酶生物改造
酶的生物改造共65页课件.ppt
4、定向进化的原理
在待进化酶基因的PCR扩增反应中，利用Taq DNA聚合 酶不具有3’->5’校对功能的性质，配合适当条件， 以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构建突变 库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化酶 (或蛋白质)，从而排除其他突变体。
定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。 定向进化=随机突变+选择。前者是人为引发的，后者
3、酶的定向进化技术
定义： 从一个或多个已经存在的亲本酶（天然或人为 获得）出发，经过基因突变和重组，构建一个 人工突变基因库，通过筛选最终获得预先期望 具有某些特性的进化酶；
所谓酶的体外定向进化，又称实验分子进化，属于蛋 白质的非合理设计，它不需事先了解酶的空间结构和 催化机制，通过人为地创造特殊的条件，模拟自然进 化机制(随机突变、重组和自然选择)，在体外改造酶 基因，并定向选择出所需性质的突变酶。
虽相当于环境，但只作用于突变后的分子群，起着选 择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，整个 进化过程完全是在人为控制下进行的
酶定向进化的过程和应用范围
蛋白质
随机突变 随机杂交
•稳定性 •活性 •有机溶液中的活性 •不同的底物的利用 •酸碱度 •蛋白质的表达 •亲和性 •专一性
性能
筛选
目达标到蛋目的白
三、酶定向进化的基本过程
随机突变 不同的定向进化方法构建突变基因 载体的选择，基因重组，组建基因
突变基因的筛选 平板筛选法，荧光筛选法，表面展示法
1、定向进化的方法
无性进化方法：易错PCR法，盒式诱变 有性进化方法
1）DNA改组法（DNA Shuffling) 2）体外随机重组法（RPR) 3）交错延伸法(StEP) 基因家族的同源重组 外显子的改组 杂合进化
蛋白质与酶的工程改造技术及其应用
蛋白质与酶的工程改造技术及其应用蛋白质是构成生物体细胞的基本结构单元，对于生命活动的各种过程都具有重要的作用。
酶则是生物体内催化反应的重要媒介，通过发挥催化活性加速生命过程，维持了细胞的生存。
传统的酶工程技术主要将重点放在酶的分离和纯化上，但是这种方法成本高、效率低，对于大规模生产和应用场景并不适用。
随着现代生物技术的不断发展，蛋白质与酶的工程改造技术不断更新，为生物制药、酶催化反应等领域提供了新的解决方案。
本文将介绍蛋白质与酶的工程改造技术及其应用。
一、蛋白质工程改造技术1.点突变技术点突变技术是将蛋白质基因的某个碱基或氨基酸序列进行改变，从而使其具有不同的功能、活性或特定的理化性质。
这种技术在人类疾病治疗、新型药物研发、工业酵素等领域有着广泛的应用。
例如，通过点突变技术可以将普通抗体转化为更强力、更稳定的人源化抗体，提高其在治疗上的效果；也可以将酵素的催化速率、热稳定性等进行调整，以适应特定的工业需求。
2.融合蛋白技术融合蛋白技术是将两个或多个不同蛋白质结构域进行连接，形成一个新的分子，从而具有多种不同的功能。
融合蛋白技术不仅可以产生新的蛋白质，还可以对原有蛋白质的稳定性、性质等进行调整。
例如，通过将大肠杆菌外膜蛋白（OmpA）与绿色荧光蛋白（GFP）进行融合，可以得到具有膜定位与荧光表达功能的融合蛋白，用于生物成像和药物靶向测定等领域。
3.点突变与融合蛋白技术的结合将点突变和融合技术相结合可以使得蛋白质的活性和稳定性得到双重提升。
