蛋白质纯化方法及问题解答
蛋白质纯化知识详解
蛋白质纯化知识详解一、蛋白纯化原则蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。
每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。
蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段。
一般蛋白纯化采用的方法为树脂法。
粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如DNA、RNA等分开，由于此时样本体积大、成分杂，要求所用的树脂高容量、高流速、颗粒大、粒径分布宽，并可以迅速将蛋白与污染物分开，必要时可加入相应的保护剂（例如蛋白酶抑制剂），防止目的蛋白被降解。
精细纯化阶段则需要更高的分辨率，此阶段是要把目的蛋白与那些分子量大小及理化性质接近的蛋白区分开来，要用更小的树脂颗粒以提高分辨率，常用离子交换柱和疏水柱，应用时要综合考虑树脂的选择性和柱效两个因素。
选择性指树脂与目的蛋白结合的特异性，柱效则是指各蛋白成分逐个从树脂上集中洗脱的能力，洗脱峰越窄，柱效越好。
仅有好的选择性，洗脱峰太宽，蛋白照样不能有效分离。
二、纯化程序分离纯化某一特定蛋白质的一般程序可以分为前处理、粗分级、细分级三步。
1、前处理分离纯化某种蛋白质，首先要把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来并保持原来的天然状态，不丢失生物活性。
为此，动物材料应先剔除结缔组织和脂肪组织，种子材料应先去壳甚至去种皮以免受单宁等物质的污染，油料种子最好先用低沸点的有机溶剂如乙醚等脱脂。
然后根据不同的情况，选择适当的方法，将组织和细胞破碎。
动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆机破碎或用超声波处理破碎。
植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁，一般需要用石英砂或玻璃粉和适当的提取液一起研磨的方法或用纤维素酶处理也能达到目的。
细菌细胞的破碎比较麻烦，因为整个细菌细胞壁的骨架实际上是一个借共价键连接而成的肽聚糖囊状大分子，非常坚韧。
简述蛋白质分离纯化的基本方法
简述蛋白质分离纯化的基本方法蛋白质是有机体重要的组成部分，由氨基酸编码，执行了多种生物功能，例如促进新陈代谢，生物合成，免疫等。
为了获得高纯度的蛋白质，必须将其从其他成分中分离和纯化。
这就是蛋白质纯化。
蛋白质纯化的基本方法包括：一、分子大小法蛋白质主要通过分子过滤器来分离和纯化。
该过程基于分子间的亲和性原理，通过过滤器膜的通透性以及不同蛋白质的大小差异将蛋白质从溶液中分离出来。
二、萃取技术萃取技术是基于蛋白质的共沉淀特性，通过不同的有机溶剂来区分和分离蛋白质，将沉淀的蛋白组分收集后，再进行精细回收。
三、离子交换技术离子交换技术也是基于蛋白质的离子属性，采用各类加压装置，以及特殊离子交换模块以及合成模块，来实现将收集物分离筛选后回收。
四、双模立体技术双模立体技术是采用两种不同的液体体系，如水基和有机溶剂基，在不同的状态或浓度下对蛋白质进行再离析技术，从而实现蛋白质的有效分离纯化。
五、凝胶精分技术凝胶精分技术是改良和发展起来的一种新型蛋白质分离纯化技术，主要基于交叉链结构，可以基本上实现同一类分子配体分子完整地分离纯化。
六、共晶引擎技术共晶引擎技术可基于共晶相邻能量差异，通过电荷，配体结合等不同形式来改变分子的邻近能量，从而有效的将蛋白质分离出来。
以上就是蛋白质分离纯化的基本方法，可以从不同的角度神明蛋白质的性质，以达到有效的提纯的目的。
蛋白质的分离纯化对解析有机体内蛋白质的结构和功能，也极为重要。
目前，已经有很多高级的技术和模块来实现蛋白质分离纯化，例如蛋白质分子调控，杂交等。
