PCR引物的设计原则
设计pcr引物遵循的原则
设计pcr引物遵循的原则聚合酶链反应（PCR）引物的设计是PCR实验成功的关键因素之一。
以下是一些设计PCR引物时应遵循的原则：1. 特异性：引物应具有高度特异性，以确保它们只与目标DNA序列结合，而不与其他非目标序列结合。
这有助于避免非特异性扩增产物的形成。
2. 长度：引物的长度通常应在18到25个碱基对之间，过长或过短的引物可能导致扩增效率降低。
引物长度的一般建议是20-22个碱基对。
3. GC含量：引物的GC含量应在40-60%之间。
这有助于确保引物的熔解温度适中，提高引物的特异性。
4. 熔解温度（Tm）：引物的Tm是引物与模板DNA结合和解离的温度。
引物的Tm应该在50-65°C之间，以确保在PCR循环中引物能够特异性结合到模板。
5. 避免自相互或异相互二聚体：引物的设计应防止引物之间或引物与模板之间发生意外的二聚体形成，这可能导致PCR反应的不稳定性。
可以使用在线工具预测引物之间和引物与模板之间的二聚体。
6. 避免重复序列：引物应避免含有重复序列，以防止非特异性扩增。
7. 避免剪切位点：引物不应该包含酶切位点，以防止在PCR扩增过程中被酶切。
8. 引物对的选择：在PCR反应中，通常需要一对引物。
这对引物应该相互配合，以确保它们在同一温度下工作，并且扩增产物大小符合实验要求。
9. 考虑引物的位置：引物应设计在目标序列内部，而不是在末端。
这有助于确保扩增产物包含目标区域的完整信息。
10. 检查SNP和突变：引物的设计需要考虑可能存在的单核苷酸多态性（SNP）或突变。
确保引物能够区分目标序列中的变异。
在进行PCR引物设计时，通常使用一些在线工具或软件来辅助，这些工具可以帮助评估引物的特异性和其他参数。
PCR引物设计的原则
PCR引物设计的原则引物设计的原则:首先引物要跟模板紧密结合，其次引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在，再次引物不能在别的非目的位点引起DNA聚合反应（即错配）。
围绕这几条基本原则，设计引物需要考虑诸多因素，如引物长度（primer length）、产物长度（product length）、序列Tm 值(melting temperature)、ΔG值(internal stability)、引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin）、错误引发位点（false priming site）、引物及产物GC 含量（composition），有时还要对引物进行修饰，如增加限制酶切点，引进突变等。
以使用Oligo 软件分析设计引物为例，笔者总结出以下的要点：1. 引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，即Taq 酶的最适温度。
2. 引物3’端的序列要比5’端重要。
引物3’端的碱基一般不用A（3’端碱基序列最好是G、C、CG、GC），因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高。
另外引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。
5’端序列对PCR 影响不大，因此常用来引进修饰位点或标记物。
3. 引物的GC含量一般为40-60%，以45-55％为宜，过高或过低都不利于引发反应。
有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高，导致引物的GC含量不能在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的GC 含量以及Tm 值保持接近（上下游引物的GC含量不能相差太大），以有利于退火温度的选择。
如果G-C比例超出，则在引物的5’端增加As或Ts；而如果A-T 比例过高，则同样在5’端增加Gs或Cs。
但也有认为：原来普遍认为PCR引物应当有50%的GC/AT比率的观点其实是不对的，以人基因组DNA为模板，用81%AT的引物可以产生单一的、专一的、长250 bp，含有70% AT的产物。
引物设计原则
引物设计原则
1.合适的引物长度：引物长度通常在18-30个碱基对之间，过长或过
短的引物都不利于PCR扩增的稳定性。
2.适当的引物GC含量：引物的GC含量应在40%-60%之间，过高或过
低的GC含量都会影响引物和模板DNA的特异性结合。
3.引物特异性:引物应具有高度特异性，可以通过引物序列在数据库
中进行BLAST分析来评估引物的特异性。
4.避免引物自身的二聚体和结构性：引物序列中要避免出现自身二聚
体和结构性，这会干扰PCR扩增的效果。
5.选择高峰结构引物：在引物设计时，优先选择会形成高峰结构的引物，这有助于提高扩增效率。
6.引物末端碱基的特异性：在引物末端碱基选择时，尽量使用能够增
强特异性和避免非特异性扩增的碱基。
7.引物的熔解温度（Tm）：引物的熔解温度直接影响PCR扩增反应的
特异性和效率，应根据目标DNA的长度和序列来确定引物的Tm。
