完整版PCR技术原理.ppt
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PCR技术教程PPT课件
Ct值的含义：每个反应管内的荧光信号到达设定的 阈值时所经历的循环数。
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特别说明： 1、荧光探针和荧光染料：
分别用探针或荧光染料与特异序列结合来指示扩增产物，前者特异性高， 后者操作简单。
TaqMan探针：寡核苷酸探针，荧光基团连接在5’端，淬灭基因连在3’
端。5’端荧光基团吸收能量后转移给临近的3’端淬灭基团，发生共振能 量转移（FRET），只要探针完整，能量就会被淬灭。
GC含量；避免连续相同碱基排列或开成回纹结构；避免形成引 物二聚体。 5、Tm=(G+C)×4+(A+C) ×2 6、primer 5.0 7、模板纯度：不一定要纯，但要确定不含蛋白变性剂、DNA酶、 Mg2+螯合剂等。模板量（100ng/100μl）
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PCR类型：
普通PCR RT-PCR TAIL-PCR Real-time PCR 数字PCR
循 环
56℃ 72℃
退火 延伸
目的：引物先与模板匹配 1-2 min 目的：聚合酶在引物3’端加
核苷酸，合成新链
12℃ 保存
特异性强、灵敏度高、快速、简便
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循环次数 1 2 3 20 30
DNA数量 2 4 8
1048576 1073741824
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特殊说明：
1、Taq酶：具有5’→3’聚合酶和外切酶活性，无3’→5’外切酶活性， 不
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第9页/共71页
原理：在PCR反应体系中加入非特异性的荧光染料（如 SYBR GREEN 1）或特异性的荧光探针（如
Taqman探 针），利用荧光信号累积实时检测整个PCR过程，
再 通过标准曲线或内参基因对未知基因进行定量分析 的方法。
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特别说明： 1、荧光探针和荧光染料：
分别用探针或荧光染料与特异序列结合来指示扩增产物，前者特异性高， 后者操作简单。
TaqMan探针：寡核苷酸探针，荧光基团连接在5’端，淬灭基因连在3’
端。5’端荧光基团吸收能量后转移给临近的3’端淬灭基团，发生共振能 量转移（FRET），只要探针完整，能量就会被淬灭。
GC含量；避免连续相同碱基排列或开成回纹结构；避免形成引 物二聚体。 5、Tm=(G+C)×4+(A+C) ×2 6、primer 5.0 7、模板纯度：不一定要纯，但要确定不含蛋白变性剂、DNA酶、 Mg2+螯合剂等。模板量（100ng/100μl）
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PCR类型：
普通PCR RT-PCR TAIL-PCR Real-time PCR 数字PCR
循 环
56℃ 72℃
退火 延伸
目的：引物先与模板匹配 1-2 min 目的：聚合酶在引物3’端加
核苷酸，合成新链
12℃ 保存
特异性强、灵敏度高、快速、简便
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循环次数 1 2 3 20 30
DNA数量 2 4 8
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特殊说明：
1、Taq酶：具有5’→3’聚合酶和外切酶活性，无3’→5’外切酶活性， 不
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原理：在PCR反应体系中加入非特异性的荧光染料（如 SYBR GREEN 1）或特异性的荧光探针（如
Taqman探 针），利用荧光信号累积实时检测整个PCR过程，
再 通过标准曲线或内参基因对未知基因进行定量分析 的方法。
PCR的基本原理和应用 PPT课件
PCR 的 基 本 原 理 和 应 用
聚合酶链式反应（PCR Polymerase Chain Reaction）
一种人工在体外进行快速DNA片断扩增的方法。
PCR技术基本原理
PCR技术的基本原理 类似于DNA的 天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两 端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： 模板DNA的变性：模板DNA经加 热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或 经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮 反应作准备； 模板DNA与引 物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃ 左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； 引物的延伸：DNA模板--引物结合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反 应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链。重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多 的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循 环需 2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期 (Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
分子克隆(clone,cloned,cloning) 在生物体外用重组技术将特定基因插入载体分子中.将DNA片段(或基因)与载体 DNA分子共价连接，然后引入寄主细胞，再筛选获得重组的克隆，按克隆的目 的可分为DNA和cDNA克隆两类。
Cloning vectors (克隆载体):在基因工程重组DNA技
育，形成DNA-蛋白质复合物，电泳后用放射性自显影技 术可以确定DNA条带的位置，从而确定它与蛋白质是否 结合。
A DNA bound with more than one protein to form a larger complex.
