PCR原理及各类PCR仪
四种常见PCR仪的区别及运用-科邦实验室-2020.6.24
四种常见PCR仪的区别及运用PCR扩增仪（俗称PCR仪）PCR：PCR（聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。
PCR仪实际就是一个温控设备，能在95℃，55℃，72℃之间很好地进行温度控制。
PCR扩增仪又称为PCR基因扩增仪、PCR核酸扩增仪、聚合酶链反应核酸扩增仪，是利用PCR(Polymerase chain reaction，聚合酶链反应)技术对特定DNA扩增的一种仪器设备，被广泛运用于医学、生物学实验室中，例如用于判断检体中是否会表现某遗传疾病的图谱、传染病的诊断、基因复制以及亲子鉴定等。
根据DNA扩增的目的和检测的标准，可以将PCR仪分为普通PCR仪，梯度PCR 仪，原位PCR仪，实时荧光定量PCR仪四类。
1). 普通PCR仪（2万以下，赛默飞、伯乐、大龙，艾本德）一次PCR扩增只能运行一个特定退火温度的PCR仪称作传统PCR仪，也叫普通PCR仪。
如果要做不同的退火温度需要多次运行。
主要是用于简单的、对目的基因退火温度的扩增。
该仪器主要应用于科学研究、教学、医学临床、检验检疫等机构。
如:启步BSW-2P,BSW-3P,BSW-6P-I/II ,ABI 2720型2). 梯度PCR仪（2万-8万，赛默飞、伯乐、大龙，艾本德）一次性PCR扩增可以设置一系列不同的退火温度条件（温度梯度，通常有12种温度梯度）的PCR仪称作梯度PCR仪。
因为被扩增的不同DNA片段，其最适退火温度是不同的，通过设置一系列的梯度退火温度进行扩增，从而一次性PCR 扩增，就可以筛选出表达量高的最适退火温度，进行有效的扩增。
用于研究未知DNA退火温度的扩增，这样节约成本的同时也节约了时间。
PCR仪的种类
PCR仪的种类1. 实时定量PCR仪实时定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，简称实时定量PCR）是一种用于快速、敏感且准确测定DNA、RNA拷贝数目的方法。
实时定量PCR仪是进行实时定量PCR实验的关键设备之一。
实时定量PCR仪的主要特点是能够对PCR反应过程中产生的荧光信号进行即时检测和分析，从而实现实时监测PCR反应的进程，并测定样品中目标序列的拷贝数。
实时定量PCR仪的应用非常广泛，包括基因表达检测、病原体检测、单核苷酸多态性分析等。
其高灵敏度、高特异性以及广泛的应用领域使其成为现代分子生物学和遗传学研究的重要工具。
2. 普通PCR仪普通PCR仪是进行普通聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）实验的基本设备。
普通PCR仪可以进行常规PCR实验，即通过PCR反应在体外扩增目标DNA片段。
普通PCR仪的特点是温控系统可以实现快速、精确的温度调节，从而使PCR反应在不同温度下的环境条件得以满足。
普通PCR仪的操作简单、成本较低，适用于常规PCR 实验的需求。
普通PCR仪的应用广泛，包括基因克隆、DNA测序、基因检测等。
它已成为分子生物学、医学和生物技术等领域中的一种基础设备。
3. 数字PCR仪数字PCR仪是一种相对较新的PCR仪器，它采用数字分析的方法对PCR产物进行定量，具有极高的准确性和可靠性。
数字PCR仪的工作原理是将PCR反应体系分成数百、甚至上千个微小反应体，从而形成多个独立的PCR反应。
每个微小反应体内含有目标序列与参考序列，通过数百或数千个微小反应的计数结果进行定量分析。
这种方法可以极大地降低PCR反应中的误差，提高PCR反应的准确性。
数字PCR仪的应用主要集中在绝对定量PCR、稀释样品的精确定量、病原体检测等领域。
其高准确性和可靠性使其在遗传学研究和临床诊断中得到广泛应用。
PCR Protocol
聚合酶链式反应（PCR，Polymerase Chain Reaction）是一种分子生物学技术，通过特定的引物和DNA聚合酶，将特定的DNA片段在体外进行快速、特异的扩增。