8.避免引物之间的交叉杂交：在多引物PCR反应中，引物之间的交叉
杂交会干扰扩增效果，可以通过软件模拟或实验确认引物之间没有相互杂交。
9.引物序列中避免多个重复碱基：引物序列中的多个重复碱基可能导
致非特异性扩增，应避免在引物序列中出现连续的多个重复碱基。
10.引物设计的可操作性和经济性：引物设计时，要考虑到引物合成
的成本和操作的方便性，选择价格适中的合成方法，并确保引物容易操作。
以上是引物设计的原则和考虑因素，通过合理设计和优化引物序列，可以提高PCR扩增实验的特异性、敏感性和效率，从而获得准确和稳定的实验结果。
引物设计基本原则
引物设计基本原则引物设计是指在分子生物学研究中，用于扩增目标DNA序列的两个引物的设计。
好的引物设计是成功进行PCR反应的关键之一、下面是引物设计的基本原则：1.引物长度：引物长度一般在18-24个碱基对左右，太短容易引起非特异性扩增，太长则可能导致引物无法与目标序列完全匹配。
2.引物的GC含量：引物的GC含量一般在40-60%之间，太低则可能导致引物无法与目标序列形成稳定的双链结构，太高则可能导致引物与非特异性目标序列发生杂交。
3.引物的熔解温度(Tm)：引物的Tm是指引物与目标序列在溶液中解链的温度。
引物设计时应保证所设计的两个引物的Tm值相似，一般相差不超过2-3摄氏度。
这样可以保证引物在PCR反应中同时结合于目标序列。
4.引物的特异性：引物设计时必须确保引物与目标序列的特异性，即引物在基因组中只与目标序列互补匹配，不与其他非目标序列发生杂交。
为了提高引物的特异性，可以使用生物信息学工具如BLAST进行引物的序列比对和分析。
5.引物的结构：引物设计时应注意引物的序列结构。
首先要避免引物的自身二级结构，特别是避免引物的自身二聚体形成，可以使用在线工具进行预测和评估。
另外，引物的末端最好是链末端，避免引物形成环状结构。
6.引物的位点选择：在设计引物时，应选择位于目标序列上的独特位点作为引物扩增的位点。
这样可以确保引物扩增出的产物是目标序列，而不是其他类似的序列。
7.引物的序列设计：引物设计时应避免序列中出现连续的重复碱基序列，避免过多的GC或AT连续存在。
此外，引物设计时还可以考虑在引物的序列中加入特定的限制性内切酶位点，方便后续分子克隆和分析。
总结起来，引物设计的基本原则包括引物长度、GC含量、Tm值、特异性、结构、位点选择和序列设计。
良好的引物设计是成功进行PCR反应的前提之一，能够提高扩增效率和特异性，并且避免产生非特异性扩增产物。
PCR引物设计原理及原则
PCR引物设计原理及原则PCR引物设计是聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）的关键步骤之一、PCR引物是指PCR扩增反应中作为起始材料的两个DNA片段，通常是20-30个碱基对长的寡核苷酸序列。
PCR引物设计的目的是选择合适的引物序列，以实现特定DNA序列的扩增。
1.特异性：PCR引物应该非常特异地与目标序列相互作用，不与其他非特异性的序列发生非特异性的扩增反应。
为了实现特异性，引物序列应该在目标序列上具有高度互补性，但是在非特异性序列上没有互补性。
2.合适的长度：PCR引物的长度在20-30个碱基对之间，较短的引物可能无法特异性地与目标序列结合，而较长的引物可能导致PCR反应的效率降低。
3.避免结构性：PCR引物设计中应避免引物之间或引物与模板之间的二级结构形成。
二级结构会干扰PCR反应的进行，降低扩增效率。
4.避免引物间杂交：在PCR反应中，通过引物间的相互作用引发的非特异性扩增会干扰特异性扩增的结果。
因此，在设计PCR引物时，需要避免引物间的互补性。
1.选择位于目标序列上的合适区域进行扩增，通常选择区域位于目标序列上游和下游的相对保守区域。
这样可以确保PCR引物的特异性和稳定性。
2.引物应具有一定的GC含量，一般在40%-60%之间，过低的GC含量会降低PCR反应的特异性和稳定性。
3.引物的两端不应含有重复序列，这样可以避免模板序列的间断扩增。
4.引物的两端应该有相对稳定的酮基或磷酸基，这样可以提高引物的稳定性，确保特异性扩增。
5.避免引物的自身互补性，以防止引物间的二级结构形成。
引物的互补性会干扰PCR反应的进行。
6.引物应避免在末端存在带有杂质的碱基，因为这可能会导致扩增产物的杂交和二级结构形成。
7.引物序列应尽量避开重复序列、富含AT或GC的序列、高度变异的区域和基因座之间的序列相似性较高的区域。
8.引物设计应考虑到引物长度、温度和浓度的相互配合，以保证对目标序列的特异性扩增。
PCR引物设计原则
PCR引物设计原则PCR（聚合酶链反应）是一种广泛应用于分子生物学领域的基础技术，可以在体外复制DNA分子。
PCR的核心是引物，引物的设计质量直接影响PCR反应的效率和特异性。
以下是PCR引物设计的原则。
1.引物长度：引物的理想长度为18-22个碱基对。
引物过短可能导致特异性不足，引物过长则可能降低PCR的效率。
2.引物序列：引物序列应具备良好的互补性，即能与待扩增的目标DNA序列特异性结合。
通常，引物的GC含量应在40-60%之间，以确保引物和目标序列之间形成稳定的氢键。
