PAGE测定蛋白质的相对分子量
实验一 SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子量
3．浓缩胶的制备 按下表配制浓缩胶， 按下表配制浓缩胶，将浓缩胶混 匀后直接灌注在已聚合的分离胶 立即插入梳子， 上，立即插入梳子，将凝胶垂直 放于室温下聚合。 放于室温下聚合。
浓缩胶的配制
H2O 30%丙烯酰胺 丙烯酰胺 浓缩胶缓冲液(pH6.8) 浓缩胶缓冲液(pH6.8) 10% SDS TEMED 10%过硫酸铵 过硫酸铵 总体积 4%(ml) 3.05 0.65 1.25 0.05 2小滴 小滴 0.05 5ml
4．样品预处理： 样品预处理： 取样品液与等体积样品缓冲液 混合，100℃加热1 分钟。 混合，100℃加热1～2分钟。 5．待浓缩胶聚合完全后，小心移出 待浓缩胶聚合完全后， 梳子， 梳子，然后将胶板固定于电泳装置 上下槽各加入电极缓冲液。 上，上下槽各加入电极缓冲液。 6．加样： 加样： 用微量进样器加样。 用微量进样器加样。 每个样品孔加入20ul样品 样品。 每个样品孔加入20ul样品。 同时加一个标准品。 同时加一个标准品。
分离胶的配制
H2O 30%丙烯酰胺 丙烯酰胺 分离胶缓冲液(pH8.8) 分离胶缓冲液(pH8.8) 10% SDS TEMED 10%过硫酸铵 过硫酸铵 总体积 10%(ml) 10 10 7.5 0.3 1滴 滴 0.1 30ml
将分离胶混匀后立即灌注于玻板间 隙中，上层小心覆盖一层正丁醇。 隙中，上层小心覆盖一层正丁醇。 将胶板垂直放于室温下， 将胶板垂直放于室温下，待分离胶 聚合完全后， 聚合完全后，倾去正丁醇并用滤纸 吸干。 吸干。
操作步骤 1．安装制胶模具 A 、要用琼脂进行封边，防止 要用琼脂进行封边， 凝胶泄露， 凝胶泄露，尤其注意边角的 地方。 地方。 B、安装时，要将螺丝拧紧， 安装时，要将螺丝拧紧， 也是为了防止泄露。 也是为了防止泄露。
蛋白 SDS-PAGE纯度鉴定与分子量测定
蛋白SDS-PAGE纯度鉴定与分子量测定一、原理：（1）SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate - polyacrylamide gel electrophoresis, SDS- PAGE）简称SDS - PAGE。
用于蛋白纯度及蛋白质亚基相对分子量（relative molecular mass, Mr）测定。
SDS是一种阴离子去污剂，带有大量负电荷，与蛋白质结合后使蛋白质所带负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异。
SDS 破坏蛋白质氢键、疏水键，引起蛋白质构象改变，使蛋白质－SDS复合物形状近似椭圆形，短轴相同（1.8nm），长轴与蛋白质分子量成正比。
因此，蛋白质—SDS复合物(SDS-denatured protein)在凝胶中的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影响，只与椭圆棒长度（蛋白质分子量）有关。
蛋白质的迁移率与分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bXMW：分子量；X：迁移率；k、b均为常数将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据其相对迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
（2）分离效应：PAGE根据其有无浓缩效应，分为：连续电泳（continuous electrophoresis）：采用相同孔径的凝胶和相同的缓冲系统不连续电泳（discontinuous electrophoresis）：采用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系连续PAGE：电荷效应；分子筛效应不连续PAGE：电荷效应；分子筛效应；浓缩效应不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳：凝胶由上、下两层凝胶组成，两层凝胶的孔径不同，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。
①浓缩效应：使样品在浓缩胶中被浓缩成一条窄带，然后再进入分离胶进行分离。