聚合酶链式反应（PCR Polymerase Chain Reaction）
一种人工在体外进行快速DNA片断扩增的方法。
PCR技术基本原理
PCR技术的基本原理 类似于DNA的 天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两 端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： 模板DNA的变性：模板DNA经加 热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或 经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮 反应作准备； 模板DNA与引 物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃ 左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； 引物的延伸：DNA模板--引物结合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反 应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链。重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多 的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循 环需 2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期 (Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
分子克隆(clone,cloned,cloning) 在生物体外用重组技术将特定基因插入载体分子中.将DNA片段(或基因)与载体 DNA分子共价连接，然后引入寄主细胞，再筛选获得重组的克隆，按克隆的目 的可分为DNA和cDNA克隆两类。
Cloning vectors (克隆载体):在基因工程重组DNA技
育，形成DNA-蛋白质复合物，电泳后用放射性自显影技 术可以确定DNA条带的位置，从而确定它与蛋白质是否 结合。
A DNA bound with more than one protein to form a larger complex.
PCR技术的基本原理及应用 ppt课件
11、增效PCR（booster PCR）
当扩增少于1000拷贝的模板DNA时会遇到
两个问题：一是形成引物二聚体，一是非特异扩
增。消耗了引物和酶，而特异扩增产量降低。
对于这种情况，可设置二步PCR，先用较低
浓度的引物进行初级PCR，此时由于引物少，形
成产物二聚体的可能减少，但它并不影响靶序列
的扩增，只是由于引物少产量不高。约经15~20
和检测病理切片中含量ppt课较件 少的靶序列。
42
操作步骤
1. 细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适 于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入
2. PCR扩增细胞内目的片段
3. 原位杂交检测扩增产物
A.阳性对照
ppt课件
B.阴性对照
43
C.原位检测mRNA表达
8、逆转录PCR（RT-PCR）
Prize
ppt课件
2
精品资料
• 你怎么称呼老师？
• 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你 是否会认为老师的教学方法需要改进？
• 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭
• “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我 笨，没有学问无颜见爹娘 ……”
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
研究生课程
第五章 PCR技术及原理（4学时）
ppt课件
1
第一节 PCR的原理
Kary Mullis
research scientist in the 1980s at a California biotechnology company called Cetus
co-winner of 1993 Nobel
PCR的原理和操作过程ppt课件
PPCCRR反过应程条件95℃
PCR的特点
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
94
温
度 72
（℃）
55
22
DNA 2
形 成
条变
子链延伸
单性
DNA加倍
链
DNA单链
与引物复性
DNA双螺旋
重复1~3步 25~30轮
目的DNA片段 扩增100万倍以上
1第一轮2 扩增3
4
5
时间（min）
ppt精选
6
退 火 PCR的基本原理
3扩增 在PCR仪上设置PCR反应参数（具体数据根
据引物和扩增片段的大小而定）：94℃下加热4分钟左右 ；依次94℃变性1分钟，45℃退火1分钟，72℃延伸2分钟 ，循环32次左右；72℃下保温7分钟，使反应产物扩增充 分
4PCR扩增产物分析 PCR产物是否为特异性扩增，
其结果是否可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能 得出正确的结论。ＰＣＲ产物的分析，可依据研究对象和 目的不同而采用不同的分析方法
PCR过程 PCR的特点
第4轮扩增
ppt精选
12
PCR的特点
PCR 的特点
• 灵敏度高
1. 皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平
2. 能从100万个细胞中检出一个靶细胞
3. 病毒检测的灵敏度可达3个RFU 4. 细菌检测的最小检出率为3个细菌
1. 简便、快速
1. 一次性加好反应液，2～4 小时完成扩增 2. 扩增产物一般用电泳分析
2. 对标本的纯度要求低
1. 血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组 织等组织的粗提DNA
ppt精选
《PCR详细讲解》课件
Oligo
《PCR详细讲解》
《PCR详细讲解》
《PCR详细讲解》
