶液将胰腺细胞中含有的酶原提取出来，然后再根据等电点沉淀的原理，调节pH以沉淀除去大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量糜蛋白酶原和弹性蛋白酶原）沉淀析出。
鸡卵粘蛋白的提取及猪胰蛋白酶的分离纯化
鸡卵粘蛋⽩的提取及猪胰蛋⽩酶的分离纯化鸡卵粘蛋⽩的提取及猪胰蛋⽩酶的分离纯化摘要：鸡卵类粘蛋⽩是由鸡卵清中制得的⼀种糖蛋⽩，具有强烈的抑制胰蛋⽩酶的作⽤，常⽤于胰蛋⽩酶的酶学性质的研究和胰蛋⽩酶的亲和层析纯化制备。
胰蛋⽩酶Trypsin (Parenzyme) 为蛋⽩酶的⼀种，EC3.4.21.4。
在脊椎动物中，作为消化酶⽽起作⽤，⽽且还能限制分解糜蛋⽩酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作⽤。
本实验以鸡蛋清为原料，提取猪胰蛋⽩酶的天然抑制剂鸡卵粘蛋⽩，并以此为配基，偶联到琼脂糖凝胶上，制成鸡卵粘蛋⽩的亲和吸附剂，然后通过亲和层析直接从猪胰脏的粗提液中纯化猪胰蛋⽩酶。
并设计了酶活性测定以对纯化过程进⾏监测和对纯化效果进⾏评价；设计了电泳实验对制备的猪胰蛋⽩酶进⾏纯度和分⼦量的测定。
关键词：鸡卵粘蛋⽩；胰蛋⽩酶；亲和层析；分离纯化；酶活性。
鸡卵粘蛋⽩（chicken ovomucoid简称CHOM）是鸡蛋清中的⼀种糖蛋⽩，⾄今还未能获得单⼀组分，在电泳⾏为上常呈现不均⼀性。
不同来源的卵类蛋⽩末端基有很⼤差别，鸡卵类蛋⽩N-末端基为丙氨酸。
卵类粘蛋⽩在中性活酸性溶液中对热和⾼浓度的脲是相当稳定的，⽽在碱性溶液中⽐较不稳定，尤其温度较⾼是易迅速失活，在50%丙酮或10%三氯⼄酸溶液中仍有较好的溶解度。
它们的等电点有⼀定的范围，⼤致在3.9—4.5之间。
鸡卵粘蛋⽩除对⽜和猪的胰蛋⽩酶有强烈的抑制作⽤外，对枯草杆菌蛋⽩酶也有⼀定的抑制作⽤，但对胰凝乳蛋⽩酶⽆抑制作⽤，对⼈的胰蛋⽩酶也⽆明显抑制作⽤，因此常⽤于胰蛋⽩酶酶学性质的研究。
在pH7.8～8.0碱性条件下，CHOM可可逆性的结合胰蛋⽩酶，以CHOM为配基制成亲和吸附剂，通过亲和层析技术对胰蛋⽩酶进⾏分离纯化。
1材料与⽅法1.1材料与试剂市售鲜鸡蛋，10%TCA，1mol/L NaOH ，5mol/L NaOH ，1mol/L HCl，5mol/L HCl，丙酮（A.R），葡聚糖凝胶G-25（SephadexG-25)，0.02mol/L, pH6.5磷酸缓冲液，DEAE-52离⼦交换纤维素，离⼦交换剂（0.5mol/L HCl ，0.5mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl ），洗脱液（0.3mol/L NaCl—0.02mol/L, pH6.5磷酸缓冲液）,透析袋（φ2.7cm）,标准胰蛋⽩酶溶液（1mg/ml），0.05mol/L PH7. 8 Tris- HCl缓冲液，BAEE底物缓冲溶液（0.05mol/L CaCl2- 0.05mol/L PH8.0 Tris- HCl缓冲液），1mmol/L BAEE底物溶液，Sepharose 4B，0.5mol/L NaCl，2mol/L NaOH，0.2mol/L PH9.5碳酸钠缓冲液，56%1，4-⼆氧六环（V/V），环氧氯丙烷（A.R），亲和柱平衡液（0.5mol/L KCl，0.05mol/L CaCl2—0.1mol/L, Tris—HCl PH7.8缓冲液），亲和柱洗脱液（0.5mol/L KCl—0.1mol/L PH2.5甲酸溶液），，⽆⽔氯化钙，亲和柱平衡液新鲜猪胰脏，PH2.5-3.0⼄酸酸化⽔，2.5mol/L H2S04（ 0.5mol/L KCl，0.05mol/L CaCl2—0.1mol/L, Tris—HCl PH7.8缓冲液），亲和柱洗脱液：（0.5mol/L KCl— 0.1mol/LPH2.5甲酸溶液）等。
实训 亲和色谱纯化胰蛋白酶
实训亲和色谱纯化胰蛋白酶［任务描述］亲和色谱主要是根据生物分子与其特定的固相化的配基或配体之间具有一定的亲和力而使生物分子得以分离。