②电荷效应：分离胶中，蛋白质表面净电荷不同，迁移率不同。
SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量
SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量SDS-PAGE电泳是现代生物学和生物化学研究中最常用的方法之一，可用于测定蛋白质的相对分子质量、纯度和数量等指标。
下面将就SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量进行介绍。
SDS-PAGE电泳的原理：SDS-PAGE电泳是一种基于PAG（聚丙烯酰胺凝胶板）的矩阵上运行的直流凝胶电泳。
相对分子质量（MW）是以电泳迁移距离为单位来表示的。
蛋白质在PAG上被限制在孔道中运动，因此，蛋白质分子迁移距离与分子大小成正比。
通过使用外部标准，可以精确地将样品的迁移距离转换为分子量。
这种分离方法受到电荷和大小作用的影响，电势梯度使带电的蛋白质分子在凝胶中迁移。
SDS-PAGE电泳的过程：SDS-PAGE电泳的过程主要包括：样品加载、电泳和染色步骤。
（1）样品加载：样品的制备：蛋白质样品通常经过还原和变性，以便将所有蛋白质中的二硫键断裂并且在孔道中呈现线性的多聚蛋白质结构。
这需要在治疗过程中对样品添加SDS缓冲液，然后在热水浴或高压下暴露于还原剂，例如2-硫代乙酸（DTT）或β-巯基乙酸（MEA）。
（2）电泳：将处理过的样品通过凝胶基质中的丝状孔道。
随着电场的施加，蛋白质会在SDS凝胶板上自由迁移，从而分离出蛋白系列。
（3）染色：电泳结束后，将凝胶板进行染色。
目前较常用的方法是银染、共染和Coomassie Brilliant Blue染色法。
SDS-PAGE电泳的应用：SDS-PAGE电泳广泛应用于研究蛋白质相对分子质量、活性定量、纯度评估、亚基分离等方面。
其中，蛋白质相对分子质量的测定是SDS-PAGE电泳的最主要应用之一。
通过将未知蛋白与已知分子质量蛋白一起电泳，可以通过线性回归计算未知标本的分子大小。
SDSPAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告
SDS_PAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告实验报告：SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量一、实验目的通过SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）测定蛋白质相对分子质量，了解其基本原理和实验操作流程。
二、实验原理SDS-PAGE是一种常用的测定蛋白质相对分子质量的方法。
它利用十二烷基硫酸钠（SDS）与蛋白质的结合性质，将蛋白质变性并带负电荷，使得蛋白质在电场中的迁移率仅取决于相对分子质量，而与蛋白质的等电点、电荷性质无关。
通过比较标准蛋白质的迁移率和已知相对分子质量的蛋白质，可确定待测蛋白质的相对分子质量。
三、实验步骤1.准备试剂和器材：SDS-PAGE所需试剂包括丙烯酰胺、N-丙基甲基丙烯酰胺、过硫酸铵、甘氨酸、十二烷基硫酸钠、tris缓冲液、G250染料、乙醇等；器材包括电泳槽、制胶板、移液器、电泳仪、电源等。
2.制备标准蛋白样品：选择已知相对分子质量的标准蛋白样品，将其与G250染料混合，煮沸变性，冷却后作为标准蛋白样品。
3.制备样品：将待测蛋白质样品与G250染料混合，加入适量SDS-PAGE缓冲液，煮沸变性，冷却后作为待测样品。
4.制胶：将丙烯酰胺、N-丙基甲基丙烯酰胺、过硫酸铵、甘氨酸、tris缓冲液等混合，倒入制胶板中，插入样品梳子，静置凝固。
5.电泳：将凝胶放入电泳槽中，加入适量电泳液，将标准蛋白样品和待测样品分别加入对应的孔中。
打开电源，调整电流和电压，开始电泳。
6.染色和脱色：电泳结束后，将凝胶取出，用G250染料进行染色，然后进行脱色处理，以呈现清晰蛋白质条带。
7.相对分子质量测定：通过比较标准蛋白样品的迁移率和已知相对分子质量的蛋白样品，可确定待测蛋白质的相对分子质量。
四、结果分析通过本实验，我们成功地得到了SDS-PAGE凝胶电泳图谱，并测定了待测蛋白质的相对分子质量。
通过与标准蛋白样品的迁移率进行比较，发现待测蛋白质的相对分子质量约为50kDa。