《PCR详细讲解》
《PCR详细讲解》
Primer BLAST
《PCR详细讲解》
《PCR详细讲解》
《PCR详细讲解》
《PCR详细讲解》
《PCR详细讲解》
逆转录PCR
《PCR详细讲解》
逆转录PCR的原理
由一条RNA单链转录为互补DNA （cDNA）称作逆转录PCR（Reverse Transcription PCR，RT-PCR），由依 赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完 成。
《PCR详细讲解》
引物设计的基本原则
1、引物应具有足够的特异性。
如果需要从基因组等较复杂的模板中扩 增特定的DNA序列，则需要考虑目的DNA序列 的保守性，尽量避免所选引物设计区域序列 的非特异性。
引物与非特异序列的同源性不超过70% 或有连续8个互补碱基。
NCBI Primer BLAST
《PCR详细讲解》
24个核苷酸。 识别mRNA的3’端poly（A）尾，
因此仅mRNA可被逆转录。
《PCR详细讲解》
逆转录引物：
（3）特异性引物 能与目标RNA碱基序列互补的寡
核苷酸引物，仅产生待分析基因的 cDNA。
《PCR详细讲解》
半定量 RT-PCR
《PCR详细讲解》
基本概念
半定量RT-PCR（semi-quantitatie reverse transcription and polymerase Chain reaction ,SqRT-PCR）是常用的一种简捷、特 异的定量RNA测定方法，通过mRNA反转录成cDNA，再进行PCR扩增， 并测定PCR产物的数量，可以推测样品中特异mRNA的相对数量。
PCR技术的原理与应用ppt课件
2
1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌 (thermus aquaticus) 中提取到一种耐热的DNA聚合酶。此 酶耐高温，并提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了 扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而 其灵敏性也大大提高。此酶的发现使PCR技术被广泛的应用。
13
锚定PCR ： 锚定PCR（Anchored PCR, A-PCR）主要用于分析具有可
变末端的DNA序列，Loh等用锚定PCR对人外周血淋巴细胞T 细胞受体α-链的mRNA的多变性进行了分析。先合成cDNA， 并用末端脱氧核苷酸转移酶在其3’-可变区末端加上一个 PolyG尾巴。Loh等在恒定区与可变区连接部位设一个引物， 另一个引物是一个具5’-polyG尾巴的引物。带有PolyG尾巴的 引物是一个固定点，它可以并与PolyG尾巴结合，无论其余部 分序列如何，只识别片段末端，利用此法可从前述mRNA中检 出至少20种不同序列，每一种都是独特的，表明锚定PCR不对 任何特殊序列有倾向性结果，可用于T细胞、肿瘤及其它部位 抗体基因的研究。
8
Mg2+浓度：Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著 的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为 200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。 Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物 减少。
9
2.PCR技术的主要类型及其应用
14
锚定PCR原理示意图
15
标记PCR和彩色PCR：
标记PCR(Labelled Primers，LP-PCR)，LP-PCR是利 用同位素或荧光素对PCR引物的5‘端进行标记，用来检测 靶基因是否存在。彩色PCR(Color Complementation assay PCR，CCAPCR)，是LP-PCR的一种。它用不同颜色的荧 光染料标记引物的5’端，因而扩增后的靶基因序列分别带 有引物5‘的染料，通过电泳或离心沉淀，肉眼就可根据不 同荧光的颜色判定靶序列是否存在及其扩增状况，此法可 用来检测基因的突变，染色体重排或转位，基因缺失及微 生物的型别鉴定等。
1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌 (thermus aquaticus) 中提取到一种耐热的DNA聚合酶。此 酶耐高温，并提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了 扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而 其灵敏性也大大提高。此酶的发现使PCR技术被广泛的应用。
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锚定PCR ： 锚定PCR（Anchored PCR, A-PCR）主要用于分析具有可
变末端的DNA序列，Loh等用锚定PCR对人外周血淋巴细胞T 细胞受体α-链的mRNA的多变性进行了分析。先合成cDNA， 并用末端脱氧核苷酸转移酶在其3’-可变区末端加上一个 PolyG尾巴。Loh等在恒定区与可变区连接部位设一个引物， 另一个引物是一个具5’-polyG尾巴的引物。带有PolyG尾巴的 引物是一个固定点，它可以并与PolyG尾巴结合，无论其余部 分序列如何，只识别片段末端，利用此法可从前述mRNA中检 出至少20种不同序列，每一种都是独特的，表明锚定PCR不对 任何特殊序列有倾向性结果，可用于T细胞、肿瘤及其它部位 抗体基因的研究。
8
Mg2+浓度：Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著 的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为 200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。 Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物 减少。
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2.PCR技术的主要类型及其应用
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锚定PCR原理示意图
