碱性磷酸酶的活力测定(修改版)汇总.
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碱性磷酸酶活性测定
碱性磷酸酶活性测定磷酸酶磷酸酶能酶促有机磷化合物的水解。
试验表明，土壤微生物对于土壤含磷有机物的矿化起着主要的作用；某些高等植物的根系也有磷酸酶活性。
土壤的磷酸酶活性可以表征土壤的肥力状况（特别是磷的状况）。
基本原理：土壤磷酸酶活性的测定常用各种磷酸酯作为基质。
应用得最多的是酚酞磷酸酯、苯磷酸酯、甘油磷酸酯、ɑ-或ß-萘磷酸酯和p-硝基苯磷酸酯等的水溶性钠盐。
当它们被酶促水解时，能析出无机磷和基质的有机基团。
因此磷酸酶活性的测定时测定基质水解后的无机磷或酚的部分。
这里介绍的方法是测定基质水解时生成的酚量。
该法可用于测定各种磷酸酶的活性：碱性磷酸酶（用PH10的硼酸盐缓冲液），中性磷酸酶（用PH7.0的柠檬酸盐缓冲液），酸性磷酸酶（用PH5.0的乙酸盐缓冲液）试剂配制：1）甲苯2）0.5% 磷酸苯二钠3）硼酸盐缓冲液（PH9.6与PH10.0）：称取12.404g硼酸（H3BO3）溶于700ml 去离子水，用稀NaOH溶液调节至PH10.0，用去离子水稀释至1000ml4) 氯代二溴对苯醌亚胺试剂：取0.125g 2,6-二溴苯醌氯酰亚胺，用10ml 96%的乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。
保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用。
5）标准溶液：（a）母液：1g酚溶于蒸馏水中，并稀释至1000ml，溶液保存在暗色瓶中；（b）工作液：10ml溶液（a）稀释至1000ml（1ml含10ug酚）6）0.3%硫酸铝溶液标准曲线绘制：取0，1，3，5，7，9，11和13ml酚工作液（b），置于50ml容量瓶中，每瓶加入5ml缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，30min后比色测定。
以光密度为纵坐标，浓度为横坐标绘成标准曲线。
操作步骤：1）取5g风干土置于200ml三角瓶中，用2.5ml甲苯处理2）处理15min后，加入20ml 0.5%磷酸苯二钠3）将反应混合物置于37℃恒温箱中，培养24h后，在培养液中加100ml 0.3%硫酸铝溶液用致密滤纸过滤。
血清碱性磷酸酶活力测定
实验操作
1.取试管4支，按下表操作
测定管 血清（ml） 酚标准液 蒸馏水 pH10碳酸盐缓冲液 0.100 —— —— 1.00 标准管 —— 0.100 —— 1.00 空白管 —— —— 0.100 1.00 对照管 —— —— —— 1.00
混匀，37℃水浴保温5min，同时将底物预热
底物液
1.00
1.00
1.00
1.00
混匀，37℃水浴保护15min 铁氰化钾溶液 血清 3.00 —— 3.00 ——— 3.00 —— 3.00 0.100
2.立即混匀。在510nm波长处比色，以蒸馏水调零点，读取各 管吸光度。
计算 ALP活性=（A测定—A ）/（A —A ） *0.05*100(金氏单位）
酶的比活力：单位质量酶蛋白或单位体积酶制剂所含有酶 活力单位数，即酶活力浓度。 酶活力的测定方法 1.终止测定法（定时法或终点法） 2.动力学分析法（连续监测法或速率法）
实验目的
熟悉酶活性测定方法的一般原理 掌握血清ALP测定原理与临床意义
实验原理
碱性磷酸酶在碱性环境中作用于磷酸苯二钠，使 之水解生成酚和磷酸。酚在碱性溶液中与4-氨基 安替比林作用，经铁氰化钾氧化形成红色醌类化 合物，其颜色深浅与ALP活性成正比。
