人工染色体克隆载体
第四章 人工染色体载体
第4章 人工染色体载体黏粒载体 酵母人工染色体载体 细菌人工染色体载体 P1噬菌体载体和P1人工染色体载体表4-1 5种常见高容量克隆载体及其基本特性载体黏粒 P1 PAC BAC YAC容量（kb） 复制子30-45 70-100 130-150 120-300 250-400 ColE1 P1 P1 F ARS宿主拷贝数重组DNA导入 宿主的方式转导 转导 电转化 电转化 转化筛选标记— sacB sacB α-互补 ade2克隆DNA 获取方法 碱抽提大肠杆菌 高 大肠杆菌 1 大肠杆菌 1 大肠杆菌 1 酵母菌 1脉冲场电 泳14.1 黏粒载体4.1.1 黏粒的结构特征和用途o 黏粒（cosmid）是质粒的衍生物，是带有cos序 列的质粒。
cos序列是λ噬菌体DNA中将DNA包装 到噬菌体颗粒中所需的DNA序列。
o 黏粒的组成包括质粒复制起点（ColE1）、抗性 标记（ampr）、cos位点，因而能像质粒一样转 化和增殖。
o 它的大小一般5-7kb左右，用来克隆大片段 DNA，克隆的最大DNA片段可达45kb。
4.1.2 黏粒载体的 工作原理图4-1 黏粒载体 克隆 DNA的 一般原 理和步 骤24.1.3 黏粒克隆载体1．黏粒pJB8o 大小为5.4kb，由 ampr，ColE1复制 起点（ori）， cos位点，多克隆 位点组成，可容 纳33-46.5kb外源 DNA片段，主要用 来在细菌中克隆 真核DNA。
2．含双cos位点的黏粒载体o c2RB和 Supercos-1是 含双cos位点的 黏粒载体， c2RB大小为 6.8kb，含两个 cos位点，在 cos位点之间有 Kanr（图4-3）。
o 装载容量3346.5kb图4-3 黏粒载体c2RB图谱3图4-4 Supercos-1克隆 的原理和步骤o Supercos-1 大小为 7.94kb，含 有在真核细 胞中起作用 的来自猿猴 病毒SV40的 复制起点 ori-SV40和 新霉素抗性 基因 （neor）。
酵母人工染色体载体
YAC载体的复制元件是其核心组成成分，其在酵 母中复制的必须元件包括复制起点序列即自主复制序 列、用于有丝分裂和减数分裂功能的着丝粒（CEN） 和两个端粒（TEL）。这些元件能满足自主复制、染 色体在子代细胞间的分离及保持染色体稳定的需要。
7.HIS3EL)、DNA的复制起点 (ARS)和着丝粒(CEN)，以及必要的选择标记(TRP1等)基 因序列克隆到大肠杆菌质粒pBR322中，获得的重组质粒 就是YAC载体。
常用的YAC载体有3种，即pYAC3、pYAC4和pYAC5， 其差别主要是sup4基因上的克隆位点不同，分别为SnaBI、 EcoRI和NotI位点。
工作原理：
用BamH Ι酶切去除载体上的HIS3顺序，再用EcoR Ι 切开克隆位点，形成YAC的左右两臂，与外源大片段 DNA在该切点相连就形成一个大型人工酵母染色体，转 化到酵母细胞后可像染色体一样复制，并随细胞分裂到 子细胞中去，达到克隆大片段DNA的目的。外源DNA 的转载导致抑制基因SUP4插入失活，从而使重组菌形成 红色菌落，而载体自身连接转入到酵母细胞后所形成的 菌落为白色。
酵母人工染色体pYAC4上的基本功能单位有：
1.CEN4顺序，来源于酵母第4号染色 体的着丝粒顺序，它提供酵母着丝 粒正常功能的所有顺式调控信息， 可保证YAC在酵母细胞分裂时向两 极运动；
2.TEL顺序，来源于四膜虫大核中的 rDNA分子的末端，提供端粒形成顺 序，可保证YAC末端不被降解和重 组，且能够稳定地复制；
利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体称 为人工染色体载体。其装载外源DNA片段的容量就可以与染色 体的大小媲美。