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标记PCR和彩色PCR：
标记PCR(Labelled Primers，LP-PCR)，LP-PCR是利 用同位素或荧光素对PCR引物的5‘端进行标记，用来检测 靶基因是否存在。彩色PCR(Color Complementation assay PCR，CCAPCR)，是LP-PCR的一种。它用不同颜色的荧 光染料标记引物的5’端，因而扩增后的靶基因序列分别带 有引物5‘的染料，通过电泳或离心沉淀，肉眼就可根据不 同荧光的颜色判定靶序列是否存在及其扩增状况，此法可 用来检测基因的突变，染色体重排或转位，基因缺失及微 生物的型别鉴定等。
PCR技术原理ppt
• PCR反应用耐高温的 Taq DNA聚合酶，一 次性地将反应液加好后，即在DNA 扩增液 和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般 在2~4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用 电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污 染、易推广
PCR基本原理
PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)是一种选择性 体外扩增DNA或RNA的方法.它包括三个基本步骤: (1) 变性 (Denature):目的双链DNA片段在94℃下解链; (2) 退火(Anneal):两种 寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键 配对;(3) 延伸(Extension): DNA模板—引物结合物在TaqDNA聚合酶 的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保 留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复 循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而 且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。(Plateau)。 到达 平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。 。
聚合酶链式反应也可以当作一项极其重要的酶促合成 DNA技术。PCR又称为无细胞克隆系统或特异性DNA序列体 外引物定向酶促扩增法，是基因扩增技术的一次重大革新，它 可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍。
70年代初，Kleppe等人就提出了PCR的工作原理。Saiki （1985）和Mullis（1986）两家研究室分别用改进的Kleppe 法获得了大量染色体DNA单拷贝基因。当时的PCR技术须在 每次变性和退火后，扩增反应前重新加入DNA聚合酶。1988 年，由于在PCR系统引入了热稳定的TaqDNA聚合酶，这是从 水生栖热菌（Thermusaquaticus）中提取的耐热DNA聚合酶， 简称Taq DNA聚合酶。多次循环后的Taq DNA聚合酶仍然具 有活性，因此反应体系自动往复多次地进行对所需的DNA的 片段的酶促合成，使反应产物按指数增长，所以命名为聚合酶 链式反应。
PCR基本原理
PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)是一种选择性 体外扩增DNA或RNA的方法.它包括三个基本步骤: (1) 变性 (Denature):目的双链DNA片段在94℃下解链; (2) 退火(Anneal):两种 寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键 配对;(3) 延伸(Extension): DNA模板—引物结合物在TaqDNA聚合酶 的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保 留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复 循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而 且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。(Plateau)。 到达 平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。 。
聚合酶链式反应也可以当作一项极其重要的酶促合成 DNA技术。PCR又称为无细胞克隆系统或特异性DNA序列体 外引物定向酶促扩增法，是基因扩增技术的一次重大革新，它 可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍。
70年代初，Kleppe等人就提出了PCR的工作原理。Saiki （1985）和Mullis（1986）两家研究室分别用改进的Kleppe 法获得了大量染色体DNA单拷贝基因。当时的PCR技术须在 每次变性和退火后，扩增反应前重新加入DNA聚合酶。1988 年，由于在PCR系统引入了热稳定的TaqDNA聚合酶，这是从 水生栖热菌（Thermusaquaticus）中提取的耐热DNA聚合酶， 简称Taq DNA聚合酶。多次循环后的Taq DNA聚合酶仍然具 有活性，因此反应体系自动往复多次地进行对所需的DNA的 片段的酶促合成，使反应产物按指数增长，所以命名为聚合酶 链式反应。
PCR技术的原理与方法.ppt.ppt
模板（靶基因，TARGET GENE）
模板核酸的量与纯化程度，是 PCR 成败与否 的关键环节之一 传统的 DNA 纯化方法通常采用 SDS 和蛋白酶 K 来消化处理标本
SDS 的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而 溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白， SDS 还能与蛋白质结合而沉淀 蛋白酶K 能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白, 再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份， 用乙醇或异丙醇沉淀核酸