以下是PCR的原理、所需试剂和耗材、实验仪器、准备工作、实验方法、注意事项、常见问题及解决方法。
一、PCR的原理PCR技术的基本原理是通过对DNA的双链进行特异性解旋，然后在DNA聚合酶的作用下，以解开的每一条单链为模板，将特定的引物与单链的5’端和3’端结合，形成起始复合物。
在适宜的温度和条件下，DNA聚合酶将从引物3’端开始延伸DNA链，并通过反复变性-延伸循环，实现DNA片段指数级扩增。
二、所需试剂和耗材1.引物：用于与模板DNA结合，指示DNA聚合酶从何位置开始延伸。
引物可以是人工合成的寡核苷酸，也可以是从RNA或天然DNA中提取的。
2.DNA模板：被扩增的DNA片段的原始双链分子。
3.DNA聚合酶：催化DNA复制的酶，如Taq DNA聚合酶。
4.dNTPs（脱氧核糖核苷三磷酸）：DNA合成的原材料，包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP。
5.缓冲液：调节反应液的pH值，一般含有Mg2+离子以及其他辅助因子。
6.耐高温的DNA分离酶抑制剂：防止在高温下DNA被破坏。
7.DEPC水：用于制备无RNA酶的水。
三、实验仪器1.基因扩增仪（PCR仪）：用于完成PCR的变性-延伸循环。
2.微量移液器：用于精确添加PCR反应液。
3.离心管：用于混合和离心PCR反应液。
4.水浴锅：用于PCR反应液保温。
5.电泳仪和电泳槽：用于分析扩增的DNA片段。
6.显微镜：观察细胞和组织样品。
7.分光光度计：用于测量DNA和RNA的浓度。
四、准备工作1.了解PCR的基本原理和步骤。
2.设计和制备引物：根据目的基因序列设计特异性引物。
3.准备基因组DNA或cDNA：从细胞或组织中提取基因组DNA或通过反转录制备cDNA。
4.缓冲液和其他试剂的准备：根据PCR试剂清单准备所有必需的试剂。
PCR原理及各类PCR仪
PCR原理及各类PCR仪PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链反应，是一种通过扩增DNA片段的技术。
PCR的基本原理是利用DNA聚合酶酶活性，在适当的条件下，通过DNA的复制和扩增来获得大量的DNA片段。
PCR技术已经广泛应用于医学、疾病诊断、基因工程和进化研究等领域。
PCR基本原理：PCR基本原理是在一系列温度变化的条件下，通过DNA引物与模板DNA相互结合和分离，并通过DNA聚合酶的作用逐步扩增产生大量目的DNA片段。
PCR步骤：1. 反应体系组成：反应体系包含DNA模板、引物（primer）、dNTP （脱氧核苷三磷酸）、Mg2+离子、缓冲液和DNA聚合酶等成分。
2. Denaturation（变性）：将反应体系加热至95°C，使得DNA双链变为两条单链DNA。
3. Annealing（退火）：将反应体系降温至适合引物与模板DNA结合的温度，引物与DNA模板互补序列结合形成DNA双链。
4. Extension（延伸）：将反应体系升温至DNA聚合酶最适温度，DNA聚合酶在引物的作用下，在引物上逐步延伸合成新的DNA链。
PCR类别：1.常规PCR：常规PCR是最简单和常用的PCR方法，可用于扩增目标DNA区域。
2.实时定量PCR（qPCR）：qPCR是一种测定PCR产物数量的方法，可以用于定量DNA或RNA浓度，以及检测基因表达水平。
3.逆转录PCR（RT-PCR）：RT-PCR将RNA反转录为cDNA，然后再进行PCR扩增，用于检测基因表达。
4.数字PCR（dPCR）：dPCR是使用分子方法计算DNA模板的浓度和扩增产物的绝对数量的技术。
5.巢式PCR：巢式PCR是在两步PCR中进行的，第一步是较高的退火温度安排，用于生成内部引物所需的DNA片段，第二步是较低的温度安排，用于增加PCR产物的数量。
6. 长PCR：长PCR用于扩增较大的DNA片段，通常超过5 kb，需要更长的扩增时间和更大的反应体积。
定量PCR原理及PCR仪光学原理
Quencher dye:
TAMRA (TaqMan 探针) Dark Quencher (MGB 探针)
