碱性磷酸酶检测
碱性磷酸酶(ALP)测定(速率法)标准化操作程序文件
碱性磷酸酶（ALP）测定（速率法）标准化操作程序文件1：概述碱性磷酸酶英文简称AKP或ALP，是广泛分布于人体各脏器器官中，其中以肝脏为最多其次为肾脏，骨骼、肠、和胎盘等组织,。
它不是单一的酶，而是一组同功酶。
目前已发现有AKP1 、AKP2 、AKP3 、AKP4 、AKP5 与AKP6 六种同功酶。
碱性磷酸酶（ALP）：是从牛肠粘膜或大肠杆菌中提取。
从大肠杆菌提取的AP分子量为80kD，酶作用的最适pH为8.0；用小牛肠黏膜提取的AP分子量为l00kD，最适pH为9.6.一般采用对硝基苯磷酸酯（p-NPP）作为底物。
它可制成片状试剂，使用方便。
产物为黄色的对硝基酚，在405nm有吸收峰。
用NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一段时间。
2标本的收集新鲜无溶血标本，血清或血浆样本均不溶血。
血浆样本只能采用肝素或EDTA抗凝。
样本在4摄氏度可稳定7天。
采血前病人应禁食12小时，采集静脉3ml,待凝固后（最好放在37摄氏度水浴箱内45分钟）通常为加抗凝剂的血液在30-60分钟凝血析出血清。
3000r/min离心5-10分钟，分离出血清备用。
不建议采用血浆标本。
3：方法原理样本中的碱性磷酸酶催化水解磷酸对硝基苯酚，生成游离的对硝基苯酚和磷酸，引起405nm处的光吸收值升高，，通过检测405nm处光吸收值上升的速率，可以测定碱性磷酸酶的活力。
4剂来源，配置及储存试剂来源：迪瑞试剂配置：试剂一和试剂二均为液体试剂，可直接使用。
启用后在2-8度可稳定30天。
若试剂混浊，或以蒸馏水为空白在405nm处的光吸收值低于0.8A,应予丢弃。
试剂储存：试剂避光储存2-8摄氏度可稳定至标签所示失效期。
5分析仪器CS-600B全自动生化分析仪分析参数：样品量4 u/l 试剂量：第一试剂200 u/l（R1）；第二试剂50 u/l测光点23—38 测定模式：速率法正反应分析波长：405nm/505nm(主波长/副波长)6计算方法ALP(U/L)=( A/min*Tv*1000)(18.8*Sv*P)式中Tv=总反应体积Sv=样本体积18.8=NADH在405nm处的毫摩尔消光系数P=比色杯光径（cm）7 线性范围：本实验的线性范围：0----850U/L8 参考范围：男性：1---12岁《500 U/L12—15岁《750 U/L》25岁40--150 U/L女性：1---12岁《500 U/L》15岁40--150 U/L9 失控控理1：立即重测同一质控品，如重测后结果仍不再允许范围，请进行下一步。
碱性磷酸酶含量实验报告
一、实验目的1. 掌握碱性磷酸酶（ALP）的测定原理和方法；2. 学习使用分光光度计测定酶活性；3. 了解ALP在不同组织中的含量差异。
二、实验原理碱性磷酸酶（ALP）是一种广泛存在于生物体内的酶，主要催化磷酸单酯的水解反应。
ALP在人体中具有重要的生理功能，如参与骨骼生长发育、肝脏疾病诊断等。
本实验采用连续监测法测定ALP活性，通过测定酶催化底物水解生成产物浓度的变化，计算出酶活性。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）猪肝匀浆液；（2）鸡肝匀浆液；（3）兔肝匀浆液；（4）磷酸苯二钠；（5）0.1mol/L NaOH；（6）0.1mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）；（7）4-氨基安替比林；（8）铁氰化钾；（9）蒸馏水。
2. 实验仪器：（1）分光光度计；（2）恒温水浴箱；（3）移液器；（4）试管；（5）试管架。
四、实验步骤1. 配制试剂：根据实验要求，配制不同浓度的底物溶液、缓冲液、试剂等。
2. 样品处理：将猪肝、鸡肝、兔肝分别制成匀浆，测定其ALP活性。
3. 酶活性测定：（1）取试管一支，加入0.1mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）1.5mL；（2）加入底物溶液0.5mL；（3）加入酶液0.5mL；（4）立即放入恒温水浴箱中，在特定波长下测定吸光度；（5）记录吸光度变化，计算酶活性。
4. 数据处理：以酶活性为纵坐标，底物浓度为横坐标，绘制曲线，求出酶的最大反应速度（Vmax）和米氏常数（Km）。
五、实验结果与分析1. 不同组织ALP活性比较通过实验，测得猪肝、鸡肝、兔肝匀浆液的ALP活性分别为：猪肝：100 U/mL；鸡肝：150 U/mL；兔肝：200 U/mL。
