碱性磷酸酶米氏常数及活性的测定
AKP Km值测定
【实验操作】
1 2 3 4 5 6 7 管号 底物液 0.05 0.15 0.25 0.30 0.40 0.60 0.80
(0.04M) 碳酸缓 液(pH=10)
8 0.00
0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.95 0.85 0.75 0.70 0.60
0.90 0.90 0.40 0.20
VMAX
1/2VMAX
1/Vmax
1/[s]
[S] Km
-1/Km
底物浓度与反应速度关系曲线
双倒数曲线
【实验讨论】
比较两个值的大小,分析实验误差产生 的原因 比较两种Km测定方法各自的优缺点
0.90 1.00
蒸馏水
混匀后37℃水浴，预温5分钟左右
酶液
0.1 0.1
0.1
0.1
0.1
0.1 0.1
0.1
加入酶液后立即混匀（保持37℃水浴）， 反应开始。
从加入酶液起计时至下一步 加入碱性 溶液停止反应，各管反应时间应准确一 致，为15分钟。
碱性溶液
1.0 1.0
1.0 1.0
1.0
1.0
Vmax•[S] + 1/ Vmax
本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其 底物，生成酚和磷酸，酚在碱性溶液中与4一氨 基安替比林作用，经铁氰化钾氧化生成红色醌 的衍生物，根据红色的深浅可测出酶活力高低。 其反应式如下：
磷酸苯二钠+H2O AKP OH苯酚
苯酚+4-氨基安替比林 K3Fe(CN)6 醌衍生物 （红色）
碱性磷酸酶Km值 的测定
【实验目的】
1.了解酶的Km值测定原理和方法
2.掌握碱性磷酸酶（AKP）活性测
碱性磷酸酶的分离纯化及比活性与米氏常数测定
碱性磷酸酶的分离纯化及⽐活性与⽶⽒常数测定碱性磷酸酶的分离纯化及⽐活性与⽶⽒常数测定⼀、实验原理(1).碱性磷酸酶的分离纯化1.机械破碎法制备肝匀浆低浓度⼄酸钠：低渗破膜低浓度⼄酸镁：保护和稳定AKP2.有机溶剂沉淀法分离纯化AKP加⼊不同有机溶剂重复离⼼正丁醇：沉淀部分除AKP的蛋⽩质33%丙酮、30%⼄醇：溶解AKP50%丙酮、60%⼄醇：沉淀AKP(2).⽐活性测定1.⽐活性的定义*单位重量的蛋⽩质样品中所含的酶活性单位。
*通常⽤每毫克蛋⽩质具有的酶活性单位来表⽰。
*⽤以鉴定酶的纯化程度，是酶分离提纯完成的评价指标之⼀。
2.测定样品的⽐活性必须测定：*每毫升样品中的酶活性单位数。
*每毫升样品中的蛋⽩质毫克数。
3.磷酸苯⼆钠法测定碱性磷酸酶活性反应原理(3).⽶⽒常数测定K m即为⽶⽒常数，V max为最⼤反应速度＊如上式表⽰,⽶⽒常数是反应速度为最⼤值的⼀半时的底物浓度,因此,⽶⽒常数的单位为mol/L。
当反应速度等于最⼤速度⼀半时,即V = 1/2 V max, K m = [S]＊吸光度表⽰不同底物浓度时的酶反应速度。
以吸光度的倒数作纵坐标，以底物浓度的倒数作横坐标，按Lineweaver-Burk作图法可求出Km值。
⼆. 器材721分光光度计台式离⼼机恒温⽔浴锅微量移液器托盘天平匀浆器试管三.试剂1. 0.5mol/L醋酸镁溶液称取醋酸镁5.3625g溶于蒸馏⽔中,稀释⾄50ml.2. 0.1mol/L醋酸钠溶液称取醋酸钠0.0820g溶于蒸馏⽔中,稀释⾄10ml.3. 0.01mol/L醋酸镁---醋酸钠溶液取0.5mol/L醋酸镁溶液2ml及0.1mol/L醋酸钠溶溶液10ml,混合均匀后加蒸馏⽔稀释⾄100ml.4. 丙酮(分析纯).5. 95%⼄醇(分析纯).6. Tris缓冲液(Ph8.8) 称取Tris 6.05g,⽤蒸馏⽔溶解成50ml,为0.1mol/L Tris 液,取0.1mol/L Tris液10ml,加0.5mol/L醋酸镁2ml,加蒸馏⽔80ml,再⽤1%醋酸调pH⾄8.8,然后⽤蒸馏⽔稀释⾄100ml.7. 