通过有效利用上述方法，可以有效精细和完整得提纯高纯度的蛋白质。
蛋白质的分离纯化方法(参考资料)
蛋白质的分离纯化方法2.1根据分子大小不同进行分离纯化蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。
根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。
透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。
透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。
超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。
这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。
它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。
由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。
所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。
当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。
例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3]。
使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心。
常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。
可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。
密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低。
蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。
凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。
凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。
四种蛋白纯化方法
四种蛋白纯化方法1. 溶液沉淀法溶液沉淀法是一种常用的蛋白纯化方法，适用于从复杂的混合物中分离目标蛋白。
该方法基于蛋白质在不同条件下的溶解度差异，通过添加盐类或有机溶剂来诱导蛋白质的沉淀。
步骤：1.样品制备：将待纯化的样品经过初步处理，如细胞破碎、组织切割等，得到含有目标蛋白的混合物。
2.溶解度测试：在不同条件下（如pH、温度、盐浓度等）测试目标蛋白质的溶解度，并确定最适合其沉淀的条件。
3.沉淀：根据前一步骤确定的最佳条件，向样品中添加盐类或有机溶剂，使目标蛋白质发生沉淀。
可以通过离心将沉淀物与上清液分离。
4.溶解：将沉淀物重新溶解在适当的缓冲液中，得到纯化后的目标蛋白。
优点：•简单易行，不需要复杂的设备和操作。
•适用于从复杂混合物中纯化目标蛋白。
缺点：•可能会导致非特异性沉淀，使得纯化后的蛋白含有杂质。
•沉淀方法对蛋白质的溶解度要求较高，不适用于所有蛋白。
2. 凝胶过滤法凝胶过滤法是一种基于分子大小的蛋白纯化方法，适用于分离不同分子量范围的蛋白。
该方法利用孔径可调的凝胶柱或膜来分离目标蛋白和其他小分子。
步骤：1.样品制备：将待纯化的样品经过初步处理，如细胞破碎、组织切割等，得到含有目标蛋白的混合物。
2.凝胶柱选择：根据目标蛋白的分子量范围选择合适孔径的凝胶柱或膜。
3.样品加载：将样品加载到凝胶柱上，并使用缓冲液进行洗涤，以去除小分子。