Reference dye:
ROX
- passive internal reference for signal normalisation - allows relative (not absolute) fluorescence to be measured - critical for precision
Q
R
Q
AGGCCTTGAGAGATAT MGB
(minor groove binder)
R
提高探针Tm值
AGGCCTTGAQGAGATAT |||||||||||||||| GCTACACAGTCCGGAACTCTCTATAGCATCACAC
R 报告荧光 NFQ 无荧光淬灭基团 MGB 小沟结合物
27
3'
5'
典型的PCR分4个阶段
平台期 线性增长期 指数增长期 基线期
pcr仪的工作原理
pcr仪的工作原理PCR（聚合酶链式反应）仪是一种用于进行聚合酶链式反应的设备，其工作原理涉及温度控制、荧光探测等关键技术。
以下是PCR仪的基本工作原理：1. 变温块：PCR仪中的关键部分是一个能够控制温度的变温块。
这个块通常由热电偶或其他传感器探测样品的温度，然后根据PCR程序的要求，通过电加热或制冷来快速而精确地调整温度。
2. PCR程序：PCR通常包括一系列的温度循环，每个循环中都有不同的温度阶段。
最基本的PCR程序包括以下三个阶段：-变性（Denaturation）：在较高的温度（通常为94-98摄氏度），DNA的双链会分离为两条单链。
-退火（Annealing）：在较低的温度（通常为50-65摄氏度），引物（PCR反应中的引物是DNA链上的短序列）结合到目标序列的末端，形成引物-模板DNA复合物。
-延伸（Extension）：在中间的温度（通常为72摄氏度），DNA聚合酶沿着模板DNA 合成新的DNA链。
这是PCR的关键步骤，因为它会在目标序列的每个引物结合点上生成新的DNA。
3. 荧光探测：PCR仪中通常使用荧光探测系统来检测PCR反应的进程。
这可以通过引物或DNA与荧光染料结合，形成荧光信号。
在PCR的每一个周期，荧光信号都会被记录下来，从而能够实时监测PCR反应的进行。
4. 热盖：PCR仪还配备了一个热盖，用于避免PCR反应中的蒸发，并确保反应混合物的均匀受热。
总体而言，PCR仪通过精确控制温度循环，使PCR反应在不同温度下的三个步骤（变性、退火、延伸）重复进行，从而在短时间内扩增DNA。
荧光探测系统实时监测PCR的进程，使其成为一种高效、快速、精确的DNA扩增技术。
PCR仪
03
PCR仪相关配套仪器设备
仪器设备 PCR仪 荧光定量PCR仪 核酸蛋白分析仪 电炉/微波炉 电泳仪/电泳槽/电泳仪电源 凝胶成像系统 主要用途 用于基因扩增 用于基因扩增与数据分析 用于DNA浓度和纯度的测定 用于琼脂糖凝胶等的加热熔化。 用于PCR扩增后电泳分离纯化 用于电泳结果的观察、分析。 用于克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组 中特定基因序列的定性、定量检测和疾病的诊断 等方面。（分子生物学/临床诊断） 用于PCR科隆测序验证、突变体检测、新基因测 序、全基因组测序、系统发育及物种鉴定、个体 识别 亲缘鉴定、SPN关联分析、基因诊断等。 用于实验室废弃物等的灭菌。
01
基础知识
基础知识
一.PCR反应成分（PCR反应体系)：（五要素） 1.模板DNA：含有需要扩增的DNA片段。 2.引物：决定了需要扩增的起始和终止位置。 3.脱氧核糖三磷酸（dNTP）：4种脱氧核糖核酸，用于构造新的互补 链。 4.耐热DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶）：复制需要扩增的区域。 5.Mg2+:用于激活DNA聚合酶的活性中心。
基础知识
实验方法：
03
荧光定量PCR仪应用（食品、农业）
基础知识