鸡卵粘蛋白是专一性较高的胰蛋白酶抑制剂，对牛和猪的胰蛋白酶有相当强的抑制作用，在pH7.0～8.0的缓冲溶液中卵粘蛋白与胰蛋白酶牢固地结合，而在pH2.0～3.0时，又能被解离下来。
因此，采用鸡卵粘蛋白作成的亲和吸附剂可以从胰脏粗提液中通过一次亲和色谱直接获得活力大于10000BAEE单位/毫克蛋白胰蛋白酶制品，比用经典分离纯化方法简便得多，纯化效率可达到10～20倍以上。
本次实训任务为纯化胰蛋白酶，采用胰蛋白酶的天然抑制剂-鸡卵粘蛋白作为配基制成亲和吸附剂，从胰脏粗提取液中纯化胰蛋白酶。
［任务实施］一、准备工作1.建立工作小组，制定工作计划，确定具体任务，任务分工到个人，并记录到工作表。
2.收集亲和色谱纯化胰蛋白酶工作中必须信息，掌握相关知识及操作要点，与指导教师共同确定出一种最佳的工作方案。
3.完成任务单中实际操作前的各项准备工作。
（1）材料准备鸡蛋清，新鲜猪胰脏。
（2）试剂与仪器试剂：丙酮、三氯乙酸、HCl、NaOH、NaCl、NaHCO3、Na2CO3、氯代环氧丙烷、乙腈、甲酸、Tris、CaCl2、KCl、DEAE-纤维素、Sepharose-4B、乙酸二氧六环二甲基亚砜。
主要贮存溶液：①鸡卵粘蛋白色谱液（1L）。
0.02mol/L pH7.3 Tris-HCl缓冲液。
②DEAE-纤维素处理液。
0.5mol/L HCl 300mL和0.5mol/L NaOH、0.5mol/L NaCl 各300mL。
③卵粘蛋白洗脱液。
0.02mol/L pH7.3 Tris-HCl缓冲液含0.3mol/L NaCl，150mL。
④标准胰蛋白酶溶液。
结晶胰蛋白酶以0.001mol/L HCl 配制成1mg/mL 。
⑤亲和色谱柱平衡液。
含0.5mol/LKCl 、0.05mol/L CaCl 2的0.1mol/L pH8.0 Tris-HCl 缓冲液500mL （配1000mL ：12.1g Tris ，37.5g KCl ，5.6g CaCl 2）。
生化实验报告 胰蛋白酶活力测定
胰蛋白酶活力测定一、实验原理1、福林—酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸，在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原为蓝色化合物（钨蓝和钼蓝）。
2、蛋白质中含具酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），用胰蛋白酶水解蛋白底物，生成含酚基的氨基酸与福林—酚试剂反应，生成蓝色化合物，在一定的范围内，蓝色化合物颜色的深浅与酶活力的大小成正比。
二、实验仪器1、试管2、7220分光光度计3、恒温水浴锅三、实验试剂1、福林试剂B：见福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度部分(冰箱中)2、0.55mol/L碳酸钠溶液：58.3g无水碳酸钠溶于蒸馏水，稀释并定容至1000ml3、10%三氯乙酸溶液4、0. 2mol/L磷酸缓冲液(pH7.5)：5、0.5% 酪素溶液：称取0.5g酪素，以0.5mol/L氢氧化钠1ml湿润，再加少量0. 2mol/L磷酸缓冲液稀释。
在水浴中煮沸溶解，冷却，稀释并容至100ml，冷藏在(冰箱)里。
6、500ug/L酪氨酸溶液7、胰蛋白酶溶液(冰箱中)四、实验步骤1、标准曲线的制作：按下表加入试剂：各管中加0.5%酪素2ml，于37℃水浴中反应15分钟，然后加入10%三氯乙酸3ml，过滤除去沉淀，取清液1ml，加入0.55mol/L碳酸钠5ml，再加入福林试剂1ml，于37 ℃水浴中显色15分钟，测OD680。
以光密度为纵坐标，酪氨酸的微克数为横坐标绘制标准曲线。
样品中含酶活力单位=A/15 ╳FA—样品测定光密度查曲线得相当酪氨酸ug数F—酶液稀释倍数由上可知，样品的吸光度y=0.993，则x=0.8μg，即A=0.8μg 故根据公式样品中含酶活力单位=A/15 ╳FA—样品测定光密度查曲线得相当酪氨酸ug数F—酶液稀释倍数胰蛋白酶活力为：0.8 /15 ╳13=0.69六、实验分析1. 测定胰蛋白酶活力的原理?答：蛋白质中含具酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），用胰蛋白酶水解蛋白底物，生成含酚基的氨基酸与福林—酚试剂反应，生成蓝色化合物，在一定的范围内，蓝色化合物颜色的深浅与酶活力的大小成正比。