由此可见，兔肝中的ALP活性最高，猪肝中的ALP活性最低。
2. ALP活性与底物浓度关系通过实验，绘制了ALP活性与底物浓度的曲线，求出Vmax和Km值。
结果表明，ALP活性随底物浓度增加而增加，但在一定范围内，ALP活性与底物浓度呈线性关系。
血清碱性磷酸酶ALP测定
血清碱性磷酸酶ALP测定1 检验目的指导本室工作人员规范操作本检测项目，确保检测结果的准确。
2 实验原理本试剂以国际临床化学会（IFCC）推荐方法为基础，所采用的反应原理与反应式如下。
ALP对-硝基苯磷酸盐 + H2O ----------- 对硝基酚 + 磷酸在上述反应中，对-硝基苯酚的生成速率与样本中碱性磷酸酶的活力成正比。
通过在405 nm处监测吸光度的上升速率，即可测得样本中碱性磷酸酶的活性。
3 标本采集与处理：3.1 病人准备：无特殊要求。
3.2 标本类型：标本最好是无溶血的血清。
3.3 血清分离：应在收集后两小时内分离出来。
避免使用含EDTA或草酸盐的血浆。
3.4 标本存放：2～3天内的活性损失：15～25℃保存：<10%；标本稳定性：4～8℃保存稳定7天；-20℃保存至少可稳定2个月标本。
如果分析延迟8小时以上，最好把血清冷藏。
冷冻的血清在融解后会表现出血清值的显著降低。
3.5 标本运输：常温条件下运输3.6 标本拒收标准：细菌污染的不能做测定。
4 实验材料：4.1 试剂：上海复星长征医学科学有限公司ALP试剂盒（沪食药监械（准）字2014第2400166号 YZB/沪 1546-40-2014）4.1.1 试剂组成试剂1（R1）：乙酸镁3.0mmol/L硫酸锌 1.5mmol/LHEDTA 3.0mmol/LAMP缓冲液420mmol/L试剂2（R2）：对-硝基苯磷酸盐81.5mmol/LAMP缓冲液420mmol/LHEDTA5.0mmol/L4.1.2 试剂准备：试剂为即用式。
4.1.3 试剂稳定性与贮存：在2～8℃避光、密封的储存条件下，试剂（盒）自生产之日起有效期为12个月。
试剂启用后，在2～10℃避光的条件下可稳定14天。
4.1.4 变质指示：当试剂有浊度时，表明有细菌污染，不能继续使用。
4.1.5 注意事项：试剂中含有稳定剂，可能存在一定的刺激作用或毒性，请勿直接接触皮肤、眼睛。
碱性磷酸酶测定SOP_ALP临床意义_检验科生化项目SOP
2标本采集与处理
2.1采血方法
空腹采不抗凝静脉血2~3ml。
2.2标本保存
室温可稳定8h，2~8℃可稳定4~5d，-20℃可稳定2个月。
2.3注意事项
推荐选用血清。标本避免溶血，也可使用肝素抗凝血浆，避免使用EDTA、草酸盐和枸橼酸钠抗凝血浆，因它们可抑制ALP活性。标本应避免脂血、溶血、黄疸。
碱性磷酸酶测定
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1检测原理
碱性磷酸酶在磷酸根转移缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇（AMP）存在的情况下催化硝基磷酸苯酯(p-NPP)转移磷酸根到硝基苯酚（p-NP）。通过使用镁和锌离子加强反应。因为p-NP形成引起的在405nm光吸收的改变与ALP活性成正比。
p-NPP+AMPALPp-NP + AMP + PO4
7性能参数
本法线性范围为0~1000U/L,对于超过测定线性范围的结果，用酶稀释液对标本进行稀释，输入稀释因子后再重新检测。
8生物参考区间
50~136U/L。
9临床意义
ALP活力测定常作为肝胆疾病和骨骼疾病的临床辅助诊断的指标。
活性增高可见于（1）肝胆疾病：阻塞性黄疸、急性或慢性黄疸型肝炎、肝癌等。（2）骨骼疾病：由于骨的损伤或疾病使成骨细胞内所含高浓度的碱性磷酸酶活力增高。如纤维性骨炎、成骨不全症、佝偻病、骨软化病、骨转移癌和骨折修复愈合期等。
[2]叶应妩，王毓三，申子瑜.全国临床检验操作规程.第3版.南京：东南大学出版社，2006：406~410。
编写：审核：批准：
3试剂和设备
3.1试剂
采用西门子医学诊断产品（上海）有限公司提供的试剂盒。
3.1.1试剂组成
碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒(磷酸苯二钠比色法)说明书
注意：由于检测仪器和操作手法等条件的不同，参考值范围会有波动，该值仅供参考，对于 要求精确计算 ALP 含量的，可以进行多点重复测定；根据测定经验显示，标准品浓度在 5U/L 以下，标准品浓度在 100U/L 以上，标准曲线会有偏差。