例如，通过将发酵产物氨基酸脱羧酶（ADC）与乙醇磷酸酸转移酶（EPAT）进行融合，并进行点突变，可以得到具有更高催化效率和稳定性的蛋白质。
二、酶工程改造技术酶催化反应是生物科学和化学领域中的重要研究内容，具有广泛的应用前景。
酶工程改造技术可以通过改变酶的氨基酸组成、酶的整体结构、酶的环境条件等，调节酶的催化效率和稳定性，达到增强酶活性、改进反应过程、提高酶的选择性等目的。
酶分子的改造名词解释
酶分子的改造名词解释酶是生物体内用于催化化学反应的特殊蛋白质分子。
它们在细胞内起着至关重要的作用，参与几乎所有需要催化的生化反应。
然而，人类科学家发现，通过改造酶分子的结构和性质，可以进一步提高其催化效率和特异性，从而开辟了许多新的应用领域。
酶的改造方法可以分为两大类：一是合成生物学方法，通过改变酶分子的基因组或蛋白质序列来实现酶分子的改造；二是蛋白质工程方法，通过对酶分子的物理化学性质进行改变来实现酶的改造。
在合成生物学方法中，科学家们首先通过基因编辑技术对酶的基因组进行改造。
通过改变酶分子的基因组，可以使其产生特定的突变，从而改变酶的基本结构和性能。
例如，突变可能导致酶结构的稳定性增加，从而提高酶的催化效率；或者改变酶的亲和性，使其对底物的结合更加紧密。
此外，还可以通过引入外源基因来增强酶的催化活性或扩展其底物范围。
通过这些基因编辑技术，科学家们能够创造出全新的酶分子，具有特定的催化性质，可用于合成特定的化合物或处理环境中的有害物质。
另一方面，蛋白质工程方法是通过对酶分子的物理化学性质进行改变来实现酶的改造。
这些方法包括对酶分子的结构进行修饰、改变酶的局部结构以及引入特定的功能基团等。
例如，通过改变酶分子的酸碱性环境，可以改变其催化活性和特异性；或者通过引入特定的化学基团，可以增强酶的催化效率或改变其底物选择性。
蛋白质工程方法的发展使酶的改造更加灵活和高效，为应用于医药、环境保护、食品工业等提供了更多可能性。
酶分子的改造在许多领域中都具有广泛的应用前景。
在医药领域，改造酶分子能够增强药物的活性、改善药物的代谢途径、降低药物的副作用等。
在环境保护领域，改造酶分子可以应用于废水处理、大气污染控制等领域，从而提高环境质量和保护生态系统。
另外，改造酶还可以应用于食品工业中的食品添加剂的生产、酿酒业的发酵过程优化等。
总之，通过改造酶分子，可以创造出具有更高催化效率和特异性的酶，为我们解决许多重大问题提供了强有力的工具。
酶的基因工程改造与生产
酶的基因工程改造与生产酶是指生物体中具有催化生物化学反应的蛋白质，可以在温和条件下促进生物反应的发生。
因其具有高效、高选择性和温和的催化特性，成为工业界生产、医学领域和食品加工等领域的重要工具。
酶的基因工程改造和生产技术是实现大规模工业酶制剂生产的关键技术之一。
酶的基因工程改造酶的基因工程改造是指通过DNA重组技术将基因分离、修饰和组合，进而设计合成出具有新功能和性能的酶。
这项技术可以通过操纵目标酶的基因序列来改变其催化效率、特异性和稳定性等。
因此，酶的基因工程改造被广泛应用于生物技术、农业、医药、化工和食品工业等领域。
具体来说，酶的基因工程改造是通过以下步骤完成：1. 酶基因的克隆和表达。
将目标酶的基因序列扩增、重组和转移到表达载体中，使其可以在表达宿主中进行表达和生产。
2. 酶基因的定向演化。
通过定向演化技术对酶进行系统性改进，使其催化效率、特异性、稳定性等特性得到提高。
其中包括DNA重组、突变、异源启动子和剪接等方法。
3. 酶的进一步扩增和纯化。
将表达的目标酶发酵并经过分离、纯化和结晶等环节，使其可以达到工业生产的标准。
酶的基因工程改造技术优点在于可以通过合成和改进酶基因组达到调节酶的催化性能、调变应用环境等目的。