此外，我们还发现不同浓度的待测蛋白质样品在凝胶电泳图谱上的条带位置也存在差异，表明它们具有不同的相对分子质量。
SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子量
SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子量一、实验目的：1、了解SDS-PAGE垂直板型电泳法的基本原理及操作技术。
2、学习并掌握SDS－PAGE法测定蛋白质相对分子量的技术。
二、实验原理：SDS-PAGE电泳法，即十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳法，。
1．在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的迁移率主要取决于分子大小和形状以及所带电荷多少。
2．在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），SDS 是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。
此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。
三、仪器、原料和试剂1、仪器：垂直板型电泳槽；直流稳压电源；50或100μl微量注射器、玻璃板、水浴锅，染色槽；烧杯；吸量管；常头滴管等。
2、原料：低分子量标准蛋白质按照每种蛋白0.5~1mg·ml-1样品溶解液配制。
可配制成单一蛋白质标准液，也可配成混合蛋白质标准液。
3、试剂：（1）分离胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液PH8.9）:取1mol/L盐酸48mL，Tris 36.3g,用无离子水溶解后定容至100mL。
（2）浓缩胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液PH6.7）:取1mol/L盐酸48mL, Tris 5.98g,用无离子水溶解后定容至100mL。
（3）30%分离胶贮液：配制方法与连续体系相同，称丙烯酰胺（Acr）30g 及N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）0.8g，溶于重蒸水中，最后定容至100ml，过滤后置棕色试剂瓶中，4℃保存。
（4）10%浓缩胶贮液：称Acr 10g及Bis 0.5g，溶于重蒸水中，最后定容至100mL，过滤后置棕色试剂瓶中，4℃贮存。
SDS-PAGE实验报告
生化实验总结报告实验名称：SDS - PAGE法测定蛋白质的相对分子量作者：田景辉（201306230114）专业：生物工程指导教师：许培雅日期：2015.12.30组员：杨瑞徐巧妹尹彪程健刘嘉南目录一、实验介绍 (3)二、实验原理 (3)三、实验材料、试剂、器皿 (4)四、操作步骤 (5)五、注意事项 (7)六、实验数据记录与处理 (7)七、总结与建议 (8)八、术语表 (9)九、参考文献 (9)十、附录 (9)一、实验介绍1.实验目的掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法和测定蛋白质分子量的技术。
2.实验背景在实验一中，用100g新鲜酵母用甲苯自溶法、研磨法、SDS（十二烷基苯磺酸钠）法进行了蔗糖酶的提取以及粗提取，得到初提取液A、热提取液B、乙醇提取液C。
最终得到9.0ml蔗糖酶初提取液。
实验二采用QAE-葡聚糖凝胶离子交换柱层析法进行蔗糖酶的纯化，得到经线性阶梯洗脱的分离液D1和经阶梯梯度洗脱的分离液D2。
实验三采用苯基琼脂糖凝胶柱层析法进行进一步纯化，得到经2mol/L(NH4)2SO4的0.05mol/L Tris-HCl ph7.3 缓冲液洗脱的分离液E1和经2mol/L NaCl的0.05mol/L Tris-HCl ph7.3 缓冲液洗脱的分离液E2。
二、实验原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠）， SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。
当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
PAGE测定蛋白质的相对分子量
五、实验步骤