磷酸苯二钠+H2O
ALP 苯酚+磷酸氢二钠 pH=10 铁氰化钾
苯酚+4-氨基安替比林红色醌亚胺衍生物源自实验器材和试剂：
（一）器材： 5ml移液管，1ml移液管，100或200ul微量可调式移液器， 721E分光光度计，1cm比色皿，37℃ 恒温水浴 （二）试剂： 1．0.1mol/L碳酸盐缓冲液(pH10.0) 称取无水碳酸钠 6.36g，碳酸氢钠3.36g，4-氨基安替比林1.5g，溶于 800mL蒸馏水中，定容至1L。置棕色瓶中保存。 2．20mmol/L磷酸苯二钠溶液 先将500ml蒸馏水煮 沸，迅速加入磷酸苯二钠2.18g(磷酸苯二钠如含2分子结 晶水，则应称取2.54g) ，冷却后加氯仿2ml防腐，在4℃ 冰箱保存。（用剩的溶液不应再倒回瓶中） 3．铁氰化钾的硼酸溶液 称取铁氰化钾2.5g，硼酸17g， 各自溶于蒸馏水400ml中，两液混合后，加蒸馏水至1L， 置棕色瓶中避光保存(如出现蓝绿色即弃去)。 4．酚标准工作液（0. 05mg/ml）：购买合格的二级 标准品。
血清碱性磷酸酶活力测定
实验目的
熟悉酶活性测定方法的一般原理 掌握血清ALP测定原理与临床意义 掌握血清ALP测定原理与临床意义
实验原理
碱性磷酸酶在碱性环境中作用于磷酸苯二钠，使 之水解生成酚和磷酸。酚在碱性溶液中与4 之水解生成酚和磷酸。酚在碱性溶液中与4-氨基 安替比林作用，经铁氰化钾氧化形成红色醌类化 ALP 合物，其颜色深浅与ALP活性成正比。 合物，其颜色深浅与ALP活性成正比。
混匀，37℃水浴保温5min，同时将底物预热 混匀，37℃水浴保温5min，同时将底物预热 底物液 1.00 1.00 1.00 1.00
混匀，37℃水浴保护15min 混匀，37℃水浴保护15min 铁氰化钾溶液 血清 3.00 —— 3.00 ——— 3.00 —— 3.00 0.100
2.立即混匀。在510nm波长处比色，以蒸馏水调零点，读取各 管吸光度。
磷酸苯二钠+H 磷酸苯二钠+H2O
ALP 苯酚+ 苯酚+磷酸氢二钠 pH=10 铁氰化钾
苯酚+4苯酚+4-氨基替比林
红色醌亚胺衍生物
实验器材和试剂：
（一）器材： 5ml移液管，1ml移液管，100或200ul微量可调式移液器， 5ml移液管，1ml移液管，100或200ul微量可调式移液器， 721E分光光度计，1cm比色皿，37℃ 721E分光光度计，1cm比色皿，37℃ 恒温水浴 （二）试剂： 1．0.1mol/L碳酸盐缓冲液(pH10.0) 称取无水碳酸钠 0.1mol/L碳酸盐缓冲液 碳酸盐缓冲液(pH10.0) 6.36g，碳酸氢钠3.36g， 氨基安替比林1.5g，溶于 6.36g，碳酸氢钠3.36g，4-氨基安替比林1.5g，溶于 800mL蒸馏水中，定容至 800mL蒸馏水中，定容至1L。置棕色瓶中保存。 2．20mmol/L磷酸苯二钠溶液 先将500ml蒸馏水煮 20mmol/L磷酸苯二钠溶液 先将500ml蒸馏水煮 沸，迅速加入磷酸苯二钠2.18g(磷酸苯二钠如含2 沸，迅速加入磷酸苯二钠2.18g(磷酸苯二钠如含2分子结 晶水，则应称取2.54g) ，冷却后加氯仿2ml防腐，在4 晶水，则应称取2.54g) ，冷却后加氯仿2ml防腐，在4℃ 冰箱保存。（用剩的溶液不应再倒回瓶中） 3．铁氰化钾的硼酸溶液 称取铁氰化钾2.5g，硼酸17g， 称取铁氰化钾2.5g，硼酸17g， 各自溶于蒸馏水400ml中，两液混合后，加蒸馏水至1 各自溶于蒸馏水400ml中，两液混合后，加蒸馏水至1L， 置棕色瓶中避光保存(如出现蓝绿色即弃去) 置棕色瓶中避光保存(如出现蓝绿色即弃去)。 4．酚标准工作液（0. 05mg/ml）：购买合格的二级 酚标准工作液（ 05mg/ml）： ）：购买合格的二级 标准品。