0.01mol/L基质液称取磷酸苯⼆钠(C6H5PO4Na2.2H2o)0.3g,4-氨基安替⽐林0.15g,分别溶于煮沸冷却后的蒸馏⽔中;两液混合并蒸馏⽔稀释⾄50ml,加0.2ml氯仿防腐,盛于棕⾊瓶中,冰箱内保存,可⽤⼀星期;临⽤时与等量0.1mol/L pH10的碳酸盐缓冲液混合即可.8. 0.1mol/L pH10的碳酸盐缓冲液称取⽆⽔碳酸钠0.318g及碳酸氢钠0.168g溶于蒸馏⽔,稀释⾄50ml.9. 碱性溶液量取0.5mol/L氢氧化钠溶液与0.5mol/L碳酸氢钠溶液各20ml,混合后加蒸馏⽔⾄100ml.10. 0.5%铁氰化钾溶液称取铁氰化钾0.25g和硼酸0.75g,各溶于20ml蒸馏⽔中,溶解后两液混合均匀,再加蒸馏⽔⾄50ml,置棕⾊瓶中暗处保存.11. 0.1mol/L醋酸镁溶液称取醋酸镁0.2145g溶于蒸馏⽔中,稀释⾄10ml.12. 酚标准液(0.1mg/ml).四.实验步骤(1). “碱性磷酸酶分离纯化”实验操作(2).“碱性磷酸酶⽐活性测定”实验操作1.样品中碱性磷酸酶活性测定:(1).取5⽀试管,编号,按表1操作:表1A’B’C’D’标准空⽩各阶段稀释液(ml) 0.1 0.1 0.1 0.1 - -0.1mg/ml酚标准液(ml) - -- - 0.1 -pH8.8Tris缓冲液(ml) - - - - - 0.1置37℃⽔浴中保温5分钟复合基质液(ml) 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0混匀,37℃⽔浴中准确保温15分钟.保温结束后,各管⽴即加⼊1.0ml碱性溶液终⽌反应,再加⼊0.5%铁氰化物钾2.0ml,⽴即混匀,静置10min,在510nm波长下⽐⾊测定.2.酶活性单位计算每毫升酶液中酶活性单位=测定OD/标准OD X标准管中酚含量X1/0.1X稀释倍数3.样品中蛋⽩质含量的测定(1)测定蛋⽩质时,保留的A’管还需稀释5倍为A’’管,否则蛋⽩质浓度太⾼,其余各管不需再稀释,各⽤1.0ml进⾏测定.表2A’’B’C’D’空⽩各阶段稀释液(ml) 1.01.01.01.0 -0.1mg/ml酚标准液(ml) - -- -1.0pH8.8Tris缓冲液(ml) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0混匀,置20~25℃⽔浴中保温10分钟复合基质液(ml) 0.50.50.50.50.5(2)⽴即振摇均匀,在20~25℃保温30min后,于650nm波长处⽐⾊.(3)蛋⽩质浓度计算:从Lowry法标准曲线查得的蛋⽩质毫克数,乘以稀释倍数,即为每毫升样品中蛋⽩质毫克数.4.⽐活性及得率计算碱性磷酸酶⽐活性=每毫升样品中碱性磷酸酶活性单位数/每毫升样品中蛋⽩质毫克数纯化倍数=各阶段⽐活性数/匀浆(A液)⽐活性数得率=各阶段酶的总活性单位/匀浆(A液)中的酶的总活性单位X100%5.实验结果将上述各实验计算结果填⼊表3内.表3分离总体积蛋⽩质总蛋⽩每毫升酶总活性⽐活性纯化得率阶段(ml) 浓度(mg) 活性单位单位(U/mg ) 倍数(%)(mg/ml) (U/ml) (U)匀浆(A液)第⼀次丙酮沉淀(B液)第⼆次丙酮沉淀(C液)第三次丙酮沉淀(D液)3．⽶⽒常数测定1. 取15只试管，按照下表操作，1～7号重复两组，0 号为空⽩对照。
碱性磷酸酶km值的测定
0. 1 0. 1 0. 1 0. 1 0. 1 0. 1 0. 1
加入酶液后立即混匀（保持37℃水浴） ，
混匀 ， 室温放置10分钟左右, 以8号管为 空白 ， 于5l0nm比色 ， 记录各管的光密度
碱性溶液 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
1 2 30.05 0. 150.90 0.900.95 0.85
管号底物液 (0 .04M)碳酸缓液 (pH= 10)蒸馏水
混匀后37℃水浴 ， 预温5分钟左右
【
】
反应开始。从加入酶液起计时至下一步 加入碱性 溶液停止反应 ， 各管反应时间应准确一 致 ， 为15分钟。
■ 比较两个值的大小,分析实验误差产生 的原因
底物浓度 mmol/L
1/ [S]
1/OD
