碱性磷酸酶的活力测定(修改版)
合集下载
碱性磷酸酶活性测定
碱性磷酸酶活性测定磷酸酶磷酸酶能酶促有机磷化合物的水解。
试验表明，土壤微生物对于土壤含磷有机物的矿化起着主要的作用；某些高等植物的根系也有磷酸酶活性。
土壤的磷酸酶活性可以表征土壤的肥力状况（特别是磷的状况）。
基本原理：土壤磷酸酶活性的测定常用各种磷酸酯作为基质。
应用得最多的是酚酞磷酸酯、苯磷酸酯、甘油磷酸酯、ɑ-或ß-萘磷酸酯和p-硝基苯磷酸酯等的水溶性钠盐。
当它们被酶促水解时，能析出无机磷和基质的有机基团。
因此磷酸酶活性的测定时测定基质水解后的无机磷或酚的部分。
这里介绍的方法是测定基质水解时生成的酚量。
该法可用于测定各种磷酸酶的活性：碱性磷酸酶（用PH10的硼酸盐缓冲液），中性磷酸酶（用PH7.0的柠檬酸盐缓冲液），酸性磷酸酶（用PH5.0的乙酸盐缓冲液）试剂配制：1）甲苯2）0.5% 磷酸苯二钠3）硼酸盐缓冲液（PH9.6与PH10.0）：称取12.404g硼酸（H3BO3）溶于700ml 去离子水，用稀NaOH溶液调节至PH10.0，用去离子水稀释至1000ml4) 氯代二溴对苯醌亚胺试剂：取0.125g 2,6-二溴苯醌氯酰亚胺，用10ml 96%的乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。
保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用。
5）标准溶液：（a）母液：1g酚溶于蒸馏水中，并稀释至1000ml，溶液保存在暗色瓶中；（b）工作液：10ml溶液（a）稀释至1000ml（1ml含10ug酚）6）0.3%硫酸铝溶液标准曲线绘制：取0，1，3，5，7，9，11和13ml酚工作液（b），置于50ml容量瓶中，每瓶加入5ml缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，30min后比色测定。
以光密度为纵坐标，浓度为横坐标绘成标准曲线。
操作步骤：1）取5g风干土置于200ml三角瓶中，用2.5ml甲苯处理2）处理15min后，加入20ml 0.5%磷酸苯二钠3）将反应混合物置于37℃恒温箱中，培养24h后，在培养液中加100ml 0.3%硫酸铝溶液用致密滤纸过滤。
碱性磷酸酶活性测定
方法评价
优点：灵敏度较高，显色稳定，
不需去蛋白，操作简单、快速；
缺点：准确度和精密度都较低,受
胆红素和溶血的干扰。
实验材料与仪器
器材： 新鲜血清、移液器、试管及试管 架、吸量管、恒温水浴箱、分光 光度计
移液器
1.调刻度 2.取样 注意：加不同物质换 枪头
实验材料与仪器
试剂盒：
1.混合液：磷酸苯二钠、4-氨基安替比林 2.标准液：已知浓度的酚溶液 3.样 品：血清 4.蒸馏水 5.显色剂:高铁氰化钾
生物化学与分子生物学实验
血清碱性磷酸酶活性测定
授课教师：
实验目的
1.学习血清碱性磷酸酶活性测定 的原理及方法 2.了解血清碱性磷酸酶活性测定 的临床意义
基本概念
酶活性：即酶催化化学反应的能力。
酶的活性通常以活性单位表示。
它反映在规定的条件下，酶促反应 在单位时间内（秒、分或小时）生 成一定量的产物（mg、μg 、μmol） 或消耗一定量的底物所需的酶量。
——呆小病、磷酸酶过少症、维生素C缺 乏症等。
Katal单位：1Katal指在规定条件下， 每秒钟转化1mol底物的酶量。 1Katal=60×106IU
本实验以血清在37℃，pH为10的
条件下，与AKP底物液作用30min， 每生成1mg酚所需的酶量为1个酶
活性单位。
实验原理
碱性磷酸酶（AKP）在碱性条件下
催化磷酸苯二钠水解，释放出酚和
磷酸，酚在碱性溶液中与4-氨基安
基本概念
酶活性单位是衡量酶数量的尺度， 同一种酶由于实验方法、测定条件 不同，酶活性单位的规定也不同。