如酵母人工染色体载体，它将酵母菌染色体上的复制区、 分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当 大片段的外源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人 造染色体，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制 并遗传。
第四章 人工染色体载体
yeast
一、YAC载体的复制元件和标记基因
1.复制必须成分
➢ 复制起点ori，自主复制序列ARS (autonomously replicating sequence)
➢ 着丝粒（CEN） 使染色体(chromosome)在分裂过程中能正确分配 到子细胞中有丝分裂(mitosis)中与纺锤丝 (spindle fiber)联系的那段DNA
4.感染E. coli：线状的重组DNA被注入细胞并通过cos 位点的环化，形成黏粒载体，象质粒(plasmid)一样 复制
在“染色体步查(chromosome walking)”过程 中染色体步查：chromosome walking 采用一段分离自某一重组体一端的非重复 DNA片段作为探针以鉴定含有相邻序列的重 组克隆。
mcs COS
BamHI酶切 CIP去磷酸
连接
包装 感染 铺平板 筛选 阳性克隆
大小：6.8 kb 可容纳35～45 kb的外源DNA片段
组成：含两个cos位点、抗性标记（ampr kanr）、 ori （ColE1复制起点）和4个多克隆位点(MCS)。
三、黏粒克隆载体
1.pJB8
简单黏粒
组成：抗性标记（ampr ）、 ori （ColE1复制起点） 、
cos位点和4个多克隆位点
大小：5.4kb 可容纳33-46.5kb外源DNA片段
➢对载体进行去磷酸化(dephosphorylation)处理， 否则易形成多联载体 ➢定向克隆(directed clone)
2. 混菌保存
混合单菌落，15%甘油，-70 C
生长平衡问题
3. 体内包装
人工染色体载体PPT课件
筛选第一受体的克隆子，一般采用抗菌素 抗性选择标记；
筛选第二受体的克隆子，常用与受体互补 的营养缺陷型。
人工染色体克隆载体的特点： 能容纳长达1000 kb甚至3000 kb的外源
DNA片段。
人工酵母染色体克隆载体的构建
YAC(酵母人工染色体)克隆载体是最早构建 成功的人工染色体克隆载体。
将酵母染色体DNA的端粒(TEL)、DNA复制 起点 (ARS)和着丝粒(CEN)以及必要的选择标记 (HISA4和TRPl)基因序列克隆到大肠杆菌质粒 pBR322中，构建成YCA克隆载体。
二、YAC载体的工作原理
ARS1
TRP1
EcoRI
CEN4
EcoRI
EcoRI EcoRI
Apr
pYAC4
URA3 BamHI
ori
TEL BamHI TEL
重组酵母染色体
连 接
转化酵母菌
03.01.2024
37
（红色，赤红色）
此克隆载体的sup4(抑制基因：抑制赭色 表型 )基因上，组装了供插入外源DNA片段 的克隆位。
③一个自主复制序列(ARS1)；
④两个来自嗜热四膜虫
(Tetrahymenna thermophilp)的末
端重复序列(TEL)，以保持重组
•03.01.2Y02A4 C为线状结构；
•39
⑤在两个末端序列中间，有 一段填充序列(HIS3)，以 便pYAC4在细菌细胞中稳 定扩增；
⑥Amp抗性及细菌质粒复制 原点；
常用的YAC克隆载体有3种：
pYAC3、pYAC4和pYAC5。
差别： 在sup4基因上的克隆位点不同，分别是
SnaBI、EcoRI和NotI。
酵母人工染色体载体
工作原理：
用BamH Ι酶切去除载体上的HIS3顺序，再用EcoR Ι切 开克隆位点，形成YAC的左右两臂，与外源大片段DNA在 该切点相连就形成一个大型人工酵母染色体，转化到酵母 细胞后可像染色体一样复制，并随细胞分裂到子细胞中去， 达到克隆大片段DNA的目的。外源DNA的转载导致抑制 基因SUP4插入失活，从而使重组菌形成红色菌落，而载体 自身连接转入到酵母细胞后所形成的菌落为白色。