8碱性磷酸酶比活力测定
（3）消得：K = E1cm1% 或１克分子浓度，１cm厚度溶液中测得：K = ξ C = D/E1cm%, 或 C = D/ξ
常用于紫外吸收法测定蛋白质，核酸含量，二者分 别在280nm和260nm处有最大吸收，其消光系数 可查到，在同样条件下，测定待测溶液的光密度, 带入上式即可求得C。
酶液（mL）
0.1 mol/L NaOH (mL) 酶液（mL） OD 405 nm
各管加入1.0 mL
各管加入0.2 mL
各0.50mL
混匀，37℃，5分钟
/
各0.1mL
37℃，精确反应10分钟
各管加入2.0 mL
0.1mL
蛋白浓度测定
1. 测定100 μg/mL牛血清白蛋白溶液的OD值； 2. 将稀释后的样品在280nm下测定吸光度； 3. 以洗脱液作空白。
蛋白浓度测定前处理
1、2号样品稀释100倍（用洗脱液稀释） 3号样品稀释20倍（用洗脱液稀释） 4号样品对倍稀释（用洗脱液稀释）
12支试管，1-4做两组平行测定管，01-04作为空白对照
管号 5 mM pNPP(mL)
空白（01-04） 1-1 2-2 各0.2mL
3-3 4-4
Na2CO3-NaHCO3 (mL) 20 mmol/L MgCl2 (mL) H2O (mL)
（二）、酶活力
在37C下，以5mmol/L pNPP为底物，在pH 10.1的
碳酸盐缓冲液含2 mmol/L Mg2+的测活体系中每分
钟催化产生1 mol/L pNP的酶量定为1个酶活力单 位。
酶的比活力定义为每mg蛋白所具有的酶活力单位 数。
酶活性测定前处理
1、2号样品稀释50倍（用洗脱液稀释） 3号样品稀释20倍（用洗脱液稀释） 4号样品不稀释（用洗脱液稀释）
碱性磷酸酶检测
合适的辅因子、激活剂浓度
合理的测定时间(?)
最适温度(?)
最适pH (?)
4
5
碱性磷酸酶ALP (Alkaline phosphatase)
• ALP几乎存在于机体各个组织，以骨骼、牙齿、肝脏和肾脏中含
量较多，儿童的ALP活性高于成人。 • 临床测定ALP活性主要用于肝脏疾病和骨骼疾病诊断. 生理性增加: 儿童、孕妇及进食高脂食物可使血清ALP活性增高.
血清碱性磷酸酶活性测定 （磷酸苯二钠法）
1
实验目的
• 熟悉酶活性检测的意义 • 熟悉血清ALP活性测定方法(磷酸苯二钠法) • 掌握血清ALP活性测定的临化学反应的能力，常用单位时间内产物的 生成量(即酶促反应速度)来表示酶活性大小。 • 终止测定法(或定时法): 在酶作用一段时间后，加入强酸、强 碱、蛋白沉淀剂等终止酶促反应，测定这段时间内产物的生成量，
参考值: 成人为3-13个金氏单位，儿童为5-28个金氏单位
8
讨论
1. 分析各个试管的功用？ 2. 分析公式中各个数值的意义？
3. 讨论实验操作中两个时间的意义以及精确性。
9
K3Fe(CN)6
金氏单位(King’s unit): 在37℃条件下，每100 mL血清与底物作用15分钟，产
生1mg酚的ALP活性为1个金氏单位。
7
实验步骤
T S B C
血清 (mL)
酚标准液 (mL) 蒸馏水 (mL) 碳酸盐缓冲液 (mL) 底物液 (mL)
0.1
— — 1.0 1.0
—
0.1 — 1.0 1.0
—
— 0.1 1.0 1.0
—
— — 1.0 1.0
混匀, 37℃水浴保温5分钟，同时将底物液预热 混匀, 37℃水浴准确保温15分钟
合理的测定时间(?)