4.蛋白洗脱：通过改变缓冲液的组成或pH值，使目标蛋白从凝胶柱上洗脱下来。
5.收集纯化蛋白：将洗脱得到的蛋白收集起来，即可得到纯化后的目标蛋白。
优点：•可以根据分子量范围选择合适的凝胶柱，实现高效分离。
•纯化后的蛋白质纯度较高。
缺点：•操作相对复杂，需要一定的专业知识和技术。
•只适用于分子量差异较大的目标蛋白。
3. 亲和层析法亲和层析法是一种基于生物分子间特异性相互作用的蛋白纯化方法，适用于富含目标蛋白的混合物。
该方法利用目标蛋白与特定配体之间的亲和力进行分离和纯化。
蛋白纯化面试知识问答
蛋白纯化面试知识问答什么是蛋白纯化？蛋白纯化是指从复杂的混合物中分离出目标蛋白质的过程。
蛋白纯化的目的是获得高纯度的目标蛋白质，以便于进一步的研究和应用。
为什么需要蛋白纯化？蛋白质在生物学和生物技术研究中起着重要的作用，但在生物体内存在大量其它分子，如其他蛋白质、核酸、小分子等。
为了研究和利用目标蛋白质，需要将其从复杂的混合物中分离出来，获得高纯度的样品。
蛋白纯化的步骤有哪些？蛋白纯化通常包括以下步骤：1.细胞破碎：将含有目标蛋白质的细胞破碎，释放蛋白质。
2.澄清：通过离心等方法去除细胞碎片、细胞核和细胞器等杂质。
3.分离：利用不同的分离技术，如层析、电泳等，将目标蛋白质与其他蛋白质分离。
4.纯化：通过进一步的分离步骤，获得高纯度的目标蛋白质。
5.洗脱：将目标蛋白质从分离介质中洗脱。
6.浓缩：将洗脱的目标蛋白质浓缩得到较小的体积。
常用的蛋白纯化技术有哪些？常用的蛋白纯化技术包括：1.柱层析：包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。
根据目标蛋白质的性质选择不同的柱层析方法。
2.电泳技术：包括凝胶电泳、等电聚焦等。
通过蛋白质的电荷、大小和形状等特性进行分离。
3.过滤技术：包括超滤、微滤等。
根据蛋白质的大小选择合适的滤膜进行分离。
什么是亲和层析？亲和层析是一种利用目标蛋白质与特定配体之间的亲和力进行蛋白纯化的技术。
亲和层析常用于从复杂的混合物中高效选择性地纯化目标蛋白质。
亲和层析的原理是什么？亲和层析的原理是利用目标蛋白质与配体之间的特异性相互作用。
配体可以是金属离子、抗体、亲和标签等，通过与目标蛋白质结合，实现目标蛋白质的分离纯化。
亲和层析的步骤有哪些？亲和层析通常包括以下步骤：1.准备亲和树脂：将具有亲和配体的树脂填充到柱子中。
2.样品加载：将样品溶液加到亲和树脂柱上，使目标蛋白质与配体结合。
3.洗脱：通过改变洗脱缓冲液的条件，将目标蛋白质从亲和树脂上洗脱下来。
4.收集纯化的目标蛋白质溶液。
什么是凝胶过滤层析？凝胶过滤层析是一种基于蛋白质大小分离的蛋白纯化技术。
蛋白质表达与纯化常见问题解答
蛋白质表达与纯化常见问题解答蛋白质表达与纯化是生物科学研究中常见的实验技术，用于研究蛋白质的结构、功能和相互作用等。
然而，在进行蛋白质表达与纯化实验时，常常会遇到一些问题。
本文将针对蛋白质表达与纯化过程中的常见问题进行解答，帮助读者更好地进行实验和解决实验中可能遇到的困难。
一、蛋白质表达问题解答1. 为什么我的目的蛋白质在大肠杆菌中表达得不好？蛋白质表达的成功与多种因素相关，包括宿主菌的选择、启动子的选择、表达载体的构建等。
首先，确认宿主菌是否合适，某些蛋白质可能需要使用其他细菌或真核细胞进行表达。
其次，选择合适的启动子和表达载体，确保表达水平能够满足需求。
另外，光照条件、温度、培养基的选择等也会对表达效果产生影响。
2. 我应该选择哪种表达载体？选择表达载体应根据实验需求来定。
一般来说，常用的表达载体有质粒和病毒载体。
质粒表达系统适用于小规模表达和纯化，而病毒载体表达系统适用于大规模表达和高效表达。
另外，如果需要对蛋白质进行特定修饰，如标记或融合蛋白表达，可选择相应的表达载体。
3. 如何对表达后的蛋白质进行检测？常用的蛋白质检测方法有SDS-PAGE、Western blot和质谱分析等。