酵母人工染色体pYAC4上的基本功能单位有：
1.CEN4顺序，来源于酵母第4号染色 体的着丝粒顺序，它提供酵母着丝粒 正常功能的所有顺式调控信息，可保 证YAC在酵母细胞分裂时向两极运动；
2.TEL顺序，来源于四膜虫大核中的 rDNA分子的末端，提供端粒形成顺 序，可保证YAC末端不被降解和重组， 且能够稳定地复制；
7.HIS3顺序。
酵母人工染色体载体的构建：
将酵母染色体DNA的端粒(TEL)、DNA的复制起点 (ARS)和着丝粒(CEN)，以及必要的选择标记(TRP1等)基因 序列克隆到大肠杆菌质粒pBR322中，获得的重组质粒就是 YAC载体。
常用的YAC载体有3种，即pYAC3、pYAC4和pYAC5， 其差别主要是sup4基因上的克隆位点不同，分别为SnaBI、 EcoRI和NotI位点。
优缺点
概念
酵母人工染色体载体（yeast artificial chromosome,YAC) 是利用酿酒酵母染色体的复制元件构建的载体，是最早 构建成功的人工染色体载体，其工作环境也是在酿酒酵 母中。
酿酒酵母的形态为扁圆形和卵形，生长代时为90min， 含16条染色体，其大小为225~1900kb，总计有14×106bp。
1.YAC载体在酵母中复制的必需元件包括：
基因克隆的载体
3.常用的质粒载体
第二节 噬菌体载体（phage vectors）
噬菌体的生物学特性 噬菌体载体构建 M13噬菌体的生物学特性
M13噬菌体载体
1. 噬菌体的生物学特性
溶菌周期(lytic cycle)：
噬菌体将DNA注入 寄主细胞后很快环 化，然后进行自我 复制、蛋白衣壳合 成和新噬菌体颗粒 的组装，最后使寄 主细胞破裂而释放 出大量的子代噬菌 体。
基因克隆的载体
引 言（introduction） 第一节 质粒载体（plasimid vectors） 第二节 噬菌体载体（phage vectors） 第三节 柯斯质粒载体（cosmid vectors） 第四节 人工染色体载体（B/Y/HAC）
引
一、基因克隆的本质
言
是使目的基因在特定的条件下得到扩增和表达，
三个确保低拷贝质粒精确分
配至子代细胞的基因座 （ parA , parB , ibrary）
将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的 片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入 相应的宿主细胞中保存和扩增。理论上讲，这些重组
cILytic cycle clear plaques
selecting recombinant phage via insertional inactivation of the cI gene
Replacement vectors(替换型载体)
4.M13噬菌体载体
（1）M13噬菌体增殖
或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3’ 端分别加上几个C或G，成为粘性末端。
接上人工接头 粘性末端 末端转移%的mRNA时所需要的克隆数目。
N=
ln (1-p) ln:某一种低丰度（不足14份拷贝）mRNA占细胞整个mRNA的 n 比例 N：所需的重组载体数（克隆数）
动物基因工程—基因克隆载体
B、在非必需区组入选择标记基因
C、构建的λDNA载体不应小于36.4kb
基因工程载体构建
③用λDNA作载体比用质粒作载体的优点：
A、可容纳较大的外源DNA片段（15－23kb，质粒一般<10kb）
B、λDNA进入细菌细胞容易，不象质粒载体那样需要采用化学介导
法才能进入细菌细胞
物细胞（或蓝藻细胞）中进行高效表达。
基因工程载体构建
2、植物病毒克隆载体
构建植物病毒克隆载体的基本策略是：
对病毒DNA（包括RNA反转录的DNA）进行加工，消除其对植物的致
