碱性磷酸酶的活力测定
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碱性磷酸酶活性测定
方法评价
优点：灵敏度较高，显色稳定，
不需去蛋白，操作简单、快速；
缺点：准确度和精密度都较低,受
胆红素和溶血的干扰。
实验材料与仪器
器材： 新鲜血清、移液器、试管及试管 架、吸量管、恒温水浴箱、分光 光度计
移液器
1.调刻度 2.取样 注意：加不同物质换 枪头
实验材料与仪器
试剂盒：
1.混合液：磷酸苯二钠、4-氨基安替比林 2.标准液：已知浓度的酚溶液 3.样 品：血清 4.蒸馏水 5.显色剂:高铁氰化钾
生物化学与分子生物学实验
血清碱性磷酸酶活性测定
授课教师：
实验目的
1.学习血清碱性磷酸酶活性测定 的原理及方法 2.了解血清碱性磷酸酶活性测定 的临床意义
基本概念
酶活性：即酶催化化学反应的能力。
酶的活性通常以活性单位表示。
它反映在规定的条件下，酶促反应 在单位时间内（秒、分或小时）生 成一定量的产物（mg、μg 、μmol） 或消耗一定量的底物所需的酶量。
——呆小病、磷酸酶过少症、维生素C缺 乏症等。
Katal单位：1Katal指在规定条件下， 每秒钟转化1mol底物的酶量。 1Katal=60×106IU
本实验以血清在37℃，pH为10的
条件下，与AKP底物液作用30min， 每生成1mg酚所需的酶量为1个酶
活性单位。
实验原理
碱性磷酸酶（AKP）在碱性条件下
催化磷酸苯二钠水解，释放出酚和
磷酸，酚在碱性溶液中与4-氨基安
基本概念
酶活性单位是衡量酶数量的尺度， 同一种酶由于实验方法、测定条件 不同，酶活性单位的规定也不同。
在相同测定条件下，酶活性单位越 大，表示酶的含量越高，酶促反应 速度越快。
碱性磷酸酶活力测定
②骨骼疾病：由于骨的损伤或疾病使成骨细胞内所含高浓度的释放进入血液中，引起血清活性 增高，如纤维性骨炎、成骨不全症、佝偻病、骨软化病、骨转移癌和骨折修复愈合期等。 2．血清活性降低比较少见： 主要见于呆小病、重症慢性肾炎、乳糜泻、贫血、恶病质等。另有 一种遗传性低症，因成骨细胞中缺乏，引起骨中的矿物质严重缺乏，易发生骨折。
诊断常用血清酶
血清酶
鸟氨酸氨基甲酰转移酶 卵磷脂胆固醇酰基转移酶 谷氨酸脱氢酶 山梨醇脱氢酶 丙氨酸氨基转移酶 异柠檬酸脱氢酶
-谷氨酰转肽酶 5ˊ-核苷酸酶 单胺氧化酶 天门冬氨酸氨基转移酶 肌酸激酶 乳酸脱氢酶 碱性磷酸酶 酸性磷酸酶 淀粉酶 脂肪酶
符号 5ˊ
来源
肝 肝 肝
肝 肝、肾、心 肝、胎盘、心
注：在实际测定酶促反应速度时，以测定单位时间内产物的生成量为好。
酶活性的测定方法
• 固定时间法： （终点法） • 通常是酶作用一段时间后，加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止酶促反应，测定这段时间内底
物的减少量或产物的生成量，计算酶促反应的平均速度。 • 连续监测法： （速率法） • 连续监测法是指每隔一定时间（2～60s），连续多次测定酶反应过程中某一反应产物或底物量
•
在血浆中发挥特定催化作用的酶。如凝血酶、胆碱酯酶（）、脂蛋白脂肪酶、铜氧化酶
等。
•
它们大多数在肝内合成，在血浆中的浓度甚至超过器官细胞内浓度。有的可以作为肝功
能试验的一部分。
•
血浆特异酶活性的改变，除了反映血液功能外，还反映来源器官的功能。
（二）非血浆特异酶
•
在血浆中浓度很低，且无功能，分为两种。
• • 临床上测定活性主要用于肝脏疾病和骨骼疾病的诊断。