实验：水稻及其产品中转基因成分实时荧光PCR检测方法 主要仪器： 实时荧光定量PCR仪；天平；冷冻研磨仪；消毒灭菌锅；制冰机；核酸蛋白分析仪； 高速冷冻离心机；台式小型离心机；Mini个人离心机；低温冰箱；旋涡振荡器；金属 浴；微量移液器。 实验流程： 制样
主要用于研究未知DNA退火温度的扩增。在不设置梯 一次性PCR扩增可以设置一系列不同的退火温度 度的情况下亦可当做普通的PCR用。主要：科研机构， 条件(通常12种温度梯度)。 医学临床研究，高等院校，病毒分析，疾控中心等。 主要是应用对细胞或组织内的DNA片段进行原位 扩增分析-即定位分析。无需将细胞破碎提取 主要用于医学临床研究，如癌细胞等。 DNA，细胞内有DNA酶的作用扩增受到一定的影 响，使用不是很普遍。
pcr扩增仪的原理特点应用论文
PCR扩增仪的原理特点应用论文引言PCR（Polymerase Chain Reaction）扩增技术是一种基于酶的体外DNA合成技术，是分子生物学领域中最重要的实验方法之一。
PCR扩增仪作为PCR技术的关键设备，在分子生物学和遗传学研究中发挥着重要作用。
本文将介绍PCR扩增仪的原理、特点和应用。
PCR扩增仪的原理PCR扩增仪基于聚合酶链式反应原理实现DNA的体外扩增。
聚合酶链式反应是一种无需模板DNA的体外复制方法，能够通过酶的作用，扩增特定的DNA序列。
PCR扩增仪主要包括以下三个步骤： 1. 变性（Denaturation）：将DNA模板加热至高温，使双链DNA解链成单链； 2. 退火（Annealing）：降低温度，使引物与模板DNA的单链进行互补结合； 3. 延伸（Extension）：在合适的温度下，聚合酶作用下，引物在模板DNA上延伸合成新的DNA链。
通过不断重复这三个步骤，可以在短时间内扩增特定DNA序列。
PCR扩增仪通过精确控制温度和时间，实现PCR扩增反应的自动化、高效化。
PCR扩增仪的特点PCR扩增仪具有以下特点： - 精确控制温度：PCR扩增仪能够精确控制反应体系的温度，在不同步骤之间快速切换，满足PCR反应的温度要求。
- 可编程控制：PCR扩增仪通常配备可编程控制器，用户可以根据需要设置不同的温度和时间参数，满足不同扩增反应的要求。
- 高温均匀性：PCR扩增仪内部采用特殊的加热系统和温度传感器，能够实现高温均匀性，确保PCR反应的稳定性和可靠性。
- 自动化操作：PCR扩增仪具有自动化的操作功能，可以自动完成变性、退火、延伸等步骤，无需手动干预，提高实验效率。
- 安全性：PCR扩增仪在设计上考虑了安全因素，如过高温度时的自动停止功能，防止设备和实验物品损坏。
- 小型便携：PCR扩增仪通常具有小型便携的特点，方便携带和移动，适用于实验室和野外等不同环境。
PCR扩增仪的应用PCR扩增仪在分子生物学和遗传学研究中具有广泛的应用。
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Stratagene： MX3000P、MX3005P；
Roche：LightCycler 480、LightCycler2.0、LightCycler Nano； Eppendorf ：Masercycler；
数字PCR
数字PCR即Digital PCR（dPCR)，是一种核酸分子绝对定量技 术。相较于荧光定量PCR，数字PCR可让你能够直接数出DNA 分子的个数，是对起始样品的绝对定量。 应用： 1、绝对定量 2、稀有突变检测（传染病研究如HIV） 3、转基因检测 4、环境样本检测 5、单细胞基因表达 6、病毒载量鉴定
基团，PCR反应过程中，利用荧光信号积累 实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线 对起始模板进行定量分析的方法。 目的：获得初始模板DNA的浓度。
荧光定量PCR仪的关键是温控和荧光激发、检 测系统！
如何定量？
Ct值的概念 Ct值的定义是PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进 入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数。