病性，保留其通过转导或转染能进入植物细胞的特性，使携带的目的基因导
入植物细胞。
目前应用最多的植物病毒克隆载体是：利用CaMV（花椰菜花叶病毒）
TGMV）、非洲木薯花叶病毒（ACMV）、玉米线条病毒（MSV）、小麦矮缩病毒
（WDV）
RNA病毒：雀麦草花叶病毒（BMV）、大麦条纹花叶病毒（BSMV）、蕃茄丛矮病
毒（TBSV）、马铃薯X病毒（PVX）、烟草花叶病毒（TMV）、烟草蚀刻病毒（
TEV）、李痘病毒（PPV）等
基因工程载体构建
2、植物病毒克隆载体
根据这些性质构建了一系列分别适用于不同生物的病毒克隆载体，把
感染细菌的病毒专门称为噬菌体，由此构建的载体则称为噬菌体载体 。
基因工程载体构建
基因工程载体构建
基因工程载体构建
（1）λ噬菌体克隆载体
①λDNA构建克隆载体的依据：
A、λ噬菌体由DNA（λDNA）和外壳蛋白组成，对大肠杆菌具有很高的感
动 物 生 物 技 术
基因工程载体构建
基因工程载体构建
基因工程载体构建
人工染色体载体的研究和应用
】 。 述 ・
基 因 【 技 术 的 迅 速 发 埏 ，他 人 类 埘 ： 体 基 冈 的 结 Ｉ 物 卡 功 能 、 达及 其 捌拧 的 研 究 深 入 钊 分 子水 平 。而对 特 定 基 勾、 表 片段 的分 离和 获 ， ｌ 【 足上 述研 究 的筛 选 和 扶 得 均 为 可能 因 使 Ａ 此， 艇 纽 丈库 是 进 行 分 子兜 隆 和 基冈 组 结 构 功 能 研 究 的 撼 础 ： ０年 代 人 们 就 已提 …臧 阏 组 文 库 的概 念 Ｉ １ ７ ７ ９８ ．
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得 多种 类 型 ＨＡＣ 。ＨＡＣ ｓ ｓ可 以携 带 大 片段 基 因 组 ＤＮＡ， 建 是 立 转 基 因动 物 模 型 的重 要 手 段 ， 基 因 治疗 方 面 也 有 着 广 阔 在 的应 用 前 景 为 方 便 从 各 种 文 库 筛 选 到 的 一 新 基 进 行 功 能 研 究
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人工染色体克隆载体：是一种“穿梭”载体，含有质立载体所必备的第一受体内原质立复制起始位点，还含有第二受体染色体DNA着丝点、端粒和复制起始点的序列，以及合速的选择标记基因。
固体发酵：某些微生物升长需水很上少，可利用疏松而含有必需营养物的固体培养基进行发酵生产。
蛋白质工程：基因工程的基础上，结合蛋白质结晶学计算机辅助设计和蛋白质化学等多学科的基础知识，通过对基因的人工定向改造等手段，从而达到对蛋白质进行修饰改造拼接以生产能满足人类需要的新型蛋白质技术。
DNA疫苗：是利用可隆于载体上的抗原基因直接注射机体，被细胞摄取并在细胞内表达相应的抗原，通过不同途径诱导机体的特异免疫应答。
人工种子：它是一种含有植物胚状体或芽营养成分激素以及其他成分的人工胶囊。
发酵工程：利用微生物生长速度快生长条件简单以及代谢过程特殊等特点，再合适条件下，通过现代化工程技术手段，由微生物的某中特定功能生产出人类所需的产品。
生物传感器：是用生物活性物质做敏感器件，配以适当的换能器所构成的分析工具。
载体：把能够承载外源基因，并将其带人受体细胞得以稳定维持的DNA分子。
胚胎移植：是由产生胚胎的供体和养育胚胎的受体分工合作共同繁殖后代。
基因治疗：是利用遗传学的原理治疗人类的疾病。
细胞融合：两个或多个细胞相互接触后，其细胞膜发生分子重排，导致细胞合并染色体等遗传物质重组的过程。
花药培养：经过适当的诱导，花粉囊中的花粉可能去分化而发育成单倍体胚或愈伤组织，最终生产花粉植株。
原生质的融合概念：从同一个种或不同种分离得到的原生质体在适当的条件下融合得到细胞核物质和细胞质物质的混和。
固定化酶：指经物理或化学的方法处理,使酶变成不易随水流失即运动受限制,而又能发挥催化作用的酶制剂.