同时，该技术还能改变酶的物理化学特性，如催化效率、温度特性、酸碱特性，在许多工业酶制剂的生产中具有广泛应用前景。
酶的工业生产酶的工业生产是将酶类产品大规模应用于工业领域，如制浆造纸、合成食品添加剂、医药生产等，进而实现商业盈利和推动经济发展。
酶的高效生产必须结合基因工程改造技术、工艺优化和质量管理等多方面的知识和技能。
目前，酶的工业生产具有以下几个主要环节：1. 酶的基因工程改造。
通过设计合成酶基因组、利用后向技术等手段，使得酶的性能和催化效率得到大幅提升，从而达到酶的工业生产的要求。
2. 酶的发酵和生产。
酶的生产一般采用液体和固体发酵的方式，具有高效生产、规模化生产等特点。
优化发酵条件，利用基因工程的手段增加发酵附带酶的产生，大大提高了酶的生产量和分离纯度。
脂肪酶的生物学改造
脂肪酶的生物学改造叶纯1，2，王玉娟1*（1.中国科学院合肥物质科学研究院强磁场中心，合肥 230031；2.中国科学技术大学生命科学学院，合肥 230036）摘要：脂肪酶作为重要的生物催化剂，由于其反应条件温和、绿色环保被广泛应用于能源、食品、生物医药等领域，但适用于大型工业生产的经济型脂肪酶仍然有限，如何改造、开发出更多适用于工业生产中的理想型脂肪酶成为近年来研究热点。
综述了脂肪酶结构、催化机理，以及近年来脂肪酶改造的相关技术。
以期给相关科研工作者的未来研究工作以启发。
关键字：油脂；脂肪酶；改造；生物技术The biological modification of lipases and its applicationin oil industryYE Chun1,2,WANG Yujuan1*(1. High Magnetic Field Laboratory, Chinese Academy of Sciences, Hefei 230031, China; 2.School of Life Sciences, University of Science and Technology of China, Hefei 230026, China.) 随着绿色工业概念的提出，以酶作为催化剂的生物催化以其底物的高度选择性、专一性以及产物环境友好型的特点，逐渐成为工业生产中被广泛应用的催化手段。
脂肪酶是工业生产中重要的酶制剂[1]，具有催化特异性高、反应条件温和、副产物少以及环境友好等特点，被广泛应用于工业生产中，但是脂肪酶制剂造价高、酶与底物难分离、多余游离脂肪酶难回收等问题制约了天然脂肪酶的工业应用。
近年来，大量研究致力于对脂肪酶进行改造，生物技术的飞速发展更为为改造出更多适用于工业生产的理想脂肪酶制剂提供了有利的技术支持。
本文将综述脂肪酶的结构、催化机理及利用生物学技术对其进行改造的研究现状，对比各种技术优缺点。
酶分子改造的方法及应用
酶分子改造的方法及应用摘要：酶工程是研究酶的生产和应用的一门技术性学科，进入20世纪后，随着微生物发酵技术的发展和酶分离纯化技术的更新，酶制剂的研究得到不断推进并实现了其商业化生产，但直接利用酶制剂时存在酶的稳定性差、使用效率低、不能在有机溶剂中反应等缺点。
通过酶的修饰可提高酶的稳定性，消除或降低酶的抗原性，使之更适合生产和应用的要求。
近年来发展的蛋白质工程技术则使酶的定向改造成为可能。
随着生物技术的发展，酶工程将引起巨大的变革。
关键词：酶分子修饰蛋白质工程模拟酶引言：近年来，酶工程开始兴起，迅速发展，其研究成果也越来越广泛地运用于各个领域。
虽然如此，但是由于酶一离开其特定的环境条件就会变得不太稳定，不适合大批量生产的需求，因此，大规模应用酶和酶工艺的还不多。
在工业应用中，底物及产物带来的影响常常导致pH偏离酶作用的最适条件的中性范围，使酶难以发挥作用。