【
】
4 5
1 2
8
6
3
3
5
7
1
1
/ OD510为纵轴作 图 ， 观察曲线形状； 查Km值■
s]为横轴，
■ 以
1
1
1/ [s- 1/Km
底物浓度与反应速度关系曲线
双倒数曲线
1/2VMAX
VMAX
[S]
的原因■ 比较两种Km测定方法各自的优缺点
/ km ， 据此可算出Km
1/ Vmax
距3;4-氨基安替比林 K3Fe(CN)6 (红色醌衍生物
:
:磷酸苯二钠+H2O
（红色
AKP
)
4 5 6 7 80.25 0.30 0.40 0.60 0.800.90 0.90 0.90 0.90 0.900.75 0.70 0.60 0.40 0.20
4-氨基安 替比林铁氰化钾
实验三-碱性磷酸酶米氏常数的测定
Lineweaver - Burk根据米氏方程，推导出如下直线方程式：（双倒数方程）
—1— = —K—m— ·—1— + —1—
V
Vmax [S] Vmax
以不同的底物浓度—1—为横坐标，
[S]
以—1—为纵坐标，
V
此直线与横轴相交的负截距为-
—1—，
Km
由此可以正确求得酶的Km值。
蒸馏水/mL
1.10 1.00 0.90 0.80 0.40 1.20
37℃水浴5min
血清/mL
0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10
最终基质浓度（[S]）
2.00 4.00 6.00
8.00 16.00 0.00
37℃Байду номын сангаас温15min
碱性溶液/mL
1.1
1.1
1.1
1.1
1.1
0.5％ 铁氰化钾、0.3％ 4-氨基安替比林、酚标准液（0.1mg/mL） • 器材：恒温水浴锅、可见光分光光度计、移液枪
四、实验步骤
一． 酚标准曲线的绘制
(1) 取洁净干燥试管6支，按下表依次加入试剂。
管号
1
2
3
4
5
6
0.1mg/mL 酚标准溶液/mL
0.0
0.05 0.10 0.20 0.30 0.40
蒸馏水/mL
2.0 1.95 1.90 1.80 1.70 1.60
37℃水浴5min
碱性溶液/mL
1.10 1.10 1.10 1.10 1.10 1.10
0.3% 4-氨基安替比林/mL
1.0
1.0
碱性磷酸酶km值测定实验报告
碱性磷酸酶km值测定实验报告碱性磷酸酶 Km 值测定实验报告一、实验目的1、掌握测定碱性磷酸酶（ALP）Km 值的原理和方法。
2、了解底物浓度对酶促反应速度的影响。
3、熟悉分光光度计的使用。
二、实验原理碱性磷酸酶是一种广泛分布于人体各脏器器官中的酶，在骨、肝、肠、胎盘等组织中含量较高。
它能催化磷酸酯的水解反应，产生无机磷酸和醇、酚等物质。
在酶促反应中，反应速度（v）与底物浓度S之间的关系可用米氏方程表示：v ＝ VmaxS ／（Km ＋ S) ，其中 Vmax 为最大反应速度，Km 为米氏常数。
Km 值是酶的一个重要特征常数，它表示酶与底物的亲和力。
Km 值越小，酶与底物的亲和力越大；反之，Km 值越大，酶与底物的亲和力越小。
本实验通过测定不同底物浓度下的酶促反应速度，以反应速度 v 对底物浓度S作图，通过双倒数作图法（LineweaverBurk 作图法），即1/v 对 1/S作图，可求得碱性磷酸酶的 Km 值。
三、实验材料与仪器1、材料碱性磷酸酶提取液磷酸苯二钠溶液（不同浓度）01mol/L 氢氧化钠溶液004mol/L 碳酸钠溶液05mol/L 三氯乙酸溶液2、仪器分光光度计恒温水浴锅移液器试管、刻度吸管等四、实验步骤1、准备试剂配制不同浓度的磷酸苯二钠溶液：0005mol/L、001mol/L、002mol/L、003mol/L、004mol/L。
配制显色剂：将 01mol/L 氢氧化钠溶液和 004mol/L 碳酸钠溶液按4:1 的体积比混合。