SDS-PAGE能够分析蛋白质的分子量和纯度，Western blot可以检测特定蛋白质的表达水平，质谱则可以确定蛋白质的分子量和结构。
根据实验需求选择合适的方法进行检测。
二、蛋白质纯化问题解答1. 我应该选择哪种纯化方法？选择纯化方法取决于蛋白质的性质和需求。
常见的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。
亲和层析适用于具有特异结合能力的配体，离子交换层析适用于根据蛋白质电荷差异进行分离，凝胶过滤层析适用于根据蛋白质的分子量进行分离。
根据蛋白质的特性选择合适的纯化方法。
2. 如何确定纯化效果？纯化效果可通过测定蛋白质的比活性、比强度和纯度来确定。
比活性和比强度分别指的是单位反应物质的相应活性或强度，纯度则指的是蛋白质在总样品中所占的比例。
四种蛋白纯化方式的原理及优缺点的简述
一.分子筛（凝胶层析）原理：用一般的柱层析方法使相对分子质量不同的溶质通过具有分子筛性质的固定相（凝胶），从而使蛋白质分离。
优点：1.洗脱条件简单，往往只需要一种缓冲溶液，可以使用任何缓冲液。
2.实验操作相对简单3.条件温和，对蛋白活性保持率高4.既可以对标签蛋白纯化也可以对非标签蛋白纯化。
缺点：1. 工艺放大困难：分子筛层析无法遵循线性放大原则，即使遵循柱床高度不变的原则，工艺流速如何进行调整，也是需要面临的问题。
2. 层析柱装填困难3.对上样量有要求4.测定柱效困难5.反复使用层析柱困难二.亲和层析原理：亲和层析是一种吸附层析，亲和层析利用固相介质中的配基与混合生物分子之间亲和能力不同而进行分离，当蛋白混合液通过层析柱时，与配基能够特异性结合的蛋白质就会被吸附固定在层析柱中，其他的蛋白质对配体不具有特异性的结合能力，将通过柱子洗脱下来，这种结合在一定条件下是可逆的，选用适当的洗脱液，改变缓冲液的离子强度和pH 值或者选择更强的配体结合溶液将结合的蛋白质洗脱下来，而无亲和力的蛋白质最先流出层析柱。
优点:1. 亲和层析法是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。
2. 是最有效的生物活性物质纯化方法，它对生物分子选择性的吸附和分离，可以取得很高的纯化倍数。
此外蛋白在纯化过程中得到浓缩，结合到亲和配基后，性质更加稳定，其结果提高了活性回收率。
此外它可以减少纯化步骤，缩短纯化时间，对不稳定蛋白的纯化十分有利。
缺点：1.除特异性的吸附外，仍然会因分子的错误认别和分子间非选择性的作用力而吸附一些杂蛋白质，另洗脱过程中的配体不可避免的脱落进入分离体系。
2. 载体较昂贵，机械强度低，配基制备困难，有的配基本身要经过分离纯化，配基与载体耦联条件激烈等。
三.离子交换层析原理：离子交换层析根据样品表面电荷不同进行分离纯化的技术，根据不同蛋白样品在同一Ph条件下所带电荷正负以及带电荷量不同而将不同蛋白样品分离。
蛋白质的纯化的方法及原理
蛋白质的纯化的方法及原理蛋白质的纯化是从其来源中去除其他有机物和无机物，使其成为纯净的蛋白质样品的过程。
蛋白质纯化的方法可以根据需要选择，其中常用的方法包括盐析、凝胶过滤、电泳、金属柱层析、亲和层析、离子交换层析、逆相高效液相色谱等。
下面将详细介绍这些方法及其原理。
一、盐析盐析是利用不同浓度的盐溶液对蛋白质溶液进行逐渐稀释，从而使蛋白质发生沉淀的过程。
纯化蛋白质的关键是利用蛋白质与溶剂中离子之间的相互作用来控制蛋白质的溶解和沉淀过程。
在盐析中，通过选择离子强度和种类可以调整蛋白质溶液中所需溶剂化离子的浓度，达到沉淀和纯化蛋白质的目的。
二、凝胶过滤凝胶过滤是一种分子筛分离方法，利用不同孔径的凝胶进行分离。
凝胶的孔径能够排除较大分子，如核酸和细胞碎片，而较小分子，如蛋白质则能通过孔隙，实现纯化。
该方法简单易行，不需要任何特殊设备，适用于中小分子量的蛋白质纯化。
三、电泳电泳是利用蛋白质在电场中的移动性差异进行分离和纯化的方法。