在临床应用上，绝大多数酶对人体而言都是外源蛋白质，具有抗原性，直接注入会引起人体的过敏反应。
所以人们希望能够通过各种人工方法改造酶，使其更能适应各方面的需要。
1.酶分子改造的方法1.1酶分子修饰酶分子修饰[1]（Modification of Enzyme Molecule）即通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的过程。
酶分子修饰在提高酶的活力、增强酶的稳定性、降低或消除酶的抗原性、研究各种物理因素对酶分子空间构象的影响，进一步探讨酶分子的结构与功能之间的关系等方面具有重要意义。
1.1.1酶分子的主链修饰酶分子的主链修饰[2]就是利用酶分子主链（肽链或核苷酸链）的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。
1.1.1.2主链的切断修饰[3]主链断裂后，引起酶活性中心的破坏，酶的催化功能丧失（用于探测酶活性中心的位置）。
酶活性中心的空间构象维持不变，酶的催化功能也可以保持不变或损失不多，但是抗原性有发生改变。
酶工程改造提升淀粉酶活性策略
酶工程改造提升淀粉酶活性策略酶工程改造提升淀粉酶活性策略一、淀粉酶概述淀粉酶是一类能够水解淀粉分子中糖苷键的酶的总称。
它在众多生物过程和工业应用中都发挥着至关重要的作用。
1.1 淀粉酶的分类根据作用方式和产物的不同，淀粉酶可分为多种类型。
其中，α-淀粉酶能够随机地水解淀粉分子内部的α-1,4-糖苷键，将淀粉分解为糊精和低聚糖；β-淀粉酶则从淀粉分子的非还原端开始，依次水解α-1,4-糖苷键，生成麦芽糖；糖化酶（葡萄糖淀粉酶）可以从淀粉分子的非还原端逐个水解α-1,4-糖苷键和α-1,6-糖苷键，最终将淀粉转化为葡萄糖。
此外，还有一些其他类型的淀粉酶，如异淀粉酶、普鲁兰酶等，它们在特定的应用场景中也具有重要意义。
1.2 淀粉酶的来源淀粉酶广泛存在于自然界中，包括微生物、植物和动物。
微生物来源的淀粉酶因其易于大规模生产、酶活性高等优点而在工业中得到广泛应用。
例如，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等细菌能够分泌大量的α-淀粉酶；黑曲霉、米曲霉等真菌则是糖化酶的重要生产菌株。
植物来源的淀粉酶如麦芽中的淀粉酶在酿造工业中有着悠久的应用历史。
动物体内也存在淀粉酶，如唾液淀粉酶和胰淀粉酶，它们在食物消化过程中发挥着关键作用。
1.3 淀粉酶的应用领域淀粉酶在食品、酿造、纺织、造纸、医药等众多行业中都有广泛应用。
在食品工业中，淀粉酶可用于面包制作、淀粉糖浆生产、啤酒酿造等过程，能够改善产品的口感、质地和发酵性能。
在纺织工业中，淀粉酶用于退浆工艺，去除织物上的淀粉浆料，具有环保、高效等优点。
在造纸工业中，淀粉酶可用于纸张的表面施胶和涂布，提高纸张的强度和印刷性能。
在医药领域，淀粉酶可作为助消化药物，用于治疗消化不良等疾病。
二、酶工程改造技术酶工程改造技术是提高淀粉酶活性的重要手段，它主要包括理性设计和非理性设计两种策略。
2.1 理性设计理性设计是基于对酶的结构和功能的深入理解，通过定点突变等技术有目的地改变酶的氨基酸序列，从而提高其活性。
高校生物化学专业酶的工程改造技术应用前景预测
高校生物化学专业酶的工程改造技术应用前景预测随着生物化学领域的进步和发展，酶作为生物催化剂在许多领域中发挥着重要作用。
而酶的工程改造技术则提供了一种有效的手段来改善酶的性能和功能，拓展其在工业生产、医药领域等方面的应用。
本文将对高校生物化学专业酶的工程改造技术应用前景进行预测。