基因克隆；是指在分子(DNA)水平上开展研究工作以获得大量的相同基因及其表达产物。
⊙
生物技术有基因工程细胞工程酶工程发酵工程蛋白质工程
基因工程包括目的基因分离与可隆载体重组转人受体细胞筛选和鉴定可隆子。
改变蛋白质的主有方法改变蛋白质结构的核心技术是基因的人工定点突变，虽然基因人工顶点突变有很多方法，当要在一个的任何位点准确地进行定点突变，目前主要的方法有M13载体法和PCR扩增法。
可隆载体1、在可隆载体合适的位置必须含有允许外原DNA片段组入的可隆位点，并且这样的可隆位点应尽量可能的多。
2、可隆载体能携带外原DNA片段进入受体细胞，或能停留在细胞中进行自我复制。
3、可隆载体必须含有供选择转化子的标记基因，如根据转化子抗药性升降进行筛选。
4、分子量小、多复制、安全性好、易表达。
植物组织培养阶段；预备阶段诱导去分化阶段继代增殖阶段生根发芽阶段移栽成活阶段。
分批发酵；除了控制温度和pH及通气以外，不进行任何其他控制，操作简单。
但从细胞所处的环境来看，则有明显改变。
发酵初期营养物过多，可能抑制微生物的生长，而发酵的中后期又可能因为营养物减少而降低培养效率；从细胞的增殖来说，初期细胞浓度低，增长慢，后期细胞浓度虽高，但营养物浓度过低也生长不快，总的生产能力不是很高。
连续发酵；可以维持稳定的操作条件，有利于微生物的生长代谢，从而使产率和产品质量也相应保持稳定；能够更有效地实现机械化和自动化，降低劳动强度，减少操作人员与病原微生物和毒性产物接触的机会；减少设备清洗准备和灭菌等非生产占用时间，提高设备利用率；由于灭菌次数少，使测量仪器滩头的寿命得以扬长；容易对过程进行优化，有效提高发酵；容易造成杂菌污染在长期连续发酵中微生物容易发生变异，对设备和仪器控制元件的要求高，捻性丝状菌体容易附着给连续发酵带来困难。
补料分批发酵：补料分批发酵作为分批发酵向连续发酵的过度，兼有两者优点。
它可以解营养物质的抑制、产物反馈抑制和葡萄糖分解阻遏效应。
对于好氧发酵，它可以避免在分批发酵中一次性投入糖过多造成细胞大量的生长，耗氧过多以至通风搅拌设备不能匹配的状况。
在某些情况下减少菌体生成量，提高有用产物的转化率。
可隆动物意义：1、遗传素质完全一致的可隆动物将更有利于开展对动物生长发育衰老和健康机制的研究2、有利于大量培养品质优良的家禽3、经转基因的可隆动物将能为人类提供源源不断的廉价药品保健品以及人体移植器官4、科学家将很快从目前的同种可隆技术推进到异种可隆，这将大大促进对濒临灭种动物的保护工作。
原生质体的制备：1、取材与除菌2、酶解3、分离4、洗涤5、鉴定
环境中的应用：利用新的指示生物监测评价环境；利用核酸探针和PCR技术监测评价环境；利用生物传感器，
DNA芯片及其他方法等监测评价环境。
1、基因工程与传统的育种相比有哪些突出优越性，如何合理利用基因工程技术促进农业生物的
遗传改良？
答：长期以来人们不断地寻求提高重要作物的质量和产量的方法，传统的育种过程是一个缓慢而艰辛的过程，但它取得了重大的成功，例如高质量的水稻、玉米、小麦等就是从它们早先的种演变而来的。
但基因工程育种等现代生物技术方法将在农业生物的遗传改良方面发挥越来越重要的作用。
应用基因工程技术在抗病毒病、抗细菌和真菌病、抗虫、抗旱、抗寒、抗高温、抗盐以及改善植物品质、雄性不育、延缓果实成熟、改变花色和表达药用蛋白或多肽等方面选育出了一批转基因植物。
基因工程与传统育种相比突出的优越性在于打破常规育种难以突破的物种之间的界限，并且可以更精确，更具有可预测性的控制基因的引入，可以使原核生物与真核生物之间，动物与植物之间，甚至人与其他生物之间的遗传信息进行相互重组和转移。