依据材料概括晚清中国交通方式的特点，并分析其成因。
提示：特点：新旧交通工具并存(或：传统的帆船、独轮车， 近代的小火轮、火车同时使用)。 原因：近代西方列强的侵略加剧了中国的贫困，阻碍社会发 展；西方工业文明的冲击与示范；中国民族工业的兴起与发展；
政府及各阶层人士的提倡与推动。
[串点成面· 握全局]
制了列强的经济侵略，但是并未能阻止其侵略。故B、C、D
三项表述都有错误。 答案：A
二、近代以来交通、通讯工具的进步对人们社会生活的影 响
(1)交通工具和交通事业的发展，不仅推动各地经济文化交
流和发展，而且也促进信息的传播，开阔人们的视野，加快 生活的节奏，对人们的社会生活产生了深刻影响。 (2)通讯工具的变迁和电讯事业的发展，使信息的传递变得 快捷简便，深刻地改变着人们的思想观念，影响着人们的社
航空都获得了一定程度的发展。
(2)近代中国交通业受到西方列强的控制和操纵。 (3)地域之间的发展不平衡。 3．影响 (1)积极影响：促进了经济发展，改变了人们的出行方式，
一定程度上转变了人们的思想观念；加强了中国与世界各地的
联系，丰富了人们的生活。 (2)消极影响：有利于西方列强的政治侵略和经济掠夺。
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DNA的变性从开始解链到完全 解链是在一个相当窄的温度内完成 的。
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增色效应：
DNA变性后对 260nm紫外光收 增加的现象。
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DNA的复性（renaturation)：
在适当条件下，变性DNA的两条 互补链可再恢复成天然的双螺旋结 构的过程。
热变性的DNA经缓慢冷却后即可复 性，此过程称为退火(annealing)。
③ 离子强度↑→有利于复性 ④ DNA浓度↑→复性↑
Tm值的估算
① <20bp Tm=4（G+C）+2（A+T）
② >20bp Tm=69.3+0.41(G+C)%
③
Tm=81.5℃+16.6lgM+0.41（G+C）%
-500/n-0.61×（甲酰胺%）
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PCR技术总论
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12
聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)简称 ＰＣＲ，是一项在短时间内大量扩增特定的ＤＮＡ 片段的分子生物学技术。
10ul 各200umol/L 10～100pmol 0.1～2ug
2.5u
Mg2+ 加双或三蒸水至
1.5mmol/L 100ul
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19
PCR反应五要素
• 引物（primer） • 酶 （Taq DNA polymerase） • dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP） • 模板 （template） • Mg2+ （magnesium）
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减色效应：
变性DNA复性后 对260nm紫外光 吸收减少的现象。
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1. 常用的变性方法： ① 热变性 ② 酸碱变性 ③ 化学试剂变性
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2. 影响复性的因素 ① 序列简单的分子复性快，如poly(dT)和poly(dA)
识别快
② DNA片段愈大，扩散速度愈低，复性慢
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点
– 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶 切分析或分子克隆很有好处
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23
引物设计的原则（三）
⑦引物的特异性：
– 引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同 源性
⑧引物量：
– 每条引物的浓度0.1 ~ 1umol或10 ~ 100 pmol， 以最低引物量产生所需要的结果为好
– ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶
核苷酸的成串排列 优选文档
22
引物设计的原则（二）
④避免引物内部出现二级结构
– 避免两条引物间互补， 特别是 3’端的互补，否 则会形成引物二聚体，产生非特异性的扩增条带
⑤引物 3’端的碱基要求严格配对
– 特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端 碱基不配对而导致PCR失败
– 引物的有效长度不能大于 38 mer，否则最适延伸 温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度（74℃）， 不能保证PCR扩增产物的特异性
②引物扩增跨度：以500bp为宜
– 特定条件下可扩增长至10kb的片段
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜
– G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异 条带
是PCR特异性反应的关键
• PCR 产物的特异性取决于引物与模板 DNA互补的程度
• 理论上，只要知道任何一段模板DNA序 列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做
引物，用 PCR就可将模板DNA在体外大
