高中生物选修三基因工程

···G
···TG CG··· ⑧···CTTAA
⑤ G··· ⑥···GC ⑦ GT··· AATTC···
ACGTC··· ···CG CA··· G···
第5章 生态系统及其稳定性
2.2 基因工程的基本操作程序
基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤：
1、 目的基因的获取 ； 2、 基因表达载体的构建； 3、 将目的基因导入受体细胞 ； 4、 目的基因的检测与鉴定 。 其中核心构建和比较
一、获取目的的基因：
依据基因的核苷酸序列、基因的功能、 基因在染色体上的位置、基因的转录产物 mRNA，以及基因的表达产物蛋白质等特 性来获取目的基因。
基础理论 技术发明
1）目的基因的获取 2）基因表达载体的构建 3）将目的基因导入受体细胞 4）目的基因的检测和鉴定
基础理论和技术的发展催生了基因工程
• DNA是遗传物质的证明 • DNA双螺旋结构和中心法则的确立 • 遗传密码的破译 • 基因转移载体的发现 • 工具酶的发现 • DNA合成和测序技术的发明 • DNA体外重组的实现 • 重组DNA表达实验的成功 • 第一例转基因动物问世 • PCR技术的发明
酸序列，并使每一条链中特定部位的 两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
3、特点： 特异性----特定序列、特定位点 4、结果： 形成DNA的双链片段
黏性末端 片段的末端的形式
平末端
（二） DNA连接酶---“分子缝合针”
1、种类：两类
E·coli DNA连接酶:连接黏性末端 T4 DNA连接酶 ：连接黏性末端和 平末端
（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以
遗传 给下一代； （2）使目的基因能够
表达 和发挥作用
二、基因表达载体的构建
2、过程： 载体
目的基因
同一种限制酶
具有黏性末 端的载体
具有相同黏性末 端的目的基因
DNA连接酶
重组DNA分子 （重组载体）
二、基因表达载体的构建
3、组成：
启动子+目的基因+终止子+标记基因+(复制原点）
分子 水平 鉴定
4、个体水平的鉴定：抗虫、抗病等的感染、 接种实验
A
磷
酸
二
T
酯
键
大肠杆菌(EcoRI)的一种限制酶能识别GAATTC序列，
并在G和A之间切开。
限制酶所识别的序列有什么特点? 限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个、8个 碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链 DNA上的碱基是反向对称重复排列的。
一、获取目的基因
1、目的基因：在基因操作中使用的外源基因。它 主要是 编码蛋白质 的基因，也可以是一些具有调 控作用的因子。
一、获取目的同基因的许多DNA片 段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体是否 含目的基因。如将 来可用含青霉素的 培养基鉴别，将含 目的基因的细胞筛 选出来。
有切割位点
能带着插入的目 的基因一起复制
PCR技术—聚合酶链式反应
①概念：
是一项在生物体外复制特定 DNA片段的核酸合成技术
②原理：
DNA双链复制的基本原理
PCR扩增仪
③前提：
一段已知的目的基因的核苷酸序列
• 含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具 备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化 酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶 不能将其切开。
基因工程培育抗虫棉的简要过程：
苏云金芽孢杆菌
普通棉花(无抗虫基因)
提取
与运载体DNA拼接
抗虫基因
棉花细胞(含抗虫基因)
导入
转基因棉花植株
基因工程操作的四个基本步骤
启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片 断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了 它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白 质
终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片 断，能终止mRNA的转录
标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有 目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来
限制酶在原核物中的作用
（D ）
A、能复制 B、有多个限制酶切点 C、具有标记基因 D、它是环状DNA
练习
3.有关基因工程的叙述中，错误的是（ D ） A、基因工程技术能定向地改造生物的遗传性
状，培育生物新品种 B、重组DNA的形成在生物体外完成 C、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、质粒都可作为运载体
练习
①
···CTGCA ②···AC ③GC··· ④···G
一、获取目的基因
2、获取方法： （2）用PCR技术扩增目的基因
PCR结果： 使目的基因以 指数 形式在短时间内大 量扩增。
一、获取目的基因
2、获取方法： （3）用化学方法人工合成
如果基因比较小， 核苷酸序列 又已知，可以 通过 DNA合成仪 用化学方法直接人工合成
二、基因表达载体的构建
1、目的：
三、将目的基因导入受体细胞