在相同测定条件下，酶活性单位越 大，表示酶的含量越高，酶促反应 速度越快。
血清碱性磷酸酶活性测定
磷酸苯二钠+H2O
苯酚+磷酸氢二钠
= （A —A ） X 0.05 X 100（kings单位） ALP 活力 混匀，37℃水浴保温5min，同时将底物预热测定
对照
来源：广泛分布于人体的骨、肾、肝、肠、血清、胆汁等部位，但骨骼、牙齿、肾和肝脏中含量较多。
（A —A ） 掌握酶活力测定的一般方法
标准
空白
碱性磷酸酶在碱性环境中有最大活力。
实验原理
碱性磷酸酶在碱性环境中作用于磷酸苯二钠，使之 水解生成酚和磷酸。酚在碱性溶液中与4-氨基安替 比林作用，经铁氰化钾氧化形成红色醌类化合物， 其颜色深浅与ALP活性成正比。
磷酸苯二钠+H2O
ALP 苯酚+磷酸氢二钠
pH=10
苯酚+4-氨基安替比林 铁氰化红钾色醌亚胺衍生物
保持反应时温度是均衡的保持反应时温度是均衡的3737c测定管测定管标准管标准管空白管空白管对照管对照管血清血清mlml01000100酚标准液酚标准液01000100蒸馏水蒸馏水01000100ph10ph10碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液100100100100100100100100混匀3737水浴保温水浴保温5min5min同时将底物预热同时将底物预热底物液底物液100100100100100100100100混匀3737水浴保护水浴保护15min15min铁氰化钾溶液铁氰化钾溶液300300300300300300300300血清血清01000100计算公式计算公式
2．20mmol/L磷酸苯二钠溶液 先将500ml蒸馏水 煮沸，迅速加入磷酸苯二钠2.18g(磷酸苯二钠如含2 分子结晶水，则应称取2.54g) ，冷却后加氯仿2ml防 腐，在4℃冰箱保存。（用剩的溶液不应再倒回瓶中）
血清碱性磷酸酶活性测定
（四）酚标准工作液
器材：
5ml移液管、1ml移液管、加样枪、分光光度计、1cm比色皿 37°C水浴锅
实验操作
取4支试管，如下操作：
立即混匀。用510nm波长（红色醌物质的最大吸收波长）比色， 以蒸馏水调零点，读取各管吸光度。 *保持反应时温度是均衡的，37°C
计算公式
ALP活性金氏单位定义: 每100ml血清再37摄氏度时与底物作用15分钟，产生酚
• 来源：广泛分布于人体的骨、肾、肝、肠、血清、 胆汁等部位，但骨骼、牙齿、肾和肝脏中含量较 多。正常人血清中ALP主要来源于肝脏。
• 是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水 解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生 成磷酸根离子和自由的羟基，这类底物包括核酸、 蛋白、生物碱等。而该脱去磷酸基团的过程称为 去磷酸化或脱磷酸化。
酶活力：酶催化某一化学反应的能力，其衡量的标准是 酶促反应速度的大小。
酶促反应的速度：
常用单位时间内底物的减少量或产物的生 成量来表示。
反应速度↑ 活力↑
酶活力测定方法
• 终止测定法（或定时法）： *本次实验的方法
通常是酶作用一段时间后，加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止酶 促反应，测定这段时间内底物的减少量或产物的生成量，计算酶促反应的平 均速度。
硝基苯酚水解为黄色对硝基苯酚，在 405nm测 定对硝基苯酚生成的速率，这个速率与血清中 ALP活性成正比。反应需要Mg2+作为激活剂。
实验小结
磷酸苯二钠比色法水解速度快，故保温时间较短。 该法灵敏度较高，显色稳定，不需去蛋白，操作简单、 快速。磷酸苯二钠比色法水解速度快，故保温时间较短。 该法灵敏度较高，显色稳定，不需去蛋白，操作简单、 快速。但与磷酸对硝基酚连续监测法相比，准确度、精 密度较低，操作比较繁琐，灵敏度低；酶单位不是国际 单位；受胆红素和溶血的干扰。 但是若用磷酸对硝基 酚法测定，在反应过程中会生成有毒的对硝基苯 酚，对皮肤和黏膜有很大的伤害。