• 当肝脏受到损伤或者障碍时经淋巴道和肝窦进入血液，同时由于肝内胆道胆汁排泄障碍 ，反流入血而引起血清碱性磷酸酶明显升高。
诊断常用血清酶
血清酶
鸟氨酸氨基甲酰转移酶 卵磷脂胆固醇酰基转移酶 谷氨酸脱氢酶 山梨醇脱氢酶 丙氨酸氨基转移酶 异柠檬酸脱氢酶
-谷氨酰转肽酶 5ˊ-核苷酸酶 单胺氧化酶 天门冬氨酸氨基转移酶 肌酸激酶 乳酸脱氢酶 碱性磷酸酶 酸性磷酸酶 淀粉酶 脂肪酶
符号 5ˊ
来源
肝 肝 肝
肝 肝、肾、心 肝、胎盘、心
注：在实际测定酶促反应速度时，以测定单位时间内产物的生成量为好。
酶活性的测定方法
• 固定时间法： （终点法） • 通常是酶作用一段时间后，加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止酶促反应，测定这段时间内底
物的减少量或产物的生成量，计算酶促反应的平均速度。 • 连续监测法： （速率法） • 连续监测法是指每隔一定时间（2～60s），连续多次测定酶反应过程中某一反应产物或底物量
•
在血浆中发挥特定催化作用的酶。如凝血酶、胆碱酯酶（）、脂蛋白脂肪酶、铜氧化酶
等。
•
它们大多数在肝内合成，在血浆中的浓度甚至超过器官细胞内浓度。有的可以作为肝功
能试验的一部分。
•
血浆特异酶活性的改变，除了反映血液功能外，还反映来源器官的功能。
（二）非血浆特异酶
•
在血浆中浓度很低，且无功能，分为两种。
• • 临床上测定活性主要用于肝脏疾病和骨骼疾病的诊断。
• 当肝脏受到损伤或者障碍时经淋巴道和肝窦进入血液，同时由于肝内胆道胆汁排泄障碍 ，反流入血而引起血清碱性磷酸酶明显升高。
血清碱性磷酸酶的活性测定
11
思考
结合参考值范围、临床意义分析本小组 的实验结果
12
1.生理性增加：如儿童、妊娠期、进食 高糖高脂肪食物等使ALP活性升高
2.病理性改变 A.升高：肝胆疾病（主要见于阻塞性黄
疸，急或慢性黄疸型肝炎，肝硬化，肝 癌） 骨骼疾病（纤维性骨炎、变型 性骨炎、成骨不全症、骨质软化病、佝 偻病、肿瘤骨转移等） B.降低:主要见于呆小症、磷酸酶过少症 等
8
计算公式
9
注意事项
1.铁氰化钾应避光保存，如出现蓝绿色 即作废。铁氰化钾 的水溶液受到光线 的作用，就会分解成黄血盐钾 K4[Fe(CN)6]
2.底物液中不应含有酚，如含有酚时空 白管显红色，说明磷酸苯二钠开始分解， 不宜继续使用
3.加入铁氰化钾后必须迅速混匀，否则 显色不充分
10
临床意义
6
试剂
碳酸盐缓冲液（0.1mol/L PH10.0) 无水碳 酸钠6.36g、碳酸氢钠3.36g、4-氨基安替 比林1.5g溶于800ml蒸馏水中，定容至1L。 棕色瓶贮存。
磷酸苯二钠底物液（20mmol/L) 先将 500ml蒸馏水煮沸，迅速加入磷酸苯二钠 2.18g，冷却后加氯仿2ml，4℃冰箱保存。
血清碱性磷酸酶活力的测定
磷酸苯二钠法
1
实验目的
1.熟悉酶活力测定方法的一般原理 2.掌握血清碱性磷酸酶(ALP)的测定原理
与临床意义。 3.酶活力测定的目的是了解组织提取液、
体液中酶的存在于含量。
2
实验原理
一.基本概念 1.酶活力测定 酶的催化功能可以用在一定条件下
酶所催化的某一特定化学反应的速度来表示。反 应速度越快，酶活力越高;反之，活力越低。测定 酶活力实际上是测定酶促反应速率。 2.酶的活力单位 a.国际 在特定的条件下，1min内将1μmol底物转 化为产物所需的酶量为1个国际单位(IU)。 1IU=16.67×10-9Katal b.临床上采用金氏（Kings）的定义：每100ml血清 在37℃与底物作用15min，产生苯酚1mg的酶量为1 个金氏单位。 c.Kat单位 在特定条件下，每秒钟转化1mol底物的 酶量。1Kat=6×107 IU