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实验十猪胰蛋白酶的纯化及其活性测定
一、实验目的
1. 学习胰蛋白酶的纯化及其结晶的基本方法。
2. 学习用紫外法测定酶活性，搞清酶活性与比活性的概念。
二、实验原理
胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物胰脏中，在Ca2+的存在下，被肠激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活，从肽链N端赖氨酸和异亮氨酸残基之间的肽键断开，失去一段六肽，分子构象发生一定改变后转变为有活性的胰蛋白酶。
胰蛋白酶原的分子量约为24000，其等电点约为pH8.9，胰蛋白酶的分子量与其酶原接近（23300），其等电点约为pH10.8，最适pH7.6～8.0，在pH=3时最稳定，低于此pH时，胰蛋白酶易变性，在pH>5时易自溶。
Ca2+离子对胰蛋白酶有稳定作用。
重金属离子，有机磷化合物和反应物都能抑制胰蛋白酶的活性，胰脏、卵清和豆类植物的种子中都存在着蛋白酶抑制剂。
最近发现在一些植物的块基（如土豆、白薯、芋头等）中也存在有胰蛋白酶抑制剂。
胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的键具有高度的专一性。
此外还能催化由碱性氨基酸和羧基形成的酰胺键或酯键，其高度专一性仍表现为对碱性氨基酸一端的选择。
胰蛋白酶对这些键的敏感性次序为：酯键> 酰胺键> 肽键。
因此可利用含有这些键的酰胺或酯类化合物作为底物来测定胰蛋白酶的活力。
目前常用苯甲酰-L-精氨酸-对硝基苯胺（简称BAPA）和苯甲酰-L-精氨酸-β-萘酰胺（简称BANA）测定酰胺酶活力。
用苯甲酰-L-精氨酸乙酯（简称BAEE）和对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯（简称TAME）测定酯酶活力。
本实验以BAEE为底物，排毒养颜胶囊用紫外吸收法测定胰蛋白酶活力。
酶活力单位的规定常因底物及测定方法而异。
从动物胰脏中提取胰蛋白酶时，一般是用稀酸溶液将胰腺细胞中含有的酶原提取出来，然后再根据等电点沉淀的原理，调节pH以沉淀除去大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量糜蛋白酶原和弹性蛋白酶原）沉淀析出。
经溶解后，以极少量活性胰蛋白酶激活，使其酶原转变为有活性的胰蛋白酶（糜蛋白酶和弹性蛋白酶同时也被激活），被激活的酶溶液再以盐析分级的方法除去糜蛋白酶及弹性蛋白酶等组分。
收集含胰蛋白酶的级分，并用结晶法进一步分离纯化。
一般经过2～3次结晶后，可获得相当纯的胰蛋白酶，其比活力可达到
8000～10000BAEE单位/毫克蛋白，或更高。
如需制备更纯的制剂，可用上述酶溶液通过亲和层析方法纯化。
三、器材与试剂
（一）器材
1. 新鲜或冰冻猪胰脏
2. 食品加工机和高速分散器
244
3. 研钵
4. 大玻璃漏斗
5. 小塑料桶
6. 布氏漏斗
7. 抽滤瓶
8. 纱布
9. 恒温岳阳家政水浴
10. 紫外分光光度计
11. 秒表
12. pH试纸
（二）试剂
1. pH4～4.5乙酸酸化水
2. 2.5M H2SO4
3. 5M NaOH
4. 硫酸铵
5. 氯化钙
6. 2M NaOH
7. 0.8M，pH9.0硼酸缓冲液：取20ml 0.8M硼酸溶液，加80ml 0.2M四硼酸钠溶液，混合后，用pH计检查校正。
8. 0.4M pH9.0硼酸缓冲液（用“7”稀释1倍即可）
9. 0.2M pH8.0硼酸缓冲液：取70ml 0.2M硼酸溶液，加30ml 0.5M四硼酸钠溶液，混合后，用pH计校正。
10. 2M HCl
11. 0.01M HCl