器材：
5ml移液管、1ml移液管、加样枪、分光光度计、1cm比色皿 37°C水浴锅
实验操作
取4支试管，如下操作：
立即混匀。用510nm波长（红色醌物质的最大吸收波长）比色， 以蒸馏水调零点，读取各管吸光度。 *保持反应时温度是均衡的，37°C
计算公式
ALP活性金氏单位定义: 每100ml血清再37摄氏度时与底物作用15分钟，产生酚
• 来源：广泛分布于人体的骨、肾、肝、肠、血清、 胆汁等部位，但骨骼、牙齿、肾和肝脏中含量较 多。正常人血清中ALP主要来源于肝脏。
• 是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水 解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生 成磷酸根离子和自由的羟基，这类底物包括核酸、 蛋白、生物碱等。而该脱去磷酸基团的过程称为 去磷酸化或脱磷酸化。
酶活力：酶催化某一化学反应的能力，其衡量的标准是 酶促反应速度的大小。
酶促反应的速度：
常用单位时间内底物的减少量或产物的生 成量来表示。
反应速度↑ 活力↑
酶活力测定方法
• 终止测定法（或定时法）： *本次实验的方法
通常是酶作用一段时间后，加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止酶 促反应，测定这段时间内底物的减少量或产物的生成量，计算酶促反应的平 均速度。
硝基苯酚水解为黄色对硝基苯酚，在 405nm测 定对硝基苯酚生成的速率，这个速率与血清中 ALP活性成正比。反应需要Mg2+作为激活剂。
实验小结
磷酸苯二钠比色法水解速度快，故保温时间较短。 该法灵敏度较高，显色稳定，不需去蛋白，操作简单、 快速。磷酸苯二钠比色法水解速度快，故保温时间较短。 该法灵敏度较高，显色稳定，不需去蛋白，操作简单、 快速。但与磷酸对硝基酚连续监测法相比，准确度、精 密度较低，操作比较繁琐，灵敏度低；酶单位不是国际 单位；受胆红素和溶血的干扰。 但是若用磷酸对硝基 酚法测定，在反应过程中会生成有毒的对硝基苯 酚，对皮肤和黏膜有很大的伤害。
碱性磷酸酶的活力测定(修改版)
3.1 3.05 3.0 2.9 2.8 2.7
4、一般血清标本可以共用对照管，黄疸血清及溶血 1
单击此处可编辑内容， 根据您的需要自由拉
2
单击此处可编辑内容， 根据您的需要自由拉
伸文本框大小
伸文本框大小
血清应分别作对照管
5、目前市售的酚标准液多数为安瓿瓶，开后不能久 置
计算
• ALP活性=（A测定—A对照）/（A标准—A空白）*0.05*100(金 氏单位）
【注意事项】
1、 铁氰化钾溶液中加入硼酸有稳定最后所显色的 作用。此液应避光保存，如出现蓝绿色即作废。
2、底物液中不应含有酚，如含有酚时空白管显红色， 说明磷酸苯二钠已开始分解，不宜继续使用。
3、加入铁氰化钾后必须迅速混匀(为了改变PH来终 单击编辑标题 单击此处编辑您要的内容，建议您在展示时采用微软雅黑字体， 止酶促反应）否则对实验结果有影响，偏大。 本模版所有图形线条及其相应素材均可自由编辑、改色、替换。 更多使用说明和作品请详阅模版最末的使用手册。
细胞内酶
（一）血浆特异酶
• 在血浆中发挥特定催化作用的酶。如凝血酶、 胆碱酯酶（CHE）、脂蛋白脂肪酶、铜氧化酶等。
• 它们大多数在肝内合成，在血浆中的浓度甚 至超过器官细胞内浓度。有的可以作为肝功能试 验的一部分。
• 血浆特异酶活性的改变，除了反映血液功能 外，还反映来源器官的功能。
（二）非血浆特异酶
• 二是测定底物解离磷酸根后的羟基化合物，这种 方法又可分为：
• 酚化合物在显色剂的作用下显色比色测定（如本次实 验方法）。