7、 染色与脱色 、
小心将胶取出，置于一大培养皿中。加染色液染色 小心将胶取出，置于一大培养皿中。加染色液染色30min，倾出染色液，加入脱 ，倾出染色液， 色液，数小时更换一次脱色液，直至背景清晰。 色液，数小时更换一次脱色液，直至背景清晰。
8、相对分子量的计算 、
用直尺分别量出标准蛋白质、待测蛋白质区带中心以及溴酚蓝前沿距分离胶顶端 用直尺分别量出标准蛋白质、 的距离，按下式计算相对迁移率（ ）： 的距离，按下式计算相对迁移率（R）：
12% 3.35 2.5 0.1 4.0 50 10ml 10ml
浓缩胶的浓度 重蒸水/ml 0.5M Tis-HCl(pH6.8)/ml 10%SDS /ml 凝胶贮备液(Acr/Bis) /ml 10%过硫酸铵 /μl TEMED /μl 总体积 /ml
5% 2.92 1.25 0.05 0.8 25 5 5ml
TEMED/μl（最后加，防烧杯中聚合） 5
五、实验步骤
3、分离胶的灌制 、
按照上表左边操作。因加入 后凝胶就开始聚合， 按照上表左边操作。因加入TEMED后凝胶就开始聚合，故应立即混匀混合液，然后用滴管 后凝胶就开始聚合 故应立即混匀混合液， 吸取分离胶，在电泳槽的两玻璃之间灌注，避免气泡。留出梳齿的齿高加 空间以便灌注浓缩胶。 吸取分离胶，在电泳槽的两玻璃之间灌注，避免气泡。留出梳齿的齿高加1cm空间以便灌注浓缩胶。 空间以便灌注浓缩胶 用滴管小心地在溶液上覆盖一层重蒸水，将电泳槽垂直静置于室温下约 ～ 用滴管小心地在溶液上覆盖一层重蒸水，将电泳槽垂直静置于室温下约40～60min，待分离胶聚合 ， 完全后，除去覆盖的重蒸水。 完全后，除去覆盖的重蒸水。
PAGE测定蛋白质的 SDS - PAGE测定蛋白质的 相对分子量
SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量
【实验原理】
SDS与蛋白质结合后，还引起蛋白质构象的改变。蛋白 质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中 的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒。不同蛋白质的SDS复 合物的短轴长度都一样，而长轴则随蛋白质相对分子质量的 大小成正比的变化。这样的蛋白质-SDS复合物在凝胶中的迁 移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是椭圆棒 的长度，也就是蛋白质相对分子质量的函数。
【实验步骤】
一、安装垂直板型电泳装置
一、安装垂直板型电泳装置
将装好的电泳装置垂直放置，在长玻璃片下 端与硅胶框交界的缝隙内加入用电极缓冲溶液配 制的1%琼脂糖溶液，待其凝固后，即堵住凝胶 模板下面的窄缝（通电时又可作为盐桥）。
分离胶的配制
10%(ml)
H2O
10
30%丙烯酰胺
10
分离胶缓冲液(pH8.8)
【实验原理】
SDS是一种阴离子型去污剂，在蛋白质溶解液中加入 SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键还 原；SDS能使蛋白质的非共价键（氢键、疏水键）打开，并 结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS 结合比为1.4 g SDS/g蛋白质），形成蛋白质-SDS复合物。由 于SDS带有大量负电荷，当它与蛋白质结合时，所带的负电 荷的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种 类蛋白质间原有的电荷差异。
剥胶示意图
七、染色和脱色
倾出固定液，加入染色液。染色过夜。 染色完毕，倾出染色液，加入脱色液。数小时 换一次脱色液，直至背景清晰，约需一昼夜。
八、Mr的计算
量出加样端距细铜丝间的距离(cm)以及各蛋白质样品区 带中心与加样端的距离(cm)，按下式计算相对迁移率mr：
蛋白质样品迁移距离(cm) 相对迁移率mr = 溴酚蓝区带距加样端距离(cm)
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三、实验器材
1.直流稳压电泳仪 2.垂直平板电泳槽（含玻璃板、夹条、梳齿、夹子等） 3.移液器（1.0ml、200μl、20μl） 4.微量注射器（20μl） 5.烧杯、培养皿、试管、滴管、直尺 6.脱色摇床