1、转化的概念 2、转化的方法 此外 植物：农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法 还有 动物：显微注射技术
微生物：Ca2+处理法 3、转化的受体细胞
植物：常用体细胞 动物：受精卵 微生物：常用大肠杆菌、酵母菌等
四、目的基因的表达和鉴定
1、导入的鉴定：DNA分子杂交技术 2、转录的鉴定：核酸分子杂交技术 3、翻译的鉴定：抗原-抗体杂交技术
一、获取目的基因
2、获取方法： （2）用PCR技术扩增目的基因
PCR技术：在生物 体外 复制特定 DNA片段 的 核酸合成技术。 PCR技术原理： DNA双链复制 。
一、获取目的基因
2、获取方法： （2）用PCR技术扩增目的基因
过程：
90℃-95℃：目的基因的双链模板在热力作用下， 氢键 断裂，形成单链DNA; 55℃-60℃： 引物 与单链模板相应互补序列结合；
基本过程 获取基因—体外重组—导入基因—表达基因
结果
人类需要的新的生物类型和生物产品
二、DNA重组技术的基本工具
限制性核酸内切酶——“分子手术刀” DNA连接酶——“分子缝合针” 载体——“分子运输车”
(一）限制性核酸内切酶（限制酶）---“分子手 术刀”
1、来源：主要是从原核生物中分离纯化而来 2、作用：识别某种双链DNA分子特定的核苷
要对天然质粒进行人工改造
练习
1.以下说法正确的是（C ）
A、所有的限制酶只识别一种特定的核苷酸序 列
B、质粒是基因工程中唯一的运载体
C、运载体必须具备的条件之一是：具有一个 或多个限制酶切点，以便与外源基因连接
D、DNA连接酶使黏性末段的碱基之间形成 氢键
练习
2. 不 属 于 质 粒 被 选 为 基 因 运 载 体 的 理 由 是
黏性末端
黏性末端 黏性末端：被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带 有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样 的切口叫黏性末端。
平末端：当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时， 切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口 叫平末端。
当限制酶从识别序列的中心轴线两侧切开时，产
。生的是黏性末端。当限制酶从识别序列的中心轴 线处切开时，产生的是平末端
• 原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是， 生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御 机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细 菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利 用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。 所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源 DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。
2、作用部位：磷酸二酯键
（三） 运载体---“分子运输车”
1、运载体的作用： （1）将目的基因转移到受体细胞中去； （2）使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传； （3）使目的基因能够表达和发挥作用。
2、运载体必须具备的条件：
（1）具有一个或多个限制酶切点，以便与目的基因连接； （2） 能够在受体细胞中复制并稳定地保存，以便目的基
④条件：
模板DNA (含有目的基因) 四种脱氧核苷酸 热稳定DNA聚合酶(Taq酶） 一对引物 温度控制
⑤方式：以_指__数__方式扩增，即__2_n_（n为扩增循 环的次数）
⑥结果：
目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增
⑦过程：
a、DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板 在热作用下，_氢__键__断裂，形成__单__链__D_N_A___
70℃-75℃：在 DNA聚合酶（Taq酶） 作用下进 行延伸。
一、获取目的基因
2、获取方法： （2）用PCR技术扩增目的基因 PCR技术的条件： 模板： 目的基因两条链 原料： 四种游离的脱氧核苷酸 引物：（一小段与目的基因模板链互补的）一对DNA
单链
酶： 热稳定DNA聚合酶（Taq酶） 温度控制： 高温→低温→中温
b、退火（复性55℃-60℃）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部___双__链___。
c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从 引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补 的__D_N_A_链___。
重组（基因表达）载体的结构组成 复制原点+启动子+目的基因+终止子+标记基因
因的遗传； （3）具有某些标记基因，以便进行重组DNA的筛选。
（如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因 等 ）； （4）对受体细胞无害； （5） 大小合适，以便提取和体外操作。
常用的运载体有：
质粒，λ噬菌体的衍生物，动植物病毒等
质粒是基因工程最 常用的运载体，它广泛 地存在于细菌中，是细 菌拟核DNA外能够自主 复制的很小的环状DNA 分子，大小只有普通细 菌拟核DNA的百分之一。
§1-1DNA重组技术的基本工具