• 生成的酚化合物本身在一定的条件下就可显色，如对 硝基苯磷酸二钠（PNPP）法。
• 无色的对硝基苯磷酸二钠在ALP的作用下，生成在 405nm处有特异吸收的淡黄色对硝基苯酚。通过测 定在405nm处吸光度的变化速率来计算ALP的活性。
碱性磷酸酶活性测定试剂盒说明书
碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP/ALP）活性测定试剂盒说明书分光光度法50管/24样注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：AKP/ALP是一种含锌的糖蛋白酶，在碱性环境中可水解各种天然及人工合成的磷脂单酯化合物。
AKP/ALP 广泛分布于人体各脏器中，以肝脏为主。
测定原理：在碱性环境中，AKP/ALP催化磷酸苯二钠生成游离酚；酚与4-氨基安替比林和铁氰化钾反应红色亚醌衍生物，在510nm有特征光吸收；通过测定510 nm吸光度增加速率，来计算AKP活性。
自备仪器和用品：可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿和蒸馏水。
试剂组成和配制：试剂一：液体×1瓶，4℃保存。
试剂二：液体×1瓶，4℃避光保存。
试剂三：液体×1瓶，4℃避光保存。
试剂四：液体×1瓶，4℃避光保存，未变成蓝绿色之前均可使用。
标准品：液体×1支（EP管中），2 μ mol/mL酚标准液，4℃保存。
粗酶液提取：1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆，4℃、8000g离心10min，取上清液待测。
2. 细菌或细胞：按照细菌或细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
3. 血液可直接测定，或者适当稀释后测定。
测定步骤：1. 分光光度计预热30min，调节波长到510 nm，蒸馏水调零。
2. 试剂三置于37℃水浴中预热30 min。
3. 空白管：取EP管，加入20μL蒸馏水，200μL试剂二，200μL试剂三，混匀后置于37℃水浴中保温15min；加入试剂四600μL，混匀后于510 nm测定吸光度，记为A空白管。
实验碱性磷酸酶比活力测定
管号
1
1'
2
2'
3
3'
4
4'
5
5'
加酶时 0.5 m 间 （min）
1m 1.5m 2m
2.5m 3m
3.5m 4m
4.5m 5m
10.5 11 加 NaOH 时间
反应时 间 （min）
11.5
12
12.5
13
13.5 14
14.5
15
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
移液器的使用
• • •
470
440 40.3 9.6 13.2 6.8 3.82 0.49 0.21
33.8
35.3 314.7 1002. 2 451.5 509.3
注意事项
1.
2. 3. 4. 5.
6.
7.
8.
取液量一定要准确。 反应时间一定要精确。 加酶前后一定要将试剂混匀。 空白对照一定要先加NaOH，后加酶。 移液管或微量移液器的使用 比色杯的使用 水浴时试管架可以放进水浴锅中，但要保证水浴锅 的水可以没过试管中样品的位置。 -20oC冻着的样品取出后一定要完全化冻且混匀。
实验 碱性磷酸酶比活力测定
实验目的
掌握酶活性测定方法的一般原理方法
测定碱性磷酸酶制备各步骤酶制剂比活力
实验原理
酶活力：即是酶活性，是表示催化某一特定反应的
能力。可以用在一定条件下所催化的某一特定化学 反应速度表示。 酶催化的反应速度越快，酶活性越高，反之则愈低。 底物减少量或生成物增加量
6
0.6 0.2
8碱性磷酸酶比活力测定
（3）消得：K = E1cm1% 或１克分子浓度，１cm厚度溶液中测得：K = ξ C = D/E1cm%, 或 C = D/ξ