一、酶的工程改造技术概述酶的工程改造技术是通过通过对酶的结构和功能进行改良，以增强其活性、稳定性和选择性。
目前常见的工程改造技术包括理性设计和无序设计两种方法。
理性设计是通过对酶的结构和功能的深入研究，有针对性地进行选择性改造，以获得更高的催化效率。
通过结合计算机模拟和实验方法，可以对酶的底物结合位点、活性位点以及酶和底物之间相互作用进行设计和优化。
无序设计则是通过对酶的序列进行随机突变，进而通过筛选和筛分进行优化，获得具有更优性质的酶。
该方法无需对酶的结构进行深入了解，是一种高通量的改造方法。
二、酶工程改造技术在工业生产中的应用前景1. 生物燃料生产随着对化石燃料的依赖减少的要求越来越高，生物燃料的生产成为了研究的热点。
酶工程改造技术可以通过提高酶的催化效率和耐受性，确保生物燃料的高产出、稳定性和可持续性。
2. 化学合成酶在合成化学中有着重要的应用前景。
通过酶工程改造技术，可以提高酶的催化效率和选择性，降低化学合成的能耗和排放量。
这对于环境友好型化学合成具有重要的意义。
3. 药物生产酶在药物的合成和制备中也有广泛的应用前景。
通过酶工程改造技术，可以提高合成酶的产量和活性，减少副反应的发生，降低生产成本。
这将为药物的生产提供更加高效、安全和经济的方法。
三、酶工程改造技术在医学领域的应用前景1. 酶替代治疗酶工程改造技术可以提高酶的稳定性，并改善酶的药代动力学特性。
这使得酶在替代治疗中具有更好的持续时间和疗效，为一些酶缺陷相关性疾病（如慢性胰腺炎）的治疗提供了新的方案。
2. 酶诊断通过改造酶的底物结合位点和活性位点，可以提高酶的灵敏度和选择性。
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特点
有效性高，是前景广阔的筛选方法
噬菌体显示筛选模式
噬菌体显示的几种类型
M13噬菌体pIII和pVIII的显示
酵母细胞表面展示法
通过锚定在酵母细胞表面的特点蛋白质与 某些外源蛋白质或多肽形成稳定的化合物，使 外源蛋白或多肽富集在酵母细胞表面的一种分 子展示技术。
核糖体显示技术
RNA-蛋白质融合技术
RNA-蛋白质的融合
寡霉素与核苷酸的连接
Myc ds-DNA的富集
实例：天冬氨酸转氨酶的热稳定性的定向进化
研究内容及执行情况
高通量筛选方法的建立 生物信息学技术手段的建立 天冬氨酸转氨酶热稳定性的改造
高通量筛选方法的建立
基于酶联免疫分析方法，选用医用检测试剂盒作为 检测试剂，建立了快速高效的酶活性检测方法，结合 使用96孔酶标板，形成了酶的高通量筛选方法。
trichosporium OB3b
绿色荧光蛋白的应用
药物筛选
绿色荧光蛋白的应用
融合表达：线粒体中表达的GFP
绿色荧光蛋白的应用
生物传感器： GFP在植物研究中的应用
噬菌体表面展示法
内涵
利用丝状噬菌体的外膜结构蛋白与某些特定 的外源蛋白或多肽分子形成稳定的复合物，使 外源蛋白或多肽富集在噬菌体表面的一种分子 展示技术
无性进化：易错PCR方法
无性进化：易错PCR方法
方法：向单一酶分子基因内随机引入突变(在PCR扩增 过程中调整反应条件），制造突变酶库以便筛选；
特点：遗传变化仅发生在单一分子内部，属于无性进化
改变4种底物的浓度比，或降低一种dNTP的量（降至5
％-10％）,加入dITP来代替被减少的dNTP. 缓冲液中另 加0.5mmol/L Mn2+
成功的例子
Reetz等 (1997) 将脂酶水解对硝基-2-甲基癸酯 的对映体选择性提高了40倍
You和Arnold (1996) 提高了枯草杆菌蛋白酶E 的表达水平和在有机溶剂中的活性，使酶的总活 力提高了500倍