四、实验试剂
1. 凝胶贮备液：丙烯酰胺（Acr）29.2g和亚甲基双丙烯酰胺（Bis）0.8g重蒸水
以标准蛋白质Mr的常用对数（lgMr）对相对迁移率作图，得到标准曲线。根据 待测蛋白质样品的相对迁移率，从标准曲线上查出其相对分子量的常用对数，再换算 出其相对分子量。
分离胶的浓度
l(pH8.8) /ml 2.5
10%SDS /ml
0.1
凝胶贮备液(Acr/Bis) /ml
4.0
10%过硫酸铵 /μl
50
TEMED/μl（最后加，防烧杯中聚合） 5
总体积 /ml
10ml
浓缩胶的浓度
5%
重蒸水/ml
2.92
0.5M Tis-HCl(pH6.8)/ml 1.25
10. 脱色液：50ml甲醇，75ml冰醋酸与875 ml重蒸水混合。 11. 待测蛋白样品。 12. 1%琼脂糖（最好用电极液配） 13. TEMED
五、实验步骤
1、洗净晾干电泳槽、玻璃板、夹条、梳齿等。安装后用1%琼脂糖封 玻璃板两侧及底部。
2、分离胶的选择和配置方法
1 2）分离胶和浓缩胶的配制方法
4、浓缩胶的灌制 （等分离胶聚合后配制）
按照上表右边操作。混匀后灌注在分离胶上。小心插入梳齿，避免混入气泡，将电泳槽垂直 静置于室温下至浓缩胶完全聚合（约40min）。
5、样品的制备
1）标准蛋白样品的制备 （样品约5-10μg，最好离心取上清加样） 取分装好的20 μl低相对分子质量标准蛋白质，放入沸水浴中加热3～5min，取出冷却。
0.5ml
β-巯基乙醇
1.0 ml
总体积10 ml
四、实验试剂
6. 电极缓冲液，pH8.3。
Tris3g，甘氨酸14.4g，SDS1.0g加重蒸水溶解定容至1000ml，4℃保存。
7. 低分子量标准蛋白质（上海产）。
开封后溶于200μl重蒸水，加200μl 2倍样品缓冲液（还原缓冲液），分装20小管，20℃保存。临用前沸水浴3～5min，其相对分子量（Mr）如下：
五、实验步骤
7、 染色与脱色
小心将胶取出，置于一大培养皿中。加染色液染色30min，倾出染色液，加入脱 色液，数小时更换一次脱色液，直至背景清晰。
8、相对分子量的计算
用直尺分别量出标准蛋白质、待测蛋白质区带中心以及溴酚蓝前沿距分离胶顶端 的距离，按下式计算相对迁移率（R）：
相对迁移率 = 样品迁移距离（cm）/ 指示剂迁移距离（cm）
2）待测样品的制备 （同标准蛋白质样品处理）
6、 电泳
1）待浓缩胶完全聚合后，标记好加样孔位置，将电泳槽注满电极缓冲液，小心拔出梳齿， 用电极缓冲液冲洗加样孔数次。
2）用微量注射器按次序向加样孔内加样。 3）接上电泳仪，上电极接电源负极，下极接正极。打开电源，调节电流至20～30mA并保 持电流强度恒定。待蓝色的溴酚蓝条带迁移至距凝胶下端约1cm时，停止电泳。
兔磷酸化酶B 97 400 牛血清白蛋白 66 200 兔肌动蛋白 43 000 牛碳酸酐酶 31 000 胰蛋白酶抑制剂 20 100 鸡蛋清溶菌酶 14 400
8. 质量浓度为10%过硫酸铵： （临用前配制） 9. 染色液：
0.25g考马斯亮蓝R250，加入40ml甲醇，10ml冰醋酸,蒸馏水定容至100ml，过滤。
10%SDS /ml
0.05
凝胶贮备液(Acr/Bis) /ml 0.8
10%过硫酸铵 /μl
25
TEMED /μl
5
总体积 /ml
5ml
五、实验步骤
3、分离胶的灌制
按照上表左边操作。因加入TEMED后凝胶就开始聚合，故应立即混匀混合液，然后用滴管 吸取分离胶，在电泳槽的两玻璃之间灌注，避免气泡。留出梳齿的齿高加1cm空间以便灌注浓缩胶。 用滴管小心地在溶液上覆盖一层重蒸水，将电泳槽垂直静置于室温下约40～60min，待分离胶聚合 完全后，除去覆盖的重蒸水。
溶 解后，定容至100ml，棕色试剂瓶4℃保存，30天内使用。
2. 分离胶缓冲液：1.5mol/L Tris-HCl，pH8.8。
18.15 Tris（三羟甲基氨基甲烷），少许重蒸水溶解，用1M HCl调pH8.8，重
蒸水定容至100ml，4℃保存。
3. 浓缩胶缓冲液：0.5mol/LHCl，pH6.8。
6gTris, 少许重蒸水溶解，用1M HCl调pH6.8，重蒸水定容至100ml，4℃保存。
4. 10%SDS，室温保存。
5. 两类样品缓冲液：
2倍还原缓冲液（2×reducing buffer）
0.5mol/L HCl，pH6.8 2.5 ml
甘油
2.0 ml
质量浓度10%SDS
4.0ml
质量浓度0.1%溴酚蓝