思考
结合参考值范围、临床意义分析本小组 的实验结果
12
1.生理性增加：如儿童、妊娠期、进食 高糖高脂肪食物等使ALP活性升高
2.病理性改变 A.升高：肝胆疾病（主要见于阻塞性黄
疸，急或慢性黄疸型肝炎，肝硬化，肝 癌） 骨骼疾病（纤维性骨炎、变型 性骨炎、成骨不全症、骨质软化病、佝 偻病、肿瘤骨转移等） B.降低:主要见于呆小症、磷酸酶过少症 等
8
计算公式
9
注意事项
1.铁氰化钾应避光保存，如出现蓝绿色 即作废。铁氰化钾 的水溶液受到光线 的作用，就会分解成黄血盐钾 K4[Fe(CN)6]
2.底物液中不应含有酚，如含有酚时空 白管显红色，说明磷酸苯二钠开始分解， 不宜继续使用
3.加入铁氰化钾后必须迅速混匀，否则 显色不充分
10
临床意义
6
试剂
碳酸盐缓冲液（0.1mol/L PH10.0) 无水碳 酸钠6.36g、碳酸氢钠3.36g、4-氨基安替 比林1.5g溶于800ml蒸馏水中，定容至1L。 棕色瓶贮存。
磷酸苯二钠底物液（20mmol/L) 先将 500ml蒸馏水煮沸，迅速加入磷酸苯二钠 2.18g，冷却后加氯仿2ml，4℃冰箱保存。
血清碱性磷酸酶活力的测定
磷酸苯二钠法
1
实验目的
1.熟悉酶活力测定方法的一般原理 2.掌握血清碱性磷酸酶(ALP)的测定原理
与临床意义。 3.酶活力测定的目的是了解组织提取液、
体液中酶的存在于含量。
2
实验原理
一.基本概念 1.酶活力测定 酶的催化功能可以用在一定条件下
酶所催化的某一特定化学反应的速度来表示。反 应速度越快，酶活力越高;反之，活力越低。测定 酶活力实际上是测定酶促反应速率。 2.酶的活力单位 a.国际 在特定的条件下，1min内将1μmol底物转 化为产物所需的酶量为1个国际单位(IU)。 1IU=16.67×10-9Katal b.临床上采用金氏（Kings）的定义：每100ml血清 在37℃与底物作用15min，产生苯酚1mg的酶量为1 个金氏单位。 c.Kat单位 在特定条件下，每秒钟转化1mol底物的 酶量。1Kat=6×107 IU
血清碱性磷酸酶活力测定
实验目的
熟悉酶活性测定方法的一般原理 掌握血清ALP测定原理与临床意义 掌握血清ALP测定原理与临床意义
实验原理
碱性磷酸酶在碱性环境中作用于磷酸苯二钠，使 之水解生成酚和磷酸。酚在碱性溶液中与4 之水解生成酚和磷酸。酚在碱性溶液中与4-氨基 安替比林作用，经铁氰化钾氧化形成红色醌类化 ALP 合物，其颜色深浅与ALP活性成正比。 合物，其颜色深浅与ALP活性成正比。
混匀，37℃水浴保温5min，同时将底物预热 混匀，37℃水浴保温5min，同时将底物预热 底物液 1.00 1.00 1.00 1.00
混匀，37℃水浴保护15min 混匀，37℃水浴保护15min 铁氰化钾溶液 血清 3.00 —— 3.00 ——— 3.00 —— 3.00 0.100
2.立即混匀。在510nm波长处比色，以蒸馏水调零点，读取各 管吸光度。
磷酸苯二钠+H 磷酸苯二钠+H2O
ALP 苯酚+ 苯酚+磷酸氢二钠 pH=10 铁氰化钾
苯酚+4苯酚+4-氨基替比林
红色醌亚胺衍生物
实验器材和试剂：