最适温度(?)
最适pH (?)
4
5
碱性磷酸酶ALP (Alkaline phosphatase)
• ALP几乎存在于机体各个组织，以骨骼、牙齿、肝脏和肾脏中含
量较多，儿童的ALP活性高于成人。 • 临床测定ALP活性主要用于肝脏疾病和骨骼疾病诊断. 生理性增加: 儿童、孕妇及进食高脂食物可使血清ALP活性增高.
血清碱性磷酸酶活性测定 （磷酸苯二钠法）
1
实验目的
• 熟悉酶活性检测的意义 • 熟悉血清ALP活性测定方法(磷酸苯二钠法) • 掌握血清ALP活性测定的临化学反应的能力，常用单位时间内产物的 生成量(即酶促反应速度)来表示酶活性大小。 • 终止测定法(或定时法): 在酶作用一段时间后，加入强酸、强 碱、蛋白沉淀剂等终止酶促反应，测定这段时间内产物的生成量，
参考值: 成人为3-13个金氏单位，儿童为5-28个金氏单位
8
讨论
1. 分析各个试管的功用？ 2. 分析公式中各个数值的意义？
3. 讨论实验操作中两个时间的意义以及精确性。
9
K3Fe(CN)6
金氏单位(King’s unit): 在37℃条件下，每100 mL血清与底物作用15分钟，产
生1mg酚的ALP活性为1个金氏单位。
7
实验步骤
T S B C
血清 (mL)
酚标准液 (mL) 蒸馏水 (mL) 碳酸盐缓冲液 (mL) 底物液 (mL)
0.1
— — 1.0 1.0
—
0.1 — 1.0 1.0
—
— 0.1 1.0 1.0
—
— — 1.0 1.0
混匀, 37℃水浴保温5分钟，同时将底物液预热 混匀, 37℃水浴准确保温15分钟
血清碱性磷酸酶活性测定
保持反应时温度是均衡的37c测定管标准管空白管对照管血清ml0100酚标准液0100蒸馏水0100ph10碳酸盐缓冲液100100100100混匀37水浴保温5min同时将底物预热底物液100100100100混匀37水浴保护15min铁氰化钾溶液300300300300血清0100文档仅供参考不能作为科学依据请勿模仿
血清碱性 磷酸酶活性测 (JIǍN XÌNɡ) 定
————磷酸(LÍN 苯二钠 SUĀN) 法
共十六页
主要 内容： (ZHǓYÀO)
⑴ 实验目的(mùdì)
⑵ 实验原理
⑶ 实验器材与试剂
⑷ 实验操作
⑸ 计算
共十六页
基本概念
酶活力：也称酶活性，是表示催化某一特定反应的能
力。可以用在一定条件下所催化的某一特定化学速度表示。 酶催化反应速度越快，酶活力升高，反之活力愈低。
空白管 —— —— 0.100 1.00
对照管 —— —— —— 1.00
混匀，37℃水浴保温5min，同时将底物预热
底物液
铁氰化钾溶液 血清
1.00
1.00
1.00
混匀，37℃水浴保护15min
3.00
3.00
3.00
——
———
——
1.00
3.00 0.100
立即混匀。用510nm波长（红色醌物质的最大吸收波长）比色，以蒸馏水调零点，读取
连续监测法：
连续监测法是指每隔一定时间（2～60s），连续多次测定酶反应过程中
某一反应产物或底物量随时间变化的数据，求出酶反应初速度，间接计算酶活性浓 度(nóngdù)的方法。
• 适用于自动生化分析仪
• 目前已取代固定时间法而成为临床实验室测
血清碱性 磷酸酶活性测 (JIǍN XÌNɡ) 定
————磷酸(LÍN 苯二钠 SUĀN) 法
共十六页
主要 内容： (ZHǓYÀO)