以系列 Phenol 标准(1～6 号)对应的金氏单位(10、20、30、40、50U/L)为横坐标，以相应的 A 标准(1～6 号)为纵坐标，绘制标准曲线。以 A 测定-A 对照的差值为实际的吸光度，用该差 值与标准曲线进行对比，求出酶活力单位。
参考区间(37℃)：
健康成年人 健康儿童
3～13 金氏单位 5～28 金氏单位
注意事项： 1、待测样品中不能含有磷酸酶抑制剂，同时需避免反复冻融。 2、如果没有分光光度计，也可以使用酶标仪测定，但应注意 96 孔板最大检测体积。 3、所测样品的值高于标准曲线的上限，应稀释样品后重新测定。 4、空白管如果显红色，说明 ALP 显色液不可用，应丢弃。 5、加入显色基液时应迅速，并且及时混匀，否则显色不充分。 6、如无法检测 510nm，亦可检测 500～530nm 范围内吸光度。 7、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
保存条件 4℃ 避光 4℃ 避光 4℃ 避光 4℃ 避光 4℃ 避光
自备材料： 1、离心管或小试管、水浴锅或恒温箱 2、分光光度计、比色杯 3、ddH2O、PBS 或生理盐水
操作步骤(仅供参考)： 1、准备样品： ①细胞或组织样品：取恰当细胞或组织裂解液，如果有必要可用 PBS 或生理盐水进行适当匀 浆，一般细胞数量在 106 以上，组织应在 100mg 以上，3000~4000rpm 离心取上清，-20℃ 冻存，用于碱性磷酸酶的检测。 ②血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定， 尿液通常也可以直接用于测定，-20℃冻存，但为了消除样品本身颜色的干扰，需设置加了 血浆或血清但不加底物的对照。 ③高活性样品：如果样品中含有较高活性的碱性磷酸酶，可以使用原有的裂解液或 PBS 等进 行稀释，如鸡血清、血浆可稀释 5～10 倍后检测。
PNPP偶氮法测碱性磷酸酶
介绍一种检测成骨细胞的碱性磷酸酶的方法：
PNPP偶氮法
用吸管吸掉96孔板内的培养液，用PBS冲洗3遍，加入含25mmol/L二乙醇胺（试剂盒里的缓冲液EDA或AMP），1mmol/L氯化镁和6.7mmol/L PNPP的反应液,每孔150ul.37℃避光放置半小时,然后加0.1mol/L氢氧化钠100ul终止反应,用酶标仪于405nm波长下测定OD值.样品OD值在ALP 标准曲线上读取酶活性值(U/L).
ALP标准曲线的绘制:称取PNP0.0111克用三蒸水溶解后稀释至250ml,此时PNP的浓度为
320umol/L.依次倍比稀释成160umol/L,80umol/L,40umol/L,20umol/L,10umol/L和5mol/L.相当于ALP1280 U/L,640U/L,320U/L,160U/L,80U/L,40U/L和20U/L(活性值).用酶标仪于405nm波长下测定PNP的OD值.以ALP活性值作为自变量,对应的OD值作为应变量,求得直线回归方程.。
血清中碱性磷酸酶的测定
果。
误差分析
误差来源识别
分析测定过程中可能存在的误差来源，如试剂不稳定 性、操作不规范等。
误差评估
对误差进行定量评估，了解误差对测定结果的影响程 度。
误差控制
采取相应的措施控制误差，如定期校准仪器、规范操 作流程等，以提高测定结果的准确性和可靠性。
05 结论
CHAPTER
实验总结
实验原理
本实验基于碱性磷酸酶在pH值为9.6 的磷酸盐缓冲液中，能够将磷酸苯二 钠水解为苯酚和磷酸，苯酚在硫酸的 作用下可以形成稳定的苯酚钠盐，进 而通过分光光度计测定其吸光度，从 而计算碱性磷酸酶的活性。
02
探索其他相关指标与碱性磷酸酶的关联性，以更全面地评估肝
胆疾病的病情和治疗效果。
针对实验中的关键步骤和影响因素进行深入研究，以提高实验
03
的准确性和可靠性。
谢谢
THANKS
测定方法分类
根据测定原理，碱性磷酸酶的 测定方法可分为化学法和生物 法两类。
化学法包括酚试剂法、磷酸苯 二钠法等；生物法包括利用同 工酶的电泳法和免疫法等。
其中，酚试剂法由于操作简便、 准确度高，是目前临床上最常 用的测定方法。
03 实验步骤
CHAPTER
样本采集与处理
采集血清样本
从患者静脉采血，分离出血清， 避免溶血和污染。
数据转换
根据需要，将测量值转换为相应 的浓度或活性单位，以便进行比 较和解释。
结果判断与解读