（一）器材： 5ml移液管，1ml移液管，100或200ul微量可调式移液器， 5ml移液管，1ml移液管，100或200ul微量可调式移液器， 721E分光光度计，1cm比色皿，37℃ 721E分光光度计，1cm比色皿，37℃ 恒温水浴 （二）试剂： 1．0.1mol/L碳酸盐缓冲液(pH10.0) 称取无水碳酸钠 0.1mol/L碳酸盐缓冲液 碳酸盐缓冲液(pH10.0) 6.36g，碳酸氢钠3.36g， 氨基安替比林1.5g，溶于 6.36g，碳酸氢钠3.36g，4-氨基安替比林1.5g，溶于 800mL蒸馏水中，定容至 800mL蒸馏水中，定容至1L。置棕色瓶中保存。 2．20mmol/L磷酸苯二钠溶液 先将500ml蒸馏水煮 20mmol/L磷酸苯二钠溶液 先将500ml蒸馏水煮 沸，迅速加入磷酸苯二钠2.18g(磷酸苯二钠如含2 沸，迅速加入磷酸苯二钠2.18g(磷酸苯二钠如含2分子结 晶水，则应称取2.54g) ，冷却后加氯仿2ml防腐，在4 晶水，则应称取2.54g) ，冷却后加氯仿2ml防腐，在4℃ 冰箱保存。（用剩的溶液不应再倒回瓶中） 3．铁氰化钾的硼酸溶液 称取铁氰化钾2.5g，硼酸17g， 称取铁氰化钾2.5g，硼酸17g， 各自溶于蒸馏水400ml中，两液混合后，加蒸馏水至1 各自溶于蒸馏水400ml中，两液混合后，加蒸馏水至1L， 置棕色瓶中避光保存(如出现蓝绿色即弃去) 置棕色瓶中避光保存(如出现蓝绿色即弃去)。 4．酚标准工作液（0. 05mg/ml）：购买合格的二级 酚标准工作液（ 05mg/ml）： ）：购买合格的二级 标准品。
血清碱性磷酸酶活
算求出酶的活性。
！！！两法比较： 两法比较：
• 终止测定法： 用此类方法测定酶活力，必须确保酶 促反应作用时间的精确，否则会产生较大误差！ • 动力学分析法： 该方法计算方便，不需要作标准曲线 或者标准管。随着科学技术的发展，自动化分析 仪的使用，该方法现已逐步取代终止测定法。
标准曲线法
• 制备如下： 取试管6支，分别加酚标准液 取试管6 (1ml=0．1mg)， 0.05、0.1、0.2、0.3、0.4ml，各 (1ml=0．1mg)，0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4ml，各 管依次加复合基质液3.1、3.05、3.0、2.9、2.8、 管依次加复合基质液3.1、3.05、3.0、2.9、2.8、 2.7ml。混匀后37℃水浴保温5 2.7ml。混匀后37℃水浴保温5分钟，各管加入 1.0ml碱性溶液，再加0.5％铁氰化钾2.0ml，立即混 1.0ml碱性溶液，再加0.5％铁氰化钾2.0ml，立即混 匀。静置10分钟，510nm波长下比色。将以上各管 匀。静置10分钟，510nm波长下比色。将以上各管 所得读数与其相应的碱性磷酸酶单位(依次为0.5、 所得读数与其相应的碱性磷酸酶单位(依次为0.5、 10、20、30、40单位)在坐标纸上作图，绘制成标 10、20、30、40单位) 准曲线。
血清碱性磷酸酶活性测定
磷酸苯二钠法
实验目的
• 熟悉酶活性测定方法的一般原理 • 掌握血清ALP测定原理与临床意义 掌握血清ALP测定原理与临床意义 • 熟悉终止法和动力学测定法
实验原理
• 在PH10 环境中，ALP催化磷酸苯二钠水解生 环境中，ALP催化磷酸苯二钠水解生 成苯酚和磷酸氢二钠，苯酚与4 成苯酚和磷酸氢二钠，苯酚与4-氨基安替比 林反应生成色素原，该色素原经铁氰化钾氧 化生成红色醌亚衍生物。测定红色物质的吸 光度就可以计算酶活性的大小。 • 反应式如下： 磷酸苯二钠+H ——苯酚+ 磷酸苯二钠+H2O——苯酚+磷酸氢二钠 苯酚+4-氨基安替比林——红色醌亚胺衍生物 苯酚+4-氨基安替比林——红色醌亚胺衍生物
！！！两法比较： 两法比较：