⑴ 实验目的(mùdì)
⑵ 实验原理
⑶ 实验器材与试剂
⑷ 实验操作
⑸ 计算
共十六页
基本概念
酶活力：也称酶活性，是表示催化某一特定反应的能
力。可以用在一定条件下所催化的某一特定化学速度表示。 酶催化反应速度越快，酶活力升高，反之活力愈低。
空白管 —— —— 0.100 1.00
对照管 —— —— —— 1.00
混匀，37℃水浴保温5min，同时将底物预热
底物液
铁氰化钾溶液 血清
1.00
1.00
1.00
混匀，37℃水浴保护15min
3.00
3.00
3.00
——
———
——
1.00
3.00 0.100
立即混匀。用510nm波长（红色醌物质的最大吸收波长）比色，以蒸馏水调零点，读取
连续监测法：
连续监测法是指每隔一定时间（2～60s），连续多次测定酶反应过程中
某一反应产物或底物量随时间变化的数据，求出酶反应初速度，间接计算酶活性浓 度(nóngdù)的方法。
• 适用于自动生化分析仪
• 目前已取代固定时间法而成为临床实验室测
实验二 碱性磷酸酶的提取及其比活性测定
VX = 5/6（0.83） VB/ /
注意事项
1. 低温条件进行 2. 有机溶剂边加边搅拌 3. 加完有机溶剂后，立即离心，分析沉淀 4. 加有机溶剂的量计算精确 5. 乙醇上层液入回收瓶
比色分析的原理
有色溶液
设： I IO
T (透光度)
A = lg IO = -lg I = -lg T
I (吸光度)
实验二 碱性磷酸酶的提 取及其比活性测定
材料选择
细胞的破碎
分离纯化
鉴定
碱性磷酸酶 (ALP , AKP) Alkaline phosphatase
一、实验目的
1、 掌握以有机溶剂分离技术提取蛋白质及酶 的原理和方法；
2、掌握酶蛋白纯化过程中的活性、比活性、 得率及纯化倍数的概念及计算；
3、了解AKP的临床意义及纯化蛋白质的一般 方法。
（待测蛋白质含量）
剩余A液
加2ml正丁醇，搅拌 3-5'，室温放置30'， 过滤，入离心管
上述滤液
加等体积冷丙酮，混匀， 离心2000 rpm、5分钟
上清入回收瓶
沉淀
加4.0 ml 0.5 M Mg(Ac)2,
搅拌，记体积VB
B液
B1管
0.10ml B 液 + 4.9 ml 0.01M pH 8.8 Tris
① 取材 取酶含量丰富、容易提取、新鲜的组织
本次实验：肝脏
② 生物组织与细胞的破碎
➢ 机械破碎法 ：高速组织捣碎机、匀浆器、研钵 ➢ 渗透破碎法 ：低渗条件使细胞溶胀而破碎
➢ 反复冻融法 ：
➢ 超声波法：超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而
使细胞破碎
➢ 酶法 ：如用溶菌酶破坏微生物细胞
血清碱性磷酸酶的活性测定
实验原理
三.核心原理 ALP催化磷酸苯二钠转变成苯酚的速率 可用分光光度计监测，从而计算ALP活 力的大小 ALP 磷酸苯二钠+H2O----------苯酚+磷酸氢 PH 10 二钠 苯酚+4-氨基安替比林--铁氰化钾---红色醌 亚胺衍生物
试剂
碳酸盐缓冲液（0.1mol/L PH10.0) 无水碳 酸钠6.36g、碳酸氢钠3.36g、4-氨基安替比 林1.5g溶于800ml蒸馏水中，定容至1L。棕 色瓶贮存。 磷酸苯二钠底物液（20mmol/L) 先将 500ml蒸馏水煮沸，迅速加入磷酸苯二钠 2.18g，冷却后加氯仿2ml，4℃冰箱保存。 显色液 铁氰化钾K3[Fe(CN)6]2.5g、硼酸 17g，各溶于400ml蒸馏水，混合后加蒸馏 水至1L，棕色瓶避光保存。 酚标准工作液0.05mg/ml