量扩增
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21
引物设计的原则（一）
①引物长度： 15-30bp，常用为20mer左右
东胜创新
聚合酶链式反应也可以当作一项极其重要的酶促合成 DNA技术。PCR又称为无细胞克隆系统或特异性DNA序列体 外引物定向酶促扩增法，是基因扩增技术的一次重大革新，它 可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍。
70年代初，Kleppe等人就提出了PCR的工作原理。Saiki （1985）和Mullis（1986）两家研究室分别用改进的Kleppe 法获得了大量染色体DNA单拷贝基因。当时的PCR技术须在 每次变性和退火后，扩增反应前重新加入DNA聚合酶。1988 年，由于在PCR系统引入了热稳定的TaqDNA聚合酶，这是从 水生栖热菌（Thermusaquaticus）中提取的耐热DNA聚合酶， 简称Taq DNA聚合酶。多次循环后的Taq DNA聚合酶仍然具 有活性，因此反应体系自动往复多次地进行对所需的DNA的 片段的酶促合成，使反应产物按指数增长，所以命名为聚合酶 链式反应。
东胜创新
PCR基本原理
PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)是一种选择性 体外扩增DNA或RNA的方法.它包括三个基本步骤: (1) 变性 (Denature):目的双链DNA片段在94℃下解链; (2) 退火(Anneal):两种 寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键 配对;(3) 延伸(Extension): DNA模板—引物结合物在TaqDNA聚合酶 的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保 留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复 循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而 且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。(Plateau)。 到达 平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。 。
PCR原理
变性与复性
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DNA的变性(denaturation)：
在某些理化因素作用下，DNA 分子内碱基对之间的氢键断裂，使 规则有序的双螺旋结构变为不规则 无序的单链线团样结构的过程。
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解链温度（融解温度，Tm） (melting temperature)：
使50%的DNA发生变性时的环 境温度。
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PCR原理
Sample denaturatation Primer annealing Primer extension
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PCR product
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PCR反应曲线
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标准的PCR反应体系
• 10×扩增缓冲液 4种dNTP混合物 引物 模板DNA Taq DNA聚合酶
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增色效应：
DNA变性后对 260nm紫外光收 增加的现象。
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DNA的复性（renaturation)：
在适当条件下，变性DNA的两条 互补链可再恢复成天然的双螺旋结 构的过程。
热变性的DNA经缓慢冷却后即可复 性，此过程称为退火(annealing)。
③ 离子强度↑→有利于复性 ④ DNA浓度↑→复性↑
Tm值的估算
① <20bp Tm=4（G+C）+2（A+T）
② >20bp Tm=69.3+0.41(G+C)%
③
Tm=81.5℃+16.6lgM+0.41（G+C）%
-500/n-0.61×（甲酰胺%）
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PCR技术总论
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聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)简称 ＰＣＲ，是一项在短时间内大量扩增特定的ＤＮＡ 片段的分子生物学技术。
10ul 各200umol/L 10～100pmol 0.1～2ug
2.5u
Mg2+ 加双或三蒸水至
1.5mmol/L 100ul
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PCR反应五要素
• 引物（primer） • 酶 （Taq DNA polymerase） • dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP） • 模板 （template） • Mg2+ （magnesium）
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减色效应：
变性DNA复性后 对260nm紫外光 吸收减少的现象。
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1. 常用的变性方法： ① 热变性 ② 酸碱变性 ③ 化学试剂变性
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2. 影响复性的因素 ① 序列简单的分子复性快，如poly(dT)和poly(dA)