• 终止测定法： 用此类方法测定酶活力，必须确保酶 促反应作用时间的精确，否则会产生较大误差！ • 动力学分析法： 该方法计算方便，不需要作标准曲线 或者标准管。随着科学技术的发展，自动化分析 仪的使用，该方法现已逐步取代终止测定法。
标准曲线法
• 制备如下： 取试管6支，分别加酚标准液 取试管6 (1ml=0．1mg)， 0.05、0.1、0.2、0.3、0.4ml，各 (1ml=0．1mg)，0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4ml，各 管依次加复合基质液3.1、3.05、3.0、2.9、2.8、 管依次加复合基质液3.1、3.05、3.0、2.9、2.8、 2.7ml。混匀后37℃水浴保温5 2.7ml。混匀后37℃水浴保温5分钟，各管加入 1.0ml碱性溶液，再加0.5％铁氰化钾2.0ml，立即混 1.0ml碱性溶液，再加0.5％铁氰化钾2.0ml，立即混 匀。静置10分钟，510nm波长下比色。将以上各管 匀。静置10分钟，510nm波长下比色。将以上各管 所得读数与其相应的碱性磷酸酶单位(依次为0.5、 所得读数与其相应的碱性磷酸酶单位(依次为0.5、 10、20、30、40单位)在坐标纸上作图，绘制成标 10、20、30、40单位) 准曲线。
血清碱性磷酸酶活性测定
磷酸苯二钠法
实验目的
• 熟悉酶活性测定方法的一般原理 • 掌握血清ALP测定原理与临床意义 掌握血清ALP测定原理与临床意义 • 熟悉终止法和动力学测定法
实验原理
• 在PH10 环境中，ALP催化磷酸苯二钠水解生 环境中，ALP催化磷酸苯二钠水解生 成苯酚和磷酸氢二钠，苯酚与4 成苯酚和磷酸氢二钠，苯酚与4-氨基安替比 林反应生成色素原，该色素原经铁氰化钾氧 化生成红色醌亚衍生物。测定红色物质的吸 光度就可以计算酶活性的大小。 • 反应式如下： 磷酸苯二钠+H ——苯酚+ 磷酸苯二钠+H2O——苯酚+磷酸氢二钠 苯酚+4-氨基安替比林——红色醌亚胺衍生物 苯酚+4-氨基安替比林——红色醌亚胺衍生物
碱性磷酸酶活性测定试剂盒说明书
碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP/ALP）活性测定试剂盒说明书分光光度法50管/24样注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：AKP/ALP是一种含锌的糖蛋白酶，在碱性环境中可水解各种天然及人工合成的磷脂单酯化合物。
AKP/ALP 广泛分布于人体各脏器中，以肝脏为主。
测定原理：在碱性环境中，AKP/ALP催化磷酸苯二钠生成游离酚；酚与4-氨基安替比林和铁氰化钾反应红色亚醌衍生物，在510nm有特征光吸收；通过测定510 nm吸光度增加速率，来计算AKP活性。
自备仪器和用品：可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿和蒸馏水。
试剂组成和配制：试剂一：液体×1瓶，4℃保存。
试剂二：液体×1瓶，4℃避光保存。
试剂三：液体×1瓶，4℃避光保存。
试剂四：液体×1瓶，4℃避光保存，未变成蓝绿色之前均可使用。
标准品：液体×1支（EP管中），2 μ mol/mL酚标准液，4℃保存。
粗酶液提取：1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆，4℃、8000g离心10min，取上清液待测。