PCR原理及各类PCR仪
PCR原理
PCR全称是Polymerase Chain Reaction，即聚合酶 链式反应，是一种用于体外扩增特定的DNA片段的 分子生物学技术，PCR的最大特点，是能将微量的 DNA通过复制大幅增加。
PCR技术发展历程
普通PCR（梯度） 荧光定量PCR 数字PCR
定量原理
确定初始模板的浓度
初始 DNA量越多, 荧光
达到某一值（域值）时 所需要的循环数越少
Log浓度与循环数呈线性
关系，根据样品扩增达 到域值的循环数就可计 算出样品中所含的模板 量
1、染料法 SYBR Green 1 染料只有和双 链DNA结合后才发荧光
荧光定量PCR两种
2、探针法
普通PCR（梯度）
简单进行DNA复制扩增，然后可用电泳或者紫外分光光度计 进行扩增产物的检测。 目的：大量获得复制的DNA产物
普通PCR仪（梯度PCR仪）其实就是一台温控仪！
关键部件是温控模块！
PCR反应图解和要素
要素 1、模板DNA 2、dNTP 3、Taq酶 4、引物 5、精确的变化的温度
市场上主要的品牌和产品
AB：2720、9700、ProFlex、Veriti Bio-Rad：MJ Mini、MyCycler、PTC200、 PTC240、C1000、S1000 Eppendorf：Mastercycler pro S/pro/pro 384
荧光定量PCR
荧光定量PCR：在PCR反应体系中加入荧光
*8 其他要求：近5年内浙江省定量PCR（须为96孔板标准型配置），用户不少于100个，提 供详细清单。
市场上主要的品牌和产品
ABI：7000、7300、7500、7700、7900HT、StepOnePlus、 StepOne、PRISM StepOne； 2015年新发产品：7300Plus！！ BIO-RAD：CFX96、iQ5、MyiQ、DNA Engine Opticon 2、 Chromo4、MiniOpticon；
数字PCR原理
一、油包水法 代表品牌：Bio-Rad（QX100、QX200）、Raindance （Raindrop） 使用成本：RainDance一个样本反应30-40美元
数字PCR原理
二、芯片法 代表品牌：AB（ QuantStudio 3D ） 使用成本：一个反应10美元（芯片+耗材）
PCR仪三种控温方法的区别
（CALCULATED、BLOCK、PROBE）
以bio-rad的 PCT-200型PCR仪为例：
A） 计算控制（ calculated ） 计算控制在运行大多数程序中是最好的温度控制方法，具有较好 的温度一致性、可靠性。用计算控制时，仪器通过对样品的管子或玻 片热传导的速度和样品体积进行模块温度估算（当运行程序时，这些 样品信息都会显示）。因为这种估算是根据已知容量和热力学的规律， 所以温度比模块或探针控制更加精确。运行计算控制能缩短实验时 间，简短的程序操作能保护酶的活性并减少引物的损失。 B） 模块控制（ block ） 模块控制与计算控制精度相比较低。在模块控制下，样品温度通 常是在模块后才到达设置的温度。这段延迟时间主要是因为管子的类 型和样品体积引起的。 C） 探针控制（ probe ） 通常，探针控制可用于不同的环境中，但是它需要小心使用。探 针不能用于微型板和玻片。
衡量普通PCR仪的参数 （以THERMO的ARKTIK为例）
样品模块规格：96×0.2ml、384×0.03ml、双48孔×0.2ml 温度梯度范围：1-30℃ 升降温速率：>3℃/s 温度均一性：±0.4℃（95℃时） 温度精确性度： ±0.3℃ 温控范围：4-99.9℃ 热盖温控范围：30-110℃可调 用户界面：反应曲线图显示 尺寸 重量 电压 数据交换（USB接口） 保质期
视频资料—QUANTSTUDIO™3D 数字PRC系统
/life/index.html