常用于紫外吸收法测定蛋白质，核酸含量，二者分 别在280nm和260nm处有最大吸收，其消光系数 可查到，在同样条件下，测定待测溶液的光密度, 带入上式即可求得C。
酶液（mL）
0.1 mol/L NaOH (mL) 酶液（mL） OD 405 nm
各管加入1.0 mL
各管加入0.2 mL
各0.50mL
混匀，37℃，5分钟
/
各0.1mL
37℃，精确反应10分钟
各管加入2.0 mL
0.1mL
蛋白浓度测定
1. 测定100 μg/mL牛血清白蛋白溶液的OD值； 2. 将稀释后的样品在280nm下测定吸光度； 3. 以洗脱液作空白。
蛋白浓度测定前处理
1、2号样品稀释100倍（用洗脱液稀释） 3号样品稀释20倍（用洗脱液稀释） 4号样品对倍稀释（用洗脱液稀释）
12支试管，1-4做两组平行测定管，01-04作为空白对照
管号 5 mM pNPP(mL)
空白（01-04） 1-1 2-2 各0.2mL
3-3 4-4
Na2CO3-NaHCO3 (mL) 20 mmol/L MgCl2 (mL) H2O (mL)
（二）、酶活力
在37C下，以5mmol/L pNPP为底物，在pH 10.1的
碳酸盐缓冲液含2 mmol/L Mg2+的测活体系中每分
钟催化产生1 mol/L pNP的酶量定为1个酶活力单 位。
酶的比活力定义为每mg蛋白所具有的酶活力单位 数。
酶活性测定前处理
1、2号样品稀释50倍（用洗脱液稀释） 3号样品稀释20倍（用洗脱液稀释） 4号样品不稀释（用洗脱液稀释）
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
应用：对于底物或产物不能直接测定或难于准确测 定的酶促反应 。
Ex
Ea
Ei
A
B
C
P 式中A为底物，B、C为中间产物，P为产物（必须能够直接测定），Ex为待测酶，
Ea、Ei都为工具酶。按照工具酶作用的不同，
Ea又称为辅助酶，Ei又称为指示酶，C P称为指示反应。
• 问题3：
• 在酶促反应进程中，是否任一阶段的酶促反应速 度都可以代表酶活性？
清在37℃。pH=7.4的条件下与底物作用60min，生成1μmol 丙酮酸所需的酶量为1个活力单位
• 酶的比活力：单位质量酶蛋白或单位体积酶制剂所含有酶活 力单位数，即酶活力浓度。
• 酶活力的测定方法 1.终止测定法（定时法或终点法） 2.动力学分析法（连续监测法或速率法）
C 目 录 O N T E N T S
• • 临床上测定ALP活性主要用于肝脏疾病和骨骼疾病的诊
断。
• 当肝脏受到损伤或者障碍时经淋巴道和肝窦进入血液， 同时由于肝内胆道胆汁排泄障碍，反流入血而引起血清 碱性磷酸酶明显升高。
什么是ALP?
• 是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通 过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除 去，并生成磷酸根离子和自由的羟基，这类 底物包括核酸、蛋白、生物碱等。而该脱去 磷酸基团的过程称为去磷酸化或脱磷酸化。
血清碱性磷酸酶活性测定 （磷酸苯二钠法）
• 问题1：
• 为何要测定血清中酶的活性？有 什么意义？
引言（1）
• 酶活性测定是目前临床酶学分析最为常用的方 法。酶测定约占目前临床生化总工作量的1/4到 1/2。
• 用于诊断的酶类已超过100多种，常用的数十种。
血浆酶的来源
血浆酶
血浆特异酶
外分泌酶
非血浆特异酶
3.1 3.05 3.0 2.9 2.8 2.7
碳酸盐缓冲 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 液
0.5%铁氰化 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 钾溶液