2. 细菌或细胞：按照细菌或细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
3. 血液可直接测定，或者适当稀释后测定。
测定步骤：1. 分光光度计预热30min，调节波长到510 nm，蒸馏水调零。
2. 试剂三置于37℃水浴中预热30 min。
3. 空白管：取EP管，加入20μL蒸馏水，200μL试剂二，200μL试剂三，混匀后置于37℃水浴中保温15min；加入试剂四600μL，混匀后于510 nm测定吸光度，记为A空白管。
实验碱性磷酸酶比活力测定
管号
1
1'
2
2'
3
3'
4
4'
5
5'
加酶时 0.5 m 间 （min）
1m 1.5m 2m
2.5m 3m
3.5m 4m
4.5m 5m
10.5 11 加 NaOH 时间
反应时 间 （min）
11.5
12
12.5
13
13.5 14
14.5
15
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
移液器的使用
• • •
470
440 40.3 9.6 13.2 6.8 3.82 0.49 0.21
33.8
35.3 314.7 1002. 2 451.5 509.3
注意事项
1.
2. 3. 4. 5.
6.
7.
8.
取液量一定要准确。 反应时间一定要精确。 加酶前后一定要将试剂混匀。 空白对照一定要先加NaOH，后加酶。 移液管或微量移液器的使用 比色杯的使用 水浴时试管架可以放进水浴锅中，但要保证水浴锅 的水可以没过试管中样品的位置。 -20oC冻着的样品取出后一定要完全化冻且混匀。
实验 碱性磷酸酶比活力测定
实验目的
掌握酶活性测定方法的一般原理方法
测定碱性磷酸酶制备各步骤酶制剂比活力
实验原理
酶活力：即是酶活性，是表示催化某一特定反应的
能力。可以用在一定条件下所催化的某一特定化学 反应速度表示。 酶催化的反应速度越快，酶活性越高，反之则愈低。 底物减少量或生成物增加量
6
0.6 0.2
8碱性磷酸酶比活力测定
（3）消得：K = E1cm1% 或１克分子浓度，１cm厚度溶液中测得：K = ξ C = D/E1cm%, 或 C = D/ξ
常用于紫外吸收法测定蛋白质，核酸含量，二者分 别在280nm和260nm处有最大吸收，其消光系数 可查到，在同样条件下，测定待测溶液的光密度, 带入上式即可求得C。
酶液（mL）
0.1 mol/L NaOH (mL) 酶液（mL） OD 405 nm
各管加入1.0 mL
各管加入0.2 mL
各0.50mL
混匀，37℃，5分钟
/
各0.1mL
37℃，精确反应10分钟
各管加入2.0 mL
0.1mL
蛋白浓度测定
1. 测定100 μg/mL牛血清白蛋白溶液的OD值； 2. 将稀释后的样品在280nm下测定吸光度； 3. 以洗脱液作空白。
蛋白浓度测定前处理
1、2号样品稀释100倍（用洗脱液稀释） 3号样品稀释20倍（用洗脱液稀释） 4号样品对倍稀释（用洗脱液稀释）
12支试管，1-4做两组平行测定管，01-04作为空白对照
管号 5 mM pNPP(mL)
空白（01-04） 1-1 2-2 各0.2mL
3-3 4-4
Na2CO3-NaHCO3 (mL) 20 mmol/L MgCl2 (mL) H2O (mL)
（二）、酶活力
在37C下，以5mmol/L pNPP为底物，在pH 10.1的
碳酸盐缓冲液含2 mmol/L Mg2+的测活体系中每分
钟催化产生1 mol/L pNP的酶量定为1个酶活力单 位。
酶的比活力定义为每mg蛋白所具有的酶活力单位 数。