2.5 检测性能 2.5.1 检测灵敏度：能检测到≤10个拷贝数的模板，置信度99.7% 2.5.2 线性范围：109以上 2.5.3 检测分辨率：99.7%置信度下能有效分辨5000和10000模板拷贝 数的差异 2.6 分析功能 2.6.1 定量量型：能进行绝对定量和相对定量, 可同时对无限个数据同 时进行分析，比对和作柱形图 2.6.3 分析应用：可以进行熔解曲线分析、突变分析、等位基因分析等 2.7 软件系统 2.7.1 定量PCR软件：有绝对定量和相对定量软件 *2.7.2 PrimerExpress软件 ：有，含正版引物与探针设计软件，可进 行Taqman MGB探针的设计及合成 2.7.3 荧光校正软件：有 *2.7.4 拷贝数分析软件：有，含CopyCaller分析软件 2.7.5 独立相对定量软件：有，可同时对无限个数据同时进行分析 *2.7.6 SNP分析软件：有，含AutoCaller分析软件
2.2 样品系统 2.2.1 样品通量: 单管、8联管、96孔板，并无需适配器 2.2.2 反应体积: 10-100ul 2.2.3 运行时间: <2小时 2.2.4 机械设计: 样品无需移动 2.2.5 反应后保存: 可降温至4℃保存
2.3 荧光系统 2.3.1 荧光染料：FAMTM/SYBR Green I, VIC /JOETM, NEDTM/TAMRATM/Cy3, ROXTM/Texas Red, Cy5 2.3.2 荧光校正：软件支持Rox荧光校正去除误差 2.4 光学系统 2.4.1 激发光源：卤钨灯，配备时间监测及自我诊断程序 2.4.2 滤光系统：五色光源滤光片结合荧光滤光片（630nm-650nm， 570nm-590nm，540nm-550nm，510nm-530nm，455nm-485nm） 2.4.3 检测系统：CCD摄像机一次成像 2.4.4检测方式：实时动态检测，动态显示，可同时检测5种荧光染料， 必须有520nm，550nm，580nm，610nm，650nm这五块滤光片 *2.4.5 实验要求：必须能同时检测FAM、VIC、TAMRA、ROX四种 荧光，能进行探针法定量，开展CNV研究
3 基本配置和附件 3.1 商用主流计算机及UPS 3.2 安装试剂盒和纯荧光校正板 3.3 RNASE P校验板 3.4 SDS系统操作软件 3.5 Primer Express3.0引物和探针设计软件 4 选件：无 5 资格证明：有ISO9001质量认证，符合CE认证，有医疗器械注册证 6 技术服务 6.1 安装、调试：需要原生产厂家现场安装调试 6.2 培训：需要原生产厂家进行安装培训和售后培训 6.3 技术资料：全套安装、操作和维护使用说明书，软件免费更新 7 质量保修期 7.1 保修期：自验收合格日起整机（包括配件）一年全保，终身维护 7.2 保修点：国内至少三个保修点可提供部件更换，原厂专业维修 Fra bibliotek
2.8 试剂盒 2.8.1 安装试剂盒：有 2.8.2 基本试剂盒：原厂家可提供完备的基本试剂盒供选择 2.8.3 SNP试剂盒：可提供原厂家500万种SNP检测试剂盒 2.8.4 转基因检测试剂盒：原厂家可提供国际标准的转基因检测试剂盒 2.8.5 拷贝数试剂盒：可提供原厂家160万种SNP检测试剂盒并有配套 分析模块 2.8.6 药物代谢酶分型试剂盒：原厂家可提供药物代谢酶SNP分型试剂 盒 2.8.7 MicroRNA分析试剂盒：原厂家可提供包含有针对人、小鼠、大 鼠、拟南芥、果蝇和线虫的MicroRNA分析产品。 2.8.8 基因表达试剂盒：可提供原厂家100万种基因表达检测试剂盒 *2.9 试剂、耗材：开放式 2.10 装机指标：99.7%的置信度下分辨5000和10000模板拷贝数的差 异
AC G TGCAC T GTA G G AT GG AT GT C AG CA AT C C C C TAC
衡量荧光定量PCR仪的参数（招标）
（以AB 7500为例）
1 工作条件：220V电压，10A电源。相对湿度<80%。热功率<2600W 2 技术规格 2.1 热循环系统 2.1.1 加热冷却方式: 半导体 2.1.2 升降温速率: 3.5℃/秒以上 *2.1.3 温度范围: 4℃-99.9℃ *2.1.4 控温精确度:±0.25℃