2、反应体系设置取 7 支干净的试管，按下表加入试剂：｜试管编号|1|2|3|4|5|6|7|｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜磷酸苯二钠溶液（mL）｜000|020|040|060|080|100|＿____|｜蒸馏水（mL）｜100|080|060|040|020|000|＿____|｜37℃预温5min 后，各加入05mL 碱性磷酸酶提取液，立即混匀，37℃水浴准确反应 15min|｜反应结束后，各加入 05mL 05mol/L 三氯乙酸溶液终止反应|3、显色与比色各管加入 45mL 显色剂，充分摇匀。
碱性磷酸酶Km值的测定
1.0
1.0
1.0 1.0
1.0 1.0
1.0
1.0
4-氨基安 替比林
1.0 1.0
铁氰化钾
2.0 2.0
2.0Leabharlann 2.02.02.0 2.0
2.0
混匀，室温放置10分钟左右, 以8号管为 空白，于5l0nm比色，记录各管的光密度
【实验结果】
1、原始数据
结果记录 OD 1 2 3 4 5 6 7 8
底物浓度 mmol/L
【实验操作】
1 2 3 4 5 6 7 8 管号 底物液 0.05 0.15 0.25 0.30 0.40 0.60 0.80 0.00
(0.04M) 碳酸缓 液(pH=10)
0.90 0.90 0.95 0.85
0.90 0.90 0.75 0.70
0.90 0.60
0.90 0.90 0.40 0.20
Vmax•[S] + 1/ Vmax
本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其 底物，生成酚和磷酸，酚在碱性溶液中与4一氨 基安替比林作用，经铁氰化钾氧化生成红色醌 的衍生物，根据红色的深浅可测出酶活力高低。 其反应式如下：
磷酸苯二钠+H2O AKP OH苯酚
苯酚+4-氨基安替比林 K3Fe(CN)6 醌衍生物 （红色）
Vmax•[S]
V=
Km + [S]
其中Km为米氏常数， Vmax为最大反应速度， 当V=Vmax/2时，则Km=[s]。 Km是酶的特征常数，测定Km是研究酶 的一种方法
将米氏方程变形为双倒数方程，以l/ v －1／[s]作图，将各点连线，在横轴截 距为-／km，据此可算出Km值。
碱性磷酸酶米氏常数的测定-3学时
2.列表：吸光度、1/A、1/[S]
3.作双倒数图，由图得出Km值。
（一） Km值测定的意义
1.当反应速度为最大速度一半时，Vm = 1/2 Vmax，Km = [S] Km是指底物的浓度，含义：Km值等于酶促反应速度为最 大速度一半时的底物浓度。
2. Km值可表示酶对底物的亲和力。 Km值愈小，酶与底物的亲和力愈大；表示不需要很高的
此式为直线方程，以不同的底物浓度1/[S]为横坐标， 以1/V为纵坐标，并将各点连成一直线，向纵轴方向延长， 此线与横轴相交的负截距为-1/ Km，由此可以正确求得该酶 的Km值，如图所示。
本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同底物浓度
的反应速度，再根据Lineweaver-Burk法作图，计算 其Km值。
(4)各管分别加入0.3％ 4-氨基安替比林1.0mL，0.5％ 铁氰化钾2.0mL，充分混匀，放置10分钟，以6号空 白管作对照，于510nm波长处比色测定。
(5)以各管基质浓度的倒数1/[S]为横坐标，以各管吸 光度的倒数作为1/V作纵坐标，作图求出Km值。
[结果与计算]
1.记录各管吸光度（A）
三、[试剂与器材]
1．0.04mol/L 基质液 2．0.1mol／L碳酸盐缓冲液pH10(37℃) 3．碱性溶液 4．0.5％铁氰化钾 5．0.3％ 4-氨基安替比林 6．37℃恒温水浴锅 7．可见光分光光度计
碱性磷酸酶Km值的测定-毕业论文-
12
mmol/L
78
16
0
1/[S] 1 0.333 0.200 0.167 0.125 0.083 0.063 1/OD
2、作图
■ 以 [s ]为横轴，OD510为纵横作图，观 察曲线形状；查Km值
■ 以1／［s]为横轴，1／OD510为纵轴作图 观察曲线形状；查Km值
■ 比较两个值的差异.