识别快
② DNA片段愈大，扩散速度愈低，复性慢
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点
– 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶 切分析或分子克隆很有好处
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引物设计的原则（三）
⑦引物的特异性：
– 引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同 源性
⑧引物量：
– 每条引物的浓度0.1 ~ 1umol或10 ~ 100 pmol， 以最低引物量产生所需要的结果为好
– ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶
核苷酸的成串排列 优选文档
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引物设计的原则（二）
④避免引物内部出现二级结构
– 避免两条引物间互补， 特别是 3’端的互补，否 则会形成引物二聚体，产生非特异性的扩增条带
⑤引物 3’端的碱基要求严格配对
– 特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端 碱基不配对而导致PCR失败
– 引物的有效长度不能大于 38 mer，否则最适延伸 温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度（74℃）， 不能保证PCR扩增产物的特异性
②引物扩增跨度：以500bp为宜
– 特定条件下可扩增长至10kb的片段
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜
– G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异 条带
是PCR特异性反应的关键
• PCR 产物的特异性取决于引物与模板 DNA互补的程度
• 理论上，只要知道任何一段模板DNA序 列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做
引物，用 PCR就可将模板DNA在体外大
量扩增
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引物设计的原则（一）
①引物长度： 15-30bp，常用为20mer左右
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聚合酶链式反应也可以当作一项极其重要的酶促合成 DNA技术。PCR又称为无细胞克隆系统或特异性DNA序列体 外引物定向酶促扩增法，是基因扩增技术的一次重大革新，它 可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍。
70年代初，Kleppe等人就提出了PCR的工作原理。Saiki （1985）和Mullis（1986）两家研究室分别用改进的Kleppe 法获得了大量染色体DNA单拷贝基因。当时的PCR技术须在 每次变性和退火后，扩增反应前重新加入DNA聚合酶。1988 年，由于在PCR系统引入了热稳定的TaqDNA聚合酶，这是从 水生栖热菌（Thermusaquaticus）中提取的耐热DNA聚合酶， 简称Taq DNA聚合酶。多次循环后的Taq DNA聚合酶仍然具 有活性，因此反应体系自动往复多次地进行对所需的DNA的 片段的酶促合成，使反应产物按指数增长，所以命名为聚合酶 链式反应。
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PCR基本原理
PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)是一种选择性 体外扩增DNA或RNA的方法.它包括三个基本步骤: (1) 变性 (Denature):目的双链DNA片段在94℃下解链; (2) 退火(Anneal):两种 寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键 配对;(3) 延伸(Extension): DNA模板—引物结合物在TaqDNA聚合酶 的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保 留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复 循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而 且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。(Plateau)。 到达 平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。 。
PCR原理
变性与复性
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DNA的变性(denaturation)：
在某些理化因素作用下，DNA 分子内碱基对之间的氢键断裂，使 规则有序的双螺旋结构变为不规则 无序的单链线团样结构的过程。
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解链温度（融解温度，Tm） (melting temperature)：
使50%的DNA发生变性时的环 境温度。
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Sample denaturatation Primer annealing Primer extension
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PCR product
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PCR反应曲线
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标准的PCR反应体系
• 10×扩增缓冲液 4种dNTP混合物 引物 模板DNA Taq DNA聚合酶