Zhao和Arnold（1998）在保持酶活力不变的条 件下将枯草杆菌蛋白酶E的作用温度提高了17度
建立了改进的可高通量操作的质粒快速检测方法， 改进后的质粒快检工作量为原方法的1/3左右，可用 于高通量筛选和鉴定所构建的基因工程菌。
利用基因操作模拟自然进化的非理性设计：定向进化 不需要准确的酶分子结构信息而通过随机突变、基因 重组等方法模拟自然进化机制在体外改造酶基因，并 定向筛选出所需突变酶；
实例：木糖异构酶的定点突变改造
实例：木糖异构酶的定点突变改造
突变前蛋白与木糖复合物模型
突变后蛋白与木糖复合物模型
氨基酸残基与木糖之间距离比突变前下降，不利于体积 更大的葡萄糖底物，易于结合底物木糖，对木糖活性提高
所谓酶的体外定向进化，又称实验分子进化，属 于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶的空间结 构和催化机制，通过人为地创造特殊的条件，模拟自 然进化机制(随机突变、重组和自然选择)，在体外改 造酶基因，并定向选择出所需性质的突变酶。
4、定向进化的原理
在待进化酶基因的PCR扩增反应中，利用Taq DNA聚合 酶不具有3’->5’校对功能的性质，配合适当条件， 以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构建突变 库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化酶 (或蛋白质)，从而排除其他突变体。
提高镁离子浓度（常规PCR时浓度为0.5-2.5mmol/L）； 添加一定浓度的锰离子；
易错PCR方法实例
1993年，Chen and Arnold在非水相DMF中， 定向进化枯草杆菌蛋白酶E活力获得成功，在 60％和85％的DMF中，活力分别提高256和 131倍；
优点：操作简便，随机突通过DNA连接酶的作用，将基因与载体DNA 连接在一起形成重组DNA的过程。 重组方法：黏性末端连接
平染活性的 重组噬菌体的过程。 组装方法：重组质粒载体---转化（原核和真核） 重组噬菌体载体-包装
库筛选工作量大； 适用范围：适用于较小基因的定向进化
有性进化：DNA改组方法（1994，Stemmer)
有性进化：DNA改组方法
方法：从正突变基因库中分离得到的DNA序列用酶 随机切割，得到的随机片断经不加引物的多次PCR 循环，获得全长基因，实现优势突变的组合；
特点：遗传变化仅发生在来自不同基因片断之间的 重组，所以称为有性进化；
3、基因突变库的筛选方法
目标
根据定向进化要求，在一定的环境要求下进行筛选，从 突变基因中得到所需的突变基因。 难点
突变库容量大，一般达到106，工作量巨大
关键
高通量筛选：通量大，效率高
方法
平板筛选法，荧光筛选法，噬菌体表面展示法，细胞 表面展示法
平板筛选方法
依据细胞生长情况筛选
实例：对内酰胺酶进行DNA改组，3次循环得到的 进 化酶对抗生物素头孢噻呜抗性增加32000倍；
优点：将已有的正突变基因结合，正突变效率高； 缺点：无引物PCR之前必须把DNase I去除干净，
以
有性进化：体外随机重组法（1998，Arnold)
能以单链DNA为模板，以随机序列引物进行PCR反应， 再除去模板，互为模板和引物进行装配和扩增
科学家在线形虫体内植入 绿色荧光蛋白质
绿荧光水母—通过体内绿色 荧光蛋白发光
绿色荧光蛋白的应用
分子标记：GFP标记的微管结构
绿色荧光蛋白的应用
(a)
(b)
(c)
（d）
(e)
分子标记： FISH分析菌株
（a）未加探针；（b）DAPI染色（c）α-探针杂交（d） Msint-1268探针杂交菌株Y1；（e）Msint-1268探针杂交M.