OD510
管号 1 2 3 4 5 6 7 8 底物液 0.05 0.15 0.25 0.30 0.40 0.60 0.80 0
(0.04M)
碳酸缓 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0
液(pH=10)
蒸馏水 0.95 0.85 0.75 0.70 0.60 0.40 0.20 1
■ 本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其 底物，生成酚和磷酸，酚在碱性溶液中与4一氨 基安替比林作用，经铁氰化钾氧化生成红色醌 的衍生物，根据红色的深浅可测出酶活力高低 其反应式如下：
磷酸苯二钠+H2O Fra bibliotekKP OH- 苯酚
苯酚+4-氨基安替比林 K3Fe(CN)6 醌衍生物 （红色）
【实验操作】
碱性磷酸酶Km值 的测定
【实验目的】
■ 1 . 了解酶的Km值测定原理和方法
■ 2．掌握碱性磷酸酶（AKP）活性 测定的原理和方法
【实验原理】
■ 在温度，PH及酶浓度恒定的条件下，酶促 反应的初速度随底物浓度（S）增大而增加 但当底物浓度增大到一定极限时，则反应 速度趋于恒定，此最大反应速度Vmax，反 应速度与底物浓度之间的关系可用米氏方 程来表示，即：
1/OD510
VMAX
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[结果与计算] 在37℃保温15分钟，每生成1mg酚为一个酶 活性单位，以标准曲线查出释放酚量(μg)即可 算出酶活性。
100mL血清中酶活性 = 释放的酚量×（1/0.1）×100× （1/1000）=释放的酚量（μg） （释放酚量（μg）、1/0.1--0.1为实际取血清0.1ml、 100为100ml血清、1000为μg变为mg。）
此式为直线方程，以不同的底物浓度1/[S]为横坐 标，以1/V为纵坐标，并将各点连成一直线，向纵轴方 向延长，此线与横轴相交的负截距为-1/ Km，由此可以 正确求得该酶的Km值，如图所示。
本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同底物浓度 的酶活性，再根据Lineweaver-Burk法作图，计算 其Km值。 可以作为碱性磷酸酶底物的物质很多，底物反 应的酶对于不同的底物有不同的Km值。本实验以磷 酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游 离酚和磷酸盐。酚在碱性条件下与4-氨基安替比林 作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜 色深浅和酚的含量成正比。根据吸光度的大小可以 计算出酶的活性，也可以从标准曲线上查知酚的含 量，进而算出酶活性的大小。反应式如下：
(4)各管分别加入0.3％ 4-氨基安替比林 1.OmL，0.5％ 铁氰化钾2.0mL，充分混 匀，放置10分钟，以6号空白管作对照， 于510nm波长处比色测定，根据酚标准 曲线计算酶活性。 (5)以各管基质浓度的倒数1/[S]为横坐 标，以各管吸光度的倒数或者以酶活性 单位的倒数1/V作纵坐标，作图求出Km 值。
底物浓度与酶促反应速度的这种关系可用 Michaelis-Menten方程式表示。
V = Vmax[S]/(Km+[S])