12. BAEE－0.15M pH8.0Tris－HCl 缓冲液（每毫升Tris缓冲液含0.11毫克BAEE 和2.22毫克的氯化钙）
四、实验步骤
1. 猪胰蛋白酶结晶步骤
猪胰脏1.0公斤（新鲜的或杀后立即冷藏的），除去脂肪和结缔组织后，绞碎，加入2倍体积予冷的乙酸酸化水（pH4.0～4.5）于10～15℃搅拌提取24小时，四层纱布过滤得乳白色滤液，用2.5M H2SO4调pH至2.5～3.0，放置3～4小时后用折迭滤纸过滤得黄色透明滤液（约1.5升），加入固体硫酸铵（予先研细），使溶液达0.75饱和度（每升滤液加492克）放置过夜后抽滤（挤压干），滤饼分次加入10倍体积（按饼重计）冷的蒸馏水，使滤饼溶解，痔疮偏方得胰蛋白酶原溶液，取样0.5ml后进行活化：慢慢加入研细的固体无水氯化钙（滤饼中硫酸铵的含量按饼重的四分之一计）使Ca2+与SO42-结合后，溶液中仍含有0.1M CaCl2，边加边搅拌，用5M NaOH调pH至8.0，加入极少量猪胰蛋白酶轻轻搅拌，于室温下活化8～10小时，（2～3小时取样一次，并用0.001M HCl稀释），测定酶活性增加的情况。
活化完成（比活约3500～4000BAEE单位）后，用2.5M H2SO4调pH至2.5～3.0，抽滤除去CaSO4沉淀，弃去滤饼，滤液取样测定胰蛋
245
白酶活性及蛋白质含量，按242克/升加入细粉状固体硫酸铵，使溶液达到0.4饱和度，放置数小时后，抽滤，弃去滤饼，滤液按250克/升加入研细的硫酸铵，使溶液饱度达到0.75，
放置数小时，抽滤，弃去滤液，滤饼（粗胰蛋白酶）溶解后进行结晶：按每克滤饼溶于1.0ml pH9.0 的0.4M硼酸缓冲液的量计加入缓冲液，小心搅拌溶解，取样后，用2M NaOH调pH至8.0，注意要小心调节，偏酸不易结晶，偏碱易失活，存放于冰箱。
放置数小时后，应出现大量絮状物，溶液逐渐变稠呈胶态，再加入总体积的1/4～1/5的pH8.0的0.2M硼酸缓冲液，使胶态分散，必要时加入少许胰蛋白酶晶体。
放置2～5天可得到大量胰蛋白酶结晶，每天观察，核对pH是否为8.0并及时调整。
用显微镜观察，待结晶析出完全时，抽滤，母液回收，一次结晶的胰蛋白酶产物再进行重结晶：用约1倍的0.025M HCl，使上述结晶分散，加入约1.0～1.5倍体积的pH9.0 的0.8M硼酸缓冲液，至结晶酶全部溶解，取样后，用2M NaOH调溶液pH至8.0（准确）（体积过大，很难结晶）怎么减肚子，冰箱放置1～2天，可将大量结晶抽滤得第二次结晶产物(母液回收)，冰冻干燥后得重结晶的猪胰蛋白酶。
2. 胰蛋白酶活性的测定
⑴紫外法测定酶溶液的蛋白质含量
在280nm测得蛋白质溶液的吸光度，除以该蛋白质的比消光系数，即可算出该蛋白质溶液的浓度（mg/ml）。
少量氯化钠、硫酸铵、磷酸盐、硼酸盐和Tris等无明显干扰作用。
紫外法操作简便、快速，适合于制备过程中进行监测。
测定时将待测酶液用0.001M HCl稀至适当浓度，以0.001M HCl作对照。
猪胰蛋白酶在280nm的比消光系数为：E1%1cm=13.5 ，所以当其浓度为1mg/ml时，消光系数应为1.35。
胰蛋白酶的蛋白含量(mg/ml)＝A280×稀释倍数/1.35
⑵胰蛋白酶活力的测定（BAEE法）：参见亲和层析实验。
五、注意事项
1. 胰脏必需是刚屠宰的新鲜组织或立即低温存放的，否则可能因组织自溶而导致实验失败。
2. 在室温14～20℃条件下8～12小时可激活完全，激活时间过长，因酶本身自溶而会使比活降低，比活性达到“3000～4000BAEE单位/mg蛋白”时即可停止激活。
3. 要想获得胰蛋白酶结晶，在进行结晶时应十分细心地按规定条件操作，切勿粗心大意，前几步的分离纯化效果愈好，则培养结晶也较容易，因此每一步操作都要严格。
酶蛋白溶液过稀难形成结晶毛孔大怎么办，过浓则易形成无定形沉淀析出，因此，必需恰到好处，一般来说待结晶的溶液开始时应略呈微浑浊状态。
4. 过酸或过碱都会影响结晶的形成及酶活力变化，必须严格控制PH。
5. 第一次结晶时，3～5天后仍然无结晶，应检查pH，必要时调整pH或接种，促使结晶形成。
重结晶时间要短些。
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