实验操作
试剂/ml 血液 酚标准液 蒸馏水 PH10碳酸盐 缓冲液 底物液 铁氰化钾溶 液 血清 测定管（T） 0.100 ----1.00 标准管（S) --0.100 --1.00 空白管（B） 对照管（C） ----0.100 1.00 ------1.00
混匀，37℃水浴保温5min，同时将底物液预热
临床意义
1.生理性增加：如儿童、妊娠期、进食 高糖高脂肪食物等使ALP活性升高 2.病理性改变 A.升高：肝胆疾病（主要见于阻塞性黄 疸，急或慢性黄疸型肝炎，肝硬化，肝 癌） 骨骼疾病（纤维性骨炎、变型 性骨炎、成骨不全症、骨质软化病、佝 偻病、肿瘤骨转移等） B.降低:主要见于呆小症、磷酸酶过少症 等
血清碱性磷酸酶活力的测定
磷酸苯二钠法
生化试验第三组
实验目的
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问题1:为什么要测定碱性磷酸酶的活性？有什 么意义？
1.生理性增加：如儿童、妊娠期、进食高糖、高脂肪 食物等均可使血清ALP活性增高。 2.病理性改变： • 升高
（1）肝胆疾病。主要见于阻塞性黄疸，急、慢性黄疸 性肝炎，肝癌等均可引起血清ALP活力不同程度的升高， 其中以癌性梗阻最明显。 （2）各种骨骼疾病。ALP主要由成骨细胞产生，故骨骼 病特别是有新生骨质生成时，血液内ALP活性增加，以 促进磷酸盐的沉积。如佝偻病、纤维性骨病、成骨不 全症、骨转移癌和骨折修复愈合期等均引起血清ALP活 力升高。
诊断常用血清酶
血清酶 符号 鸟氨酸氨基甲酰转移酶 OCT 卵磷脂胆固醇酰基转移酶 LCAT 谷氨酸脱氢酶 GLDH 山梨醇脱氢酶 SDH 丙氨酸氨基转移酶 ALT 异柠檬酸脱氢酶 ICD -谷氨酰转肽酶 -GT 5ˊ-核苷酸酶 5ˊ-NT 单胺氧化酶 MAO 天门冬氨酸氨基转移酶 AST 肌酸激酶 CK 乳酸脱氢酶 LDH 碱性磷酸酶 ALP 酸性磷酸酶 ACP 淀粉酶 AMS 脂肪酶 LPS 来源 肝 肝 肝 肝 肝、肾、心 肝、胎盘、心 肝、胆、肾、小肠 肝、胆道 肝、肾、脑 心、肝、骨骼肌 骨骼肌、心、脑 心、肾、骨骼肌、肝、肺 骨骼、牙齿、肝、肾 前列腺、红细胞、血小板 胰、唾液腺 胰
酶偶联测定法
应用：对于底物或产物不能直接测定或难于准确测 定的酶促反应 。 Ex Ea Ei
A
B
C
P
式中A为底物，B、C为中间产物，P为产物（必须能够直接测定），Ex为待测酶， Ea、Ei都为工具酶。按照工具酶作用的不同， Ea又称为辅助酶，Ei又称为指示酶，C P称为指示反应。
• 问题3：
• 在酶促反应进程中，是否任一阶段的酶促反应速度 都可以代表酶活性？
（一）血浆特异酶
• 在血浆中发挥特定催化作用的酶。如凝血酶、 胆碱酯酶（CHE）、脂蛋白脂肪酶、铜氧化酶等。
• •
它们大多数在肝内合成，在血浆中的浓度甚 至超过器官细胞内浓度。有的可以作为肝功能试 验的一部分。 血浆特异酶活性的改变，除了反映血液功能 外，还反映来源器官的功能。
（二）非血浆特异酶
• 当肝脏受到损伤或者障碍时经淋巴道和肝窦进入血液， 同时由于肝内胆道胆汁排泄障碍，反流入血而引起血清 碱性磷酸酶明显升高。
什么是ALP?