相当于金氏 0 单位
0.5 10
20 30 40
立即混匀，选择波长510nm，用零号管调零，读 取各管吸光度，然后将以上各管所得读数与其 相应的碱性磷酸酶单位(依次为0 .5、10、20、 30、40单位)在坐标纸上作图，绘制成标准曲线。
更多使用说明和作品请详阅模版最末的使用手册。
4、一般血清标本可以共用对照管，黄疸血清及溶血 单击此处可编辑内容，
1
根据您的需要自由拉
单击此处可编辑内容，
2
根据您的需要自由拉
伸文本框大小
伸文本框大小
血清应分别作对照管
5、目前市售的酚标准液多数为安瓿瓶，开后不能久 置
计算
• ALP活性=（A测定—A对照）/（A标准—A空白） *0.05*100(金氏单位）
• 二是测定底物解离磷酸根后的羟基化合物，这种 方法又可分为：
• 酚化合物在显色剂的作用下显色比色测定（如本次实 验方法）。
• 生成的酚化合物本身在一定的条件下就可显色，如对 硝基苯磷酸二钠（PNPP）法。
• 无色的对硝基苯磷酸二钠在ALP的作用下，生成在 405nm处有特异吸收的淡黄色对硝基苯酚。通过测定 在405nm处吸光度的变化速率来计算ALP的活性。
• 对于固定时间法，需在酶作用一段时间后，加入合适的 终止剂终止酶促反应。
• 尽量去除各种抑制剂
• 问题5：
• 如何表示酶活性大小？
酶活性单位
• 定义：
• 在一定条件下，一定时间内将一定量的底物转化为产物 （或得到一定量的产物）所需要的酶量。
• 分类：
• 惯用单位：酶活性测定方法的建立者所规定的单位。 • 国际单位(International unit, IU)：指在规定条件
• 金氏单位定义
• 每100ml血清在37℃与底物作用15分钟，产生1mg酚为1个 金氏单位。
• 参考值 成人：3~13金氏单位 儿童：5~28金氏单位
临床意义：
血清中ALP活力测定在临床常作为肝胆疾病和骨骼疾病的临床 辅助诊断指标。
1．血清ALP活性升高可能原因如下 ：①肝胆疾病：阻塞性黄 疸、急性或慢性黄疸性肝炎、肝癌等；②骨骼疾病：由于 骨的损伤或疾病使成骨细胞内所含高浓度的ALP释放进入血 液中，引起血清ALP活性增高，如纤维性骨炎、成骨不全症、 佝偻病、骨软化病、骨转移癌和骨折修复愈合期等。
• 连续监测法： （速率法）
• 连续监测法是指每隔一定时间（2～60s），连续多次测 定酶反应过程中某一反应产物或底物量随时间变化的数 据，求出酶反应初速度，间接计算酶活性浓度的方法。
• 适用于自动生化分析仪 • 能动态观测酶促反应进程，结果准确可靠，标本和试剂
用量少，可在较短时间内完成测定。
酶偶联测定法
2．血清ALP活性降低比较少见： 主要见于呆小病、重症慢 性肾炎、乳糜泻、贫血、恶病质等。另有一种遗传性低ALP 症，因成骨细胞中缺乏ALP，引起骨中的矿物质严重缺乏， 易发生骨折。
标准曲线法
加入物（ml) 0
12
345
酚标准应用 0 液
0.05 0.1 0.2 0.3 0.4
1ml=0.1mg
蒸馏水
（2）各种骨骼疾病。ALP主要由成骨细胞产生，故骨骼 病特别是有新生骨质生成时，血液内ALP活性增加，以 促进磷酸盐的沉积。如佝偻病、纤维性骨病、成骨不 全症、骨转移癌和骨折修复愈合期等均引起血清ALP活 力升高。
• 降低：主要见于呆小症，磷酸酶过少症等。
•问题2：
• 如何测定酶活性？
酶活性的概念
【注意事项】
1、 铁氰化钾溶液中加入硼酸有稳定最后所显色的 作用。此液应避光保存，如出现蓝绿色即作废。
2、底物液中不应含有酚，如含有酚时空白管显红色， 说明磷酸苯二钠已开始分解，不宜继续使用。
单击编辑标题
3、加入铁氰化钾后必须迅速混匀(为了改变PH来终 单击此处编辑您要的内容，建议您在展示时采用微软雅黑字体， 止酶促反应）否则对实验结果有影响，偏大。 本模版所有图形线条及其相应素材均可自由编辑、改色、替换。