常用的电泳方法有平板电泳、SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）和Western blotting （免疫印迹法）等。
电泳能够根据蛋白质的电荷、分子大小和不同的电场力，在凝胶中分离蛋白质，使其形成带状。
通过切割所需蛋白质的带状区域，可以实现对目标蛋白质的纯化。
四、金属柱层析金属柱层析是利用金属离子与蛋白质之间的亲和性进行分离的方法。
金属柱通常被配制成金属离子亲和基质，并固定在柱子上。
目标蛋白质通过与金属离子发生亲和作用而被保留在柱中，其他杂质则从柱中流出。
通过调节洗脱缓冲液的离子浓度和pH值，可实现对目标蛋白质的纯化。
五、亲和层析亲和层析是利用配体与其特异性结合的蛋白质进行分离和纯化的方法。
通常将配体固定在柱子上，待蛋白质样品通过柱子时，目标蛋白质与配体结合，其他杂质则流失。
通过改变洗脱缓冲液的条件，如离子浓度、pH值和络合剂的添加，可以实现目标蛋白质的纯化。
六、离子交换层析离子交换层析是一种利用蛋白质与离子交换基质之间的相互作用进行分离和纯化的方法。
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蛋白质纯化一．可溶性蛋白的纯化1. 盐析硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。
用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。
高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。
各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。
这种方法称之为盐析。
盐浓度通常用饱和度来表示。
硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。
硫酸铵分级沉淀的方法其实很简单，一般就是用浓度从低到高的硫酸铵去沉淀蛋白，可以直接在液体里加固体的硫酸铵就可以，到一定的浓度离心沉淀，上清继续加硫酸铵，再离心，上清再加硫酸铵，然后用电泳检测或者活性检测沉淀的效果。
2. 亲和纯化2.1. Ni柱纯化2.1.1．Ni柱纯化操作流程1. 蛋白质上清与Ni柱填料在4℃下进行充分旋转混合(≥60 min)；也可以让上清液缓慢流经Ni柱（≥6 sec/drop）。
2. 上清与填料混合后，低速离心（≤ 500 x g），吸去大部分上清，然后将填料悬起，加入柱子中。
也可以直接上柱。
3. 上样后先用5-10 柱体积（CV）的lysis buffer冲洗不结合的杂蛋白，然后再用低浓度的咪唑洗去弱结合的杂蛋白。
在不知道清洗条件时可以进行咪唑浓度梯度洗脱（如10，20，30，40，50 mM），然后在纯度和得率之间选择最合适的咪唑浓度来进行清洗。
4. 清洗结束后，用高浓度咪唑（如200 mM）洗脱目的蛋白质。
5. 洗脱下来的目的蛋白质除电泳留样外，透析除去咪唑，并换成下一步所需的buffer。
6. 一般情况下his tag不需要切除。
当需要切除时：的蛋白质最少1）TEV：咪唑对其没有影响，可以在洗脱后直接酶切。
100 OD280的TEV切过夜，温度20或4℃（20℃的效率是4℃的三倍）。
可用1 OD2802) Thrombin：必须先除去咪唑才能进行酶切。
在1 x PBS中，10 U/mg蛋白质，4或20℃酶切过夜。
可适当加大酶量或延长酶切时间。
2.1.2．Ni柱纯化注意事项1．新的Ni柱填料存放于20%乙醇中（体积约为1:1）。
在取用前，请先估算目的蛋白质的量，再决定取用的填料体积（Qiagen的Ni-NTA Superflow最大结合能力为30 mg protein/ml beads）。
填料用量不要大大超过所需量，不然会结合较多的杂蛋白，难以清洗干净。
O冲洗，除去乙醇。
再2．新填料使用前，要先进行处理和平衡。