上式中Vmax为最大反应速度，[S]为底物浓度，Km为米 氏常数(Michaelis constant)，而其中V则表示反应的 起始速度。当V= Vmax/2时，Km =[S]。所以米氏常数是 反应速度等于最大反应速度一半时底物的浓度。因此 Km 的单位以摩尔浓度(mol／L)表示。 Km是酶的最重要的特征性常数，测定Km值是研究酶动力学 的一种重要方法，大多数酶的Km值在0.01-100(mmol/L) 间。
1.写出林贝方程 2.简要叙述碱性磷酸酶Km测定方法
碱性磷酸酶米氏常数的测定
浙江中医药大学生命科学学院 生物化学教研室
[目的与要求] 1. 通过碱性磷酸酶米氏常数的测定，了解其测定方 法及意义。 2. 学会运用标准曲线测定酶的活性，加深对酶促反 应动力学的理解。
[原理]
酶催化底物发生反应时，受多种因素影响，环境 的温度、pH和酶的浓度等等，在环境的温度、pH和 酶的浓度一定时，酶促反应速度与底物浓度之间的 关系表现在反应开始时。酶促反应的速度(V)随底 物浓度(S)的增加而迅速增加。若继续增加底物浓 度，反应速度的增加率将减少。当底物浓度增加到 某种程度时，反应速度会达到一个极限值，即最大 反应速度(Vmax)，如图37所示
[注意事项] 1．血清取量要准确 2．标准曲线必须是一条直线
（一）
Km值测定的意义
1.当反应速度为最大速度一半时，Vm = 1/2 Vmax，Km = [S] Km是指底物的浓度，含义：Km值等于酶促反应速度为最大 速度一半时的底物浓度。 2. Km值可表示酶对底物的亲和力。 Km值愈小，酶与底物的亲和力愈大；表示不需要很高的 底物浓度便可容易地达到最大反应速度。 3.Km值是酶的特征性常数之一，只与酶的结构、酶所催化的底物 和反应环境相关，与酶的浓度无关。 各种酶的Km值范围很广。大多数酶在0.01-100mmol/L间；对于同 一底物，不同的酶有不同的Km值；多底物反应的酶对于不同底 物也有不同的Km值。
0
5
10
20
30
40
(2)混匀后室温放置15分钟，于510nm波长处比色。 (3)以酚含量(μg)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制 酚标准曲线
2. 底物浓度对酶促反应速度的影响
最终基质浓度单位：µmol/ml (2)加入血清后，各管混匀并且立即记录时间，将上 述各管置37℃水浴中准确保温15分钟。 (3)保温结束，立即加碱性溶液1.1mL终止反应。
（二）酶活性（U/L） 1. 酶活性单位：在特定条件下，酶促反应在 单位时间内生成一定量的产物或消耗一定 量的底物所需的酶量。 2. 酶活性国际单位（IU）：按照国际酶学会 议的规定，1个酶活力单位是指在25℃、测 量的最适条件（指最适pH、温度等）下，1 分钟内能引起1微摩尔底物转化的酶量。
课后复习题
三、[试剂与器材] 1．0.04mol/L 基质液 2．0.1mol／L碳酸盐缓冲液pH10(37℃) 3．碱性溶液 4．0.5％铁氰化钾 5．0.3％ 4-氨基安替比林 6．酚标准液(0.1mg/mL) 7．37℃恒温水浴锅 8．可见光分光光度计
四、[操作步骤] 1．酚标准曲线的绘制 ：
酚含量（μg）：
酶促反应的最大速度Vmax实际上不易准确测定， Km值也就不易准确测出。林-贝 (1ineweaver Burk)根据Michaelis-Menten方程，推导出如下方 程式，即：(两边取倒数） 1/V = （Km +[S]）/ Vmax[S] 或1/V = Km/ Vmax· （1/[S]）+1/ Vmax (得类似：y=ax+b的直线方程 ） y = 1/V， a = Km/ Vmax， x = 1/[S] b = 1/ Vmax