合理利用基因工程技术首先要对于植物基因研究工作进行规范和合理约束，主要是出于生物多样性的考虑。
其次，在操作过程中要避免对环境的污染。
2、利用生物技术开发的药物有哪些？为什么基因工程药物的研究与开发具有巨大的应用潜力和
十分诱人的前景？
答：利用生物技术开发的药物主要有抗生素及其他天然药物和基因工程药物两大类。
蛋白质是生命活动最重要的物质之一，并且很多蛋白质与人类的疾病密切相关。
在DNA重组技术出现之前，大多数的人用蛋白质药品主要是从人或动物的组织或器官中提取的，成本特别高、产率产量很低，供应十分有限，且存在不安全因素。
基因工程技术可以克服传统方法生产蛋白质药物的困难。
首先，基因工程技术可以解决蛋白质药物的产量问题。
将有治疗意义的蛋白质基因克隆后，导入细菌、酵母等生长旺盛的表达系统中，使这个基因接受表达系统中强的表达元件的控制而大量表达，人们就可以很容易地得到可供临床使用的大量药物。
其次，由于细菌、酵母生长条件相对简单，容易大量培养，因而可大大降低生产成本。
再次，用基因工程生产人源的蛋白质药物将是安全、有效的，不用担心其他病原体的污染，也不用担心动物源药物的抗原性。
另外，基因工程技术不仅可以获得大量的有活性的人源药物，而且可以通过基因工程的方法对蛋白质基因的结构加以改造以改变蛋白质结构，使这种被修饰后的蛋白质药物的性质更加稳定、活性更高、副作用更低。
干细胞：是动物胚胎及某些器官中具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞，是重建修复病损或衰老组织器官功能的理想种子细胞。
意义：干细胞治疗与传统方法的比较1、低毒性，一次治疗有效2、不需要完全了解疾病发病的硗确机制3、用自身干细胞移植，可避免产生免疫排斥反应。
一、在windowsXP中，默认状态是无法重装IE的，如果因为文件出错故障等原因必须重装，可以使用如下方法。
插入windowsXP 安装光盘，在“开始-运行”窗口输入“rundll32.exesetupapi,lnstallHinfSectionDefaultlnstall132c:\windows\inf\ie.inf"回车后即可重装IE（假设windows安装在c:\windows中）
二、1.控制面板添加删除里卸了IE
2.控制面板添加删除添加WINDOWS组件里找到IE然后卸掉
3.C：\ProgramFiles＼目录下找到InternetExplorer删除InternetExplorer
4.注册表删除
①对IE5.0的重装可按以下步骤进行:
第一步:打开“注册表编辑器”，找到[HKEY_LOCAL_MACHINE＼Software＼Microsoft＼InternetExplorer]，单击其下的VersionVector 键。
第二步:在右侧窗格中双击IE子键，将原来的“5.0002”改为“4.0”，单击“确定”后退出“注册表编辑器”。
第三步:重启后，就可以重装IE6。
0了。
②IE6.0的重装有两种方法:
方法1:打开“注册表编辑器”，找到[HKEY_LOCAL_MACHINE＼SOFTWARE＼Microsoft＼ActiveSetup＼
InstalledComponents＼{89820200-ECBD-11cf-8B85-00AA005B4383}]，将IsInstalled的DWORD值改为0就可以了。
但是你得先下载IE6.0SP1后，然后再卸载。