正常范围判断
01
根据参考值范围，判断血清中碱性磷酸酶的活性是否在正常范
围内。
异常结果解读
02
对于异常结果，应结合临床情况和相关指标进行分析，以确定
可能的病因或病理状态。
血清碱性磷酸酶(ALP)—生化检测项目
血清碱性磷酸酶（ALP）
一、检测原理
ALP水解磷酸对硝基苯酯（PNPP）形成硝基苯酚，硝基苯酚吸光度与ALP的活性成正比，加入2-氨基-2-甲基-1-丙醇（AMP）缓冲液维持反应的PH值10.3—10.4，AMP中镁离子及锌离子起激活、维持酶反应。
二、参考区间
血清：男性46—125U/L 女性35—135U/L
三、临床意义
1、各种肝内外胆管阻塞性疾病如胰头癌、胆道结石引起的胆管阻塞，原发性胆汁性肝硬化，肝内胆汁淤积等，碱性磷酸酶明显升高，并且与血清胆红素升高相平行。
2、用于鉴别黄疸的鉴别诊断，碱性磷酸酶转氨酶血清胆红素同时测定有助于黄疸的鉴别诊断。
3、骨骼疾病，纤维性骨炎，佝偻病，骨软化症，成骨细胞瘤及骨折愈合期，碱性磷酸酶升高，主要用于变形性骨炎，
原发性甲旁亢，骨质软化和佝偻病的诊断。
4、生长中的儿童，妊娠中晚期碱性磷酸酶生理性增高。
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0.1 — 1.0 1.0
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— 0.1 1.0 1.0
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— — 1.0 1.0
混匀, 37℃水浴保温5分钟，同时将底物液预热 混匀, 37℃水浴准确保温15分钟
铁氰化钾溶液 (mL)
血清 (mL)
3.0
—
3.0
—
3.0
—
3.0
0.1
立即混匀，以蒸馏水调零点，在510 nm处读取各管吸光度。 AT AC ALP 活性（金氏单位） 0.05 100 计算: AS AB
合适的辅因子、激活剂浓度
合理的测定时间(?)
最适温度(?)
最适pH (?)
4
5
碱性磷酸酶ALP (Alkaline phosphatase)
• ALP几乎存在于机体各个组织，以骨骼、牙齿、肝脏和肾脏中含
量较多，儿童的ALP活性高于成人。 • 临床测定ALP活性主要用于肝脏疾病和骨骼疾病诊断. 生理性增加: 儿童、孕妇及进食高脂食物可使血清ALP活性增高.
血清碱性磷酸酶活性测定 （磷酸苯二钠法）
1
实验目的
• 熟悉酶活性检测的意义 • 熟悉血清ALP活性测定方法(磷酸苯二钠法) • 掌握血清ALP活性测定的临床意义
2
实验原理
• 酶活性：酶催化某一化学反应的能力，常用单位时间内产物的 生成量(即酶促反应速度)来表示酶活性大小。 • 终止测定法(或定时法): 在酶作用一段时间后，加入强酸、强 碱、蛋白沉淀剂等终止酶促反应，测定这段时间内产物的生成量，
计算酶促反应的平均速度，得到酶活性值。
• 连续监测法: 每隔一定时间(2-60s)，连续测定产物量随时间变 化的情况，求出酶反应初速度，间接得到酶活性值。该方法适用 于自动生化分析仪，成为临床测定酶活性浓度最常用的方法。
3
酶活性检测的影响因素
合适的底物与最适底物浓度，[S]>>[E总]
理想的缓冲液与最适离子强度
病理性增加: (1) 肝胆疾病。阻塞性黄疸、黄疸性肝炎和肝癌等，尤以癌性梗阻最明显。 (2) 各种骨骼疾病。佝偻病、纤维性骨病、成骨不全症、骨转移癌和骨折修复
愈合期等。
病理性降低: 呆小症、磷酸酶过少症等。
6
磷酸苯二钠法
在pH=10条件下，ALP可催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸氢二 钠。苯酚在碱性溶液中与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化生 成醌衍生物，根据红色深浅可测定酶活性的大小。
参考值: 成人为3-13个金氏单位，儿童为5-28个金氏单位
8
讨论
1. 分析各个试管的功用？ 2. 分析公式中各个数值的意义？
3. 讨论实验操作中两个时间的意义以及精确性。
9
K3Fe(CN)6
金氏单位(King’s unit): 在37℃条件下，每100 mL血清与底物作用15分，产
生1mg酚的ALP活性为1个金氏单位。
7
实验步骤
T S B C
血清 (mL)
酚标准液 (mL) 蒸馏水 (mL) 碳酸盐缓冲液 (mL) 底物液 (mL)
0.1
— — 1.0 1.0