酶活性测定前处理
1、2号样品稀释50倍（用洗脱液稀释） 3号样品稀释20倍（用洗脱液稀释） 4号样品不稀释（用洗脱液稀释）
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酶促反应进程曲线
•能够真正代表酶 活性大小的是线 性期的酶促反应 速度，即酶促反 应初速度。
酶促反应初速度
酶活性 酶的含量
• 问题4：
• 测酶活性应注意哪些方面？
酶最适反应条件的选择
• 合适的底物与最适底物浓度 • 底物浓度远远高于酶浓度 • 理想的缓冲液与最适离子强度 • 最适温度 • 最适pH • 合适的辅因子、激活剂浓度 • 合理的测定时间
引言（2）
• 一些酶在不同器官、组织、细胞内的分布和定 位存在明显差异，而且在细胞内外有明显浓度 梯度差。
• 正常情况下血浆中酶活性相对恒定。但一些病 理情况常导致血浆中酶活性的改变。性别、年 龄、运动、妊娠、人种及环境因素等可引起人 血浆中某些酶的生理性变化。
• 所以酶与其它指标相比具有更高中的浓度甚 至超过器官细胞内浓度。有的可以作为肝功能试 验的一部分。
• 血浆特异酶活性的改变，除了反映血液功能 外，还反映来源器官的功能。
（二）非血浆特异酶
• 在血浆中浓度很低，且无功能，分为两种。 • 1.分泌酶： • 来源于消化腺或其他外分泌腺的酶。如α-淀粉酶
• 连续监测法： （速率法）
• 连续监测法是指每隔一定时间（2～60s），连续多次测 定酶反应过程中某一反应产物或底物量随时间变化的数 据，求出酶反应初速度，间接计算酶活性浓度的方法。
• 适用于自动生化分析仪 • 能动态观测酶促反应进程，结果准确可靠，标本和试剂
用量少，可在较短时间内完成测定。
酶偶联测定法
（2）各种骨骼疾病。ALP主要由成骨细胞产生，故骨骼 病特别是有新生骨质生成时，血液内ALP活性增加，以 促进磷酸盐的沉积。如佝偻病、纤维性骨病、成骨不 全症、骨转移癌和骨折修复愈合期等均引起血清ALP活 力升高。
• 降低：主要见于呆小症，磷酸酶过少症等。
•问题2：
• 如何测定酶活性？
酶活性的概念
• 问题1：
• 为何要测定血清中酶的活性？有什 么意义？
引言（1）
• 酶活性测定是目前临床酶学分析最为常用的方 法。酶测定约占目前临床生化总工作量的1/4到 1/2。
• 用于诊断的酶类已超过100多种，常用的数十 种。
血浆酶的来源
血浆酶
血浆特异酶
外分泌酶
非血浆特异酶
细胞内酶
（一）血浆特异酶
• 在血浆中发挥特定催化作用的酶。如凝血酶、 胆碱酯酶（CHE）、脂蛋白脂肪酶、铜氧化酶等。
诊断常用血清酶
血清酶
符号
鸟氨酸氨基甲酰转移酶
OCT
卵磷脂胆固醇酰基转移酶 LCAT
谷氨酸脱氢酶
GLDH
山梨醇脱氢酶
SDH
丙氨酸氨基转移酶
ALT
异柠檬酸脱氢酶
ICD
-谷氨酰转肽酶
-GT
5ˊ-核苷酸酶
5ˊ-NT
单胺氧化酶
MAO
天门冬氨酸氨基转移酶 AST
肌酸激酶
CK
乳酸脱氢酶
LDH
碱性磷酸酶
ALP
• 碱性磷酸酶在碱性环境中有最大活力。
问题1:为什么要测定碱性磷酸酶的活性？有什 么意义？
1.生理性增加：如儿童、妊娠期、进食高糖、高脂肪 食物等均可使血清ALP活性增高。
2.病理性改变： • 升高
（1）肝胆疾病。主要见于阻塞性黄疸，急、慢性黄疸 性肝炎，肝癌等均可引起血清ALP活力不同程度的升高， 其中以癌性梗阻最明显。
断。
• 当肝脏受到损伤或者障碍时经淋巴道和肝窦进入血液， 同时由于肝内胆道胆汁排泄障碍，反流入血而引起血清 碱性磷酸酶明显升高。
什么是ALP?