（最适pH，最适底物浓度）下，每分钟转化1mol底物 的酶量。单位为IU/L 。 • Kat单位：指在规定条件下，每秒钟转化1mol底物的酶 量，1Kat=6×107IU。
• 酶的活力单位
国际单位：Katal，1s转化1mol底物的酶量 临床表示：Kings，如血清谷丙转氨酶活力单位，每100ml血
叁 ·实验器材与试剂
• （一）器材：
5ml移液管，1ml移液管，100或200ul微量可调式
移液器，721E分光光度计，1cm比色皿，37℃ 恒
温水浴
淡黄色结晶。熔点 109℃。溶于水、苯
和乙醇，微溶于乙
醚。
• （二） 试剂：
1、碳酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH10.0)：溶解无水碳 酸钠6.36g，碳酸氢钠3.36g。4-氨基安替比林 1.5g于蒸馏水800ml中，将此溶液转入1L容量瓶内， 加蒸馏水到刻度。棕色瓶中贮存。
• 酶活性：酶催化某一化学反应的能力
• 常用单位时间内底物的减少量或产物的生 成量（即酶促反应速度）来表示酶活性大小
注：在实际测定酶促反应速度时，以测定单位 时间内产物的生成量为好。
酶活性的测定方法
• 固定时间法： （终点法）
• 通常是酶作用一段时间后，加入强酸、强碱、蛋白沉淀 剂等终止酶促反应，测定这段时间内底物的减少量或产 物的生成量，计算酶促反应的平均速度。
细胞内酶
（一）血浆特异酶
• 在血浆中发挥特定催化作用的酶。如凝血酶、 胆碱酯酶（CHE）、脂蛋白脂肪酶、铜氧化酶等。
• 它们大多数在肝内合成，在血浆中的浓度甚 至超过器官细胞内浓度。有的可以作为肝功能试 验的一部分。
• 血浆特异酶活性的改变，除了反映血液功能 外，还反映来源器官的功能。
（二）非血浆特异酶
酶促反应进程曲线
•能够真正代表酶 活性大小的是线 性期的酶促反应 速度，即酶促反 应初速度。
酶促反应初速度
酶活性
酶的含量
• 问题4：
• 测酶活性应注意哪些方面？
酶最适反应条件的选择
• 合适的底物与最适底物浓度 • 底物浓度远远高于酶浓度 • 理想的缓冲液与最适离子强度 • 最适温度 • 最适pH • 合适的辅因子、激活剂浓度 • 合理的测定时间
肆 ·实验操作
实验过程两次水浴保温，一次5min，一次15min。前者是达 到最适温度，后者是反应时间
取试管4支，按下表操作
• 立即混匀。用510nm波长（红色醌物质的最大吸收波长）比色，以蒸馏水 调零点，读取各管吸光度。 •保持反应时温度是均衡的，37°C
ADD YOUR TITLE HERE
2、20mmol/L磷酸苯二钠溶液 先将500ml蒸馏水煮 ห้องสมุดไป่ตู้，迅速加入磷酸苯二钠2.18g(磷酸苯二钠如含2 分子结晶水，则应称取2.54g) ，冷却后加氯仿 2ml防腐，在4℃冰箱保存。（用剩的溶液不应再 倒回瓶中）
4一氨基安替比林用量与吸光度成正相关，需准确加入。铁氰 化钾用量不足时，反应不完全，测量结果偏低，因此铁氰化钾 用量必须加足或稍稍过量
壹 ·实验目的 贰 ·实验原理 叁 ·实验器材与试剂 肆 ·实验操作
壹 ·实验目的
• 熟悉血清碱性磷酸酶活性的测定方法（磷酸苯二 钠法）
• 掌握血清碱性磷酸酶测定的临床意义
贰 ·实验原理
• 测定ALP活性的方法主要分为两种
• 一是测定底物解离下的磷酸根来计算酶活力，如 β-甘油磷酸钠法，但存在血清本身有磷酸根的 缺点
• 在血浆中浓度很低，且无功能，分为两种。 • 1.分泌酶： • 来源于消化腺或其他外分泌腺的酶。如α-淀粉酶
（AMY）、前列腺酸性磷酸酶（ACP）、脂肪酶（LPS）、 胃蛋白酶原、胰蛋白酶原 、ALP等。 • 正常体液中外分泌酶活性低而稳定，不发生催化 作用。 • 在血液中的浓度和其分泌腺体的功能活动和疾病有 关，来源增加或排泄受阻时，血浆中此类酶活性增高。 例如，急性胰腺炎时，血淀粉酶就会升高。