性能
筛选
目达标到蛋目的白
1
2
3
4 ……
代数
二、酶定向进化的应用
酶定向进化的典型例子
枯草杆菌蛋白酶E热稳定性的分子进化
定向进化的成功例子
β－内酰胺酶的活性提高了32,000倍； β－半乳糖苷酶的底物特异性提高了1000倍，
且活性提高66倍； 天冬氨酸转氨酶对β－支链氧代氨基酸活性提
高105倍且对缬氨酸的催化效率提高2.1×106 倍等。
2008年诺贝尔化学奖介绍
获奖
2008年度诺贝尔化学奖授予日本科学家下村修、美国科 学家马丁·沙尔菲，以及美国华裔科学家钱永健。他们三人 因为在绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）研究和应用方面做出的突 出贡献将各分得2008年度1／3的诺贝尔化学奖奖金。
2008年诺贝尔化学奖介绍
评论
生物学有些现象只能在打碎细胞以后才能做，所以实际 上是从“死物”上来推测生物的情况。而下村修、钱永健 和马丁·沙尔菲发明的用荧光分子标记其他分子的方法，使 科学家们能在活细胞、活生物上直接观察一些生物现象。 所以，可以说是把一些“死物学”变成了真正的“生物学 （北大饶毅）
酶的生物改造
——酶的定向进化研究进展
介绍提纲 1. 定向进化技术概述 2. 定向进化技术的应用 3. 定向进化的方法
一、定向进化概述
1、酶分子改造的方法
基于序列的理性设计：化学修饰和定点突变 利用已知酶分子的特征、空间结构、结构和功能之间 关系，以及氨基酸残基功能等信息，对酶分子进行改 造；
热稳定性：温度梯度和高温环境 抗生素度 极端环境：高盐、低温、高浓毒物质
平板筛选方法
依据颜色变化筛选
大肠杆菌ß-半乳糖苷酶基因显色：噬菌体DNA载体（蓝色） 反应产物显色：磷酸酯酶水解硝基酚磷酸生成黄色硝基酚
海因酶筛选
脂肪酶筛选
2、生物自然进化的局限性
自然进化过程： 突变→自然选择→遗传后代
自然进化结果： 生物多样性 基因多样性：为完成同一功能所表现出的 多个基因或同一个基因（同源性）
局限性：周期长，效率低 ； 可控性差；
基因工程技术使得人类快速筛选工业菌种成 为可能，在几天和数月内即可完成；还可以让 人类按照自己的意愿和需要改造菌种，甚至可 以产生自然界中原本不存在的全新酶，以适应 大工业生产的需要。
三、酶定向进化的基本过程
随机突变 不同的定向进化方法 构建突变基因 载体的选择，基因重组，组建基因
突变基因的筛选 平板筛选法，荧光筛选法，表面展示法
1、定向进化的方法
无性进化方法：易错PCR法，盒式诱变 有性进化方法
1）DNA改组法（DNA Shuffling) 2）体外随机重组法（RPR) 3）交错延伸法(StEP) 基因家族的同源重组 外显子的改组 杂合进化
在自然界中，不同分子的内含子间发生同源重组， 导致不同外显子的结合，是产生新蛋白质的有效 途径之一。与DNA改组不同，外显子改组是靠 同一种分子间内含子的同源性带动，而DNA改 组不受任何限制，发生在整个基因片段上；
杂合进化
把来自不同酶分子中的结构单元或是整个酶分 子进行组合或交换，以产生具有所需性质的酶 杂合体。
平板筛选方法
依据透明圈大小筛选
淀粉酶的进化：淀粉平板培养基 豆鼓纤溶酶的进化：血纤维蛋白培养基
荧光筛选方法
利用自身荧光激发特性 生成产物本身是具有荧光激发特性的物质
利用荧光报告基因
辣根过氧化合物酶和单加氧酶的融合基因： 原理：萘→萘酚→醌类化合物（能激发荧光）
绿色荧光蛋白基因：获2008年诺贝尔化学奖
国内海藻糖的酶法制备即采用该方法；
特点：由于定向进化的高效性，被认为是 DNA改组的发展方向；
The Molecular Breeding directed molecular evolution process