• 是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通 过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除 去，并生成磷酸根离子和自由的羟基，这类 底物包括核酸、蛋白、生物碱等。而该脱去 磷酸基团的过程称为去磷酸化或脱磷酸化。
（AMY）、前列腺酸性磷酸酶（ACP）、脂肪酶 （LPS）、胃蛋白酶原、胰蛋白酶原 、ALP等。 • 正常体液中外分泌酶活性低而稳定，不发生催化 作用。 • 在血液中的浓度和其分泌腺体的功能活动和疾病有 关，来源增加或排泄受阻时，血浆中此类酶活性增高。 例如，急性胰腺炎时，血淀粉酶就会升高。 •
• 2.代谢酶：（细胞酶） • 在细胞内发挥催化功能的酶。正常时这些
• 对于固定时间法，需在酶作用一段时间后，加入合适的 终止剂终止酶促反应。
• ALP几乎存在于机体各个组织，但以骨骼、牙齿、肝脏 和肾脏中含量较多，儿童期含量尤其多。
• ALP有六种同功酶。其中AKP1、AKP2、AKP6来自肝脏， AKP3来自骨细胞，AKP4产生于胎盘及癌细胞，而AKP5来 自小肠绒毛上皮与成纤维细胞。
• • 临床上测定ALP活性主要用于肝脏疾病和骨骼疾病的诊
酸性磷酸酶
ACP
淀粉酶
AMS
脂肪酶
LPS
来源
肝 肝 肝 肝 肝、肾、心 肝、胎盘、心 肝、胆、肾、小肠 肝、胆道 肝、肾、脑 心、肝、骨骼肌 骨骼肌、心、脑 心、肾、骨骼肌、肝、肺 骨骼、牙齿、肝、肾 前列腺、红细胞、血小板 胰、唾液腺 胰
碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP or AKP )
应用：对于底物或产物不能直接测定或难于准确测 定的酶促反应 。
Ex Ea Ei ABCP
式中A为底物，B、C为中间产物，P为产物（必须能够直接测定），Ex为待测酶， Ea、Ei都为工具酶。按照工具酶作用的不同， Ea又称为辅助酶，Ei又称为指示酶，C P称为指示反应。
• 问题3：
• 在酶促反应进程中，是否任一阶段的酶促反应速度 都可以代表酶活性？
酶存在于组织细胞中，血浆中酶活性很低。细 胞内、外浓度差异悬殊。 • 当酶来源的组织细胞发生病变，细胞膜通 透性增加或细胞坏死时，细胞内酶大量进入血 浆，导致血浆酶活性显著增高。其下降的临床 意义很少。 • 这一类酶临床应用较多，如转氨酶、乳酸脱氢 酶、肌酸激酶等，它们在肝病、心脏疾病时都 可能出现变化。
• 酶活性：酶催化某一化学反应的能力
• 常用单位时间内底物的减少量或产物的生 成量（即酶促反应速度）来表示酶活性大小
注：在实际测定酶促反应速度时，以测定单位 时间内产物的生成量为好。
酶活性的测定方法
• 固定时间法： （终点法）
• 通常是酶作用一段时间后，加入强酸、强碱、蛋白沉淀 剂等终止酶促反应，测定这段时间内底物的减少量或产 物的生成量，计算酶促反应的平均速度。