填料先用ddH2用至少5 CV的buffer进行平衡。
3. 在使用前后，要注意不能让填料放干，不然会影响纯化的效果。
O清洗，3. 每次使用结束后，填料用高浓度咪唑（如500 mM）清洗，再用ddH2最后保存在20%乙醇中。
4. 不推荐Ni柱在柱酶切，这样效率很低。
5. 多次使用后填料需再生。
再生步骤为：5 CV HO→ 3 CV 2% SDS→ 1 CV225% EtOH→ 1CV50% EtOH→ 1 CV75% EtOH→ 5 CV100% EtOH→1 CVO→ 5 CV 100 75% EtOH→ 1CV 50% EtOH→ 1 CV 25% EtOH→ 1 CV H2mM EDTA，pH8.0 →H2O→ 2 CV100 mM NiSO4→ 2 CV H2O→20% EtOH。
2.1.3. Q & A1. 目的蛋白质挂柱能力差？可能是由于所用buffer中含有过多的detergent或还原剂如 -ME等。
Ni柱填料和试剂兼容性请查阅手册。
还可能是由于蛋白质折叠不正常，或折叠时将his tag 包裹在内所致。
可以采用的方法是：1）控制破菌条件，不可以过于剧烈；2）改变buffer条件，可能有利于蛋白质折叠稳定；3）将his tag构建到蛋白质另一端。
2. 杂蛋白很多，无法清洗干净？解决方案有：采用更高浓度的咪唑进行清洗；在破菌或结合时加入少量咪唑（如10 mM）；减少填料使用量。
3. 蛋白质洗脱不下来？解决方案有：采用更高浓度的咪唑进行洗脱；更换buffer。
4. 蛋白质发生降解？更换蛋白质抑制剂，或多种抑制剂混合使用；截取其它truncates。
2.2. GST柱纯化2.2.1．GST柱纯化操作流程1. 蛋白质上清与GST填料在4℃下进行充分旋转混合，或可以让上清液缓慢流经GST柱（≥6 sec/drop）；2. 在充分混合后，将混有填料的上清load上柱子；3. 用大量的lysis buffer（1 x PBS）清洗GST柱，至没有杂蛋白流出（用bradford 检测）；4. 新鲜配制洗脱液：50 mM Tris-HCl, 10 mM reduced glutathione, pH 8.0。
将5-10CV的洗脱液加到柱子上，静置一段时间（如10 min），再缓慢流出（≥6 sec/drop）。
5. 洗脱后酶切：洗脱后的GST融合蛋白质溶液先透析除去reduced glutathione，然后加入PreScission或Thrombin进行酶切。
6. 在柱酶切：在洗脱之前，吸取beads，500 x g离心5 min，弃上清。
然后加入酶液，进行酶切。
PreScission：酶切buffer：50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, pH 7.5。
10 U/mg protein，5℃酶切4 hr。
可适当加大酶量或延长酶切时间。
Thrombin：在1 x PBS中，10 U/mg protein，4或20 ℃酶切过夜。
酶切结束后，用3-5 CV的1 x PBS冲洗柱子，收集目的蛋白质。
最后用洗脱液清洗beads上残余的GST和GST融合蛋白。
2.2.2．GST柱纯化注意事项1.GE的Glutathion Sepharose 4B Fast Flow最大结合能力为10 mg protein/ml beads。
2. GST填料使用前用至少5 CV的buffer平衡，buffer的pH范围为：6.5—8.0。
3. GST填料机械强度较差，所以在混合时要注意控制力度和时间。
O 4. 洗脱后，GST填料可用6 M盐酸胍或8 M尿素清洗，再生。
然后用ddH2清洗后浸泡在20%乙醇中。
2.2.3．Q & A1. 目的蛋白质挂柱能力差？解决方案有：1）保证充分混匀；2）检测蛋白质溶液的pH值是否在合适范围内；3）检查蛋白质溶液是否加入过多的DTT（> 1 mM）。