• 是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通 过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除 去，并生成磷酸根离子和自由的羟基，这类 底物包括核酸、蛋白、生物碱等。而该脱去 磷酸基团的过程称为去磷酸化或脱磷酸化。 • 碱性磷酸酶在碱性环境中有最大活力。
• • • 在血浆中浓度很低，且无功能，分为两种。 1.分泌酶： 来源于消化腺或其他外分泌腺的酶。如α-淀粉酶 （AMY）、前列腺酸性磷酸酶（ACP）、脂肪酶 （LPS）、胃蛋白酶原、胰蛋白酶原 、ALP等。
正常体液中外分泌酶活性低而稳定，不发生催化 作用。
• • •
在血液中的浓度和其分泌腺体的功能活动和疾病有 关，来源增加或排泄受阻时，血浆中此类酶活性增高。 例如，急性胰腺炎时，血淀粉酶就会升高。
血清碱性磷酸酶活性测定 （磷酸苯二钠法）
• 问题1：
• 为何要测定血清中酶的活性？有什
么意义？
引言（1）
• 酶活性测定是目前临床酶学分析最为常用的方 法。酶测定约占目前临床生化总工作量的1/4到 1/2。 • 用于诊断的酶类已超过100多种，常用的数十 种。
血浆酶的来源
血浆特异酶 血浆酶 非血浆特异酶 细胞内酶 外分泌酶
引言（2）
• 一些酶在不同器官、组织、细胞内的分布和定 位存在明显差异，而且在细胞内外有明显浓度 梯度差。 • 正常情况下血浆中酶活性相对恒定。但一些病 理情况常导致血浆中酶活性的改变。性别、年 龄、运动、妊娠、人种及环境因素等可引起人 血浆中某些酶的生理性变化。 • 所以酶与其它指标相比具有更高的诊断特异性 和灵敏度。
酶促反应进程曲线
•能够真正代表酶 活性大小的是线 性期的酶促反应 速度，即酶促反 应初速度。
酶促反应初速度
酶活性
酶的含量
• 问题4：
• 测酶活性应注意哪些方面？
酶最适反应条件的选择 • 合适的底物与最适底物浓度 • 底物浓度远远高于酶浓度 • 理想的缓冲液与最适离子强度 • 最适温度 • 最适pH • 合适的辅因子、激活剂浓度 • 合理的测定时间
• 2.代谢酶：（细胞酶） • 在细胞内发挥催化功能的酶。正常时这些 酶存在于组织细胞中，血浆中酶活性很低。细 胞内、外浓度差异悬殊。 • 当酶来源的组织细胞发生病变，细胞膜通 透性增加或细胞坏死时，细胞内酶大量进入血 浆，导致血浆酶活性显著增高。其下降的临床 意义很少。 • 这一类酶临床应用较多，如转氨酶、乳酸脱氢 酶、肌酸激酶等，它们在肝病、心脏疾病时都 可能出现变化。
碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP or AKP )
• ALP几乎存在于机体各个组织，但以骨骼、牙齿、肝脏 和肾脏中含量较多，儿童期含量尤其多。 • • • ALP有六种同功酶。其中AKP1、AKP2、AKP6来自肝脏， AKP3来自骨细胞，AKP4产生于胎盘及癌细胞，而AKP5来 自小肠绒毛上皮与成纤维细胞。 临床上测定ALP活性主要用于肝脏疾病和骨骼疾病的诊 断。
• 降低：主要见于呆小症，磷酸酶过少症等。
• 问题2：
• 如何测定酶活性？
酶活性的概念
•
酶活性：酶催化某一化学反应的能力
• 常用单位时间内底物的减少量或产物的生 成量（即酶促反应速度）来表示酶活性大小
注：在实际测定酶促反应速度时，以测定单位 时间内产物的生成量为好。
酶活性的测定方法
• 固定时间法： （终点法）
• 通常是酶作用一段时间后，加入强酸、强碱、蛋白沉淀 剂等终止酶促反应，测定这段时间内底物的减少量或产 物的生成量，计算酶促反应的平均速度。
•连续监测法：
（速率法）
• 连续监测法是指每隔一定时间（2～60s），连续多次测 定酶反应过程中某一反应产物或底物量随时间变化的数 据，求出酶反应初速度，间接计算酶活性浓度的方法。 • 适用于自动生化分析仪 • 能动态观测酶促反应进程，结果准确可靠，标本和试剂 用量少，可在较短时间内完成测定。