2. 目的蛋白质无法洗脱？提高reduced glutathione浓度，但注意不要改变pH值；延长洗脱时间，并不定期吹打；在洗脱液中加入一些非离子型detergents如0.1% Triton X-100。
3. GST切不下来？一般情况下，洗脱后酶切比在柱酶切效率高，所以选择洗脱后酶切；可以提高酶的用量，升高酶切温度，延长酶切时间；更换相应载体，用另一种酶进行酶切。
2.3. IgG纯化纯化操作流程如下：2.3.1．制备单克隆抗体1. 购来F1代小鼠，或Bab/c小鼠，饲养一周；2. 腹腔注射Plaston 200 ul/只，饲养10天；3. 将特定细胞注入腹腔；4. 一周起观察小鼠腹水的产生的情况，随时采集腹水。
2.3.2．硫酸铵沉淀1. 取来的腹水用生理盐水以1:1比例稀释；2. 稀释后腹水用滤纸过滤，去除脂蛋白及杂质，得到澄清的上清溶液；3. 在上清中缓慢地边搅拌边加入等体积硫酸铵饱和溶液（4 ℃下操作）；4. 随硫酸铵加入量的增加，溶液逐渐变混浊，加完后再搅拌10 min左右，4 ℃过夜；5. 将放置过夜的悬浊液4 ℃，7000 rpm离心20 min，弃上清，得到乳白色沉淀；6. 用适量50%硫酸铵重悬沉淀，重复以上操作一次，沉淀-30 ℃保存备用。
2.3.3．亲和层析1. 将经20mM PBS，pH7.4透析过夜的腹水与ProteinA 混合过夜；2. 将混合过夜的样品上柱，收集流出液；3. 用20mM PBS，pH7.4 buffer洗柱子，约10个柱体积；4. 用0.1M甘氨酸pH3.0洗脱，洗脱前预先在每个EP管中加入50 ul中和溶液（2M Tris)。
5. OD280读数；6. 亲和力好的，将流出液与ProteinA重新混合，4 ℃过夜，准备第二次、第三次纯化；亲和力不理想的，将流出液再与ProteinG 混合，4 ℃过夜；7．电泳鉴定。
2.3.4．IgG的Fab片段的获得2.3.4.1．木瓜蛋白酶酶切方法1. 酶切体系如下：0.5 M EDTA 1 ul1 M cystine 100 ul10 mg/ml papain 6 ul酶切缓冲液1767 ul（0.1 M NaAc，1 mM EDTA，用醋酸调pH值至5.5）37 ℃激活10 min；2. 在上述酶切反应体系中加入16 mg/ml的mAb共126 ul，反应总体积为2 ml，将反应液于37 ℃酶切5 hrs；3. 封闭：避光加入92 mg/ml Iodoacetamide (IIA) （碘乙酰酶）326 ul ，避光反应40 min ；4. 透析：对20 mM Tris-HCl ，pH 8.9，更换2次。
2.3.4.2．阴离子交换柱（5 ml Q FF 柱）纯化Fab 片段 阴离子交接缓冲液：Buffer A ：20 mM Tris-HCl ，pH 8.9；Buffer B ：20 mM Tris-HCl ，pH 8.9，1 M Nacl (含0.02% NaN 3)。
以50 min 时间梯度达至100% buffer B ；约4分钟后开始出现蛋白峰，其中峰1为Fab ，如下图所示。
PEAK I PEAK II PEAK IIPEAK I3. 凝胶过滤3.1. 操作流程（配合AKTA操作）1. 在使用分子筛之前，请先确定目的蛋白质在过分子筛的buffer中是稳定的。
如果目的蛋白质所处的buffer和过分子筛的buffer有所不同时，请确定在溶液改变过程中目的蛋白质不会发生沉淀。
否则，不可以进行凝胶过滤操作。
2. 根据蛋白质的分子量大小、总量、总体积和实验目的，选择合适的分子筛进行实验。
24 ml分子筛价格较高且使用寿命较短，所以它仅用于定性分析或蛋白质提取困难且总量较少时的纯化，不可以用于大规模纯化。
3. 使用者用自己的账户登录，将分子筛分子筛连接到AKTA上，先后用新鲜配O和buffer平衡柱子（至少1.5 CV），至基线走平。
置并除气的ddH24. 蛋白质样品上样前必须高速离心13000 rpm x 10 min，取上清上样。
5. 在出峰时进行样品的收集。