3.引物选择：引物的设计需要仔细考虑避免引物间以及引物与模板序列间的互补。
如果引物之间有互补性，则可能导致非特异性扩增。
另外，引物不能与附近的肥皂序列或重复序列互补，以免引入非特异性产物。
4.引物结构：引物的3'端应以碱基对为基础设计，以提高扩增特异性。
同时，避免引物在末端出现重复序列，以免引导多聚加合反应。
5.引物的熔解温度（Tm）：引物的熔解温度应相似，并在50-60℃之间，以确保引物和模板序列的互补结合，同时避免引物之间的自身结合。
6.引物的位点选择：引物应选择在目标序列上的保守区域，以确保引物在不同基因型和物种之间的通用性。
在选择引物位点时，避免选择在引物附近有大量SNP（单核苷酸多态性）或缺失突变的区域。
7.引物的杂合性别：引物的杂合性别是指引物本身的互补性。
如果引物存在杂合性别，则可能导致非特异性扩增。
在进行引物设计时，可以使用软件工具来评估引物的可能杂合效应。
8.引物的特异性评估：在进行引物设计后，可以使用BLAST等工具来评估引物的特异性。
该工具可以引物序列与数据库中的其他序列的互补匹配。
特异性较好的引物应仅与目标序列匹配。
9.引物标记：引物可以通过添加特定序列或化学标记进行标记。
在PCR扩增过程中，通过标记引物可以进行定量和检测反应产物的操作。
在PCR实验中，良好的引物设计是确保特异性扩增的关键。
引物设计需要综合考虑引物长度、序列、选择、结构、熔解温度、位点选择、杂合性别、特异性评估、标记和固定等因素。
定量PCR引物探针设计原则
定量PCR引物探针设计原则定量PCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction）是一种用于测量DNA分子数量的技术。
在进行定量PCR实验时，合理设计引物和探针非常重要，下面将探讨一些定量PCR引物和探针设计的原则。
1.引物设计原则：1.1引物长度：引物的长度一般在18-30个碱基对之间，过短的引物可能导致非特异性扩增，而过长的引物可能导致扩增效率降低。
1.2引物的GC含量：引物的GC含量应在40-60%之间，过高或过低的GC含量都可能导致非特异性扩增。
1.3引物的熔解温度（Tm）：引物的熔解温度应在50-60摄氏度之间，可以通过计算引物序列的碱基组成和长度来预测引物的Tm值。
1.4引物的特异性：引物的特异性是设计引物时最关键的考虑因素之一、引物的特异性可以通过检查与该引物匹配的靶标序列在基因组或转录组中的唯一性来评估。
可以使用生物信息学工具，如BLAST（基本局部序列比对）来分析引物的特异性。
此外，还可以使用引物的3'末端碱基序列的特异性来提高引物的特异性。
2.探针设计原则：2.1探针的长度：探针的长度一般在20-30个碱基对之间。
2.2探针的熔解温度（Tm）：与引物类似，探针的Tm值也应在50-60摄氏度之间。
2.3探针的特异性：与引物一样，探针的特异性也是设计探针时需要考虑的重要因素。
探针的特异性可以通过生物信息学工具来分析，如BLAST。
此外，还可以设计探针的3'末端碱基序列来提高其特异性。
2.4探针的化学修饰：在实验中，通常使用荧光标记的探针来实现定量PCR。
探针可以通过荧光基团，如FAM、VIC、HEX等进行标记。
此外，还可以在探针的两端引入磷酸酯键或磷酸二酯键等化学修饰，以提高探针的稳定性和特异性。
总结起来，定量PCR引物和探针的设计需要考虑引物长度、GC含量、熔解温度和特异性等因素。
在设计引物和探针时，可以使用生物信息学工具来分析其特异性，并通过化学修饰来提高其稳定性和特异性。
PCR引物设计原则
PCR引物设计原则PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。
因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。
要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。
同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。
如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。
如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。
现在可以在这一保守区域里设计一对引物。
一般引物长度为15-30碱基，扩增片段长度为100-600碱基对。
让我们先看看P1引物。
一般引物序列中G+C含量一般为40%-60%。
而且四种碱基的分布最好随机。
不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。
否则P1引物设计的就不合理。
应重新寻找区域设计引物。
同时，引物之间不能有互补性。
通常，一对引物之间互补的连续碱基不应超过四个。
引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的5′端加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、地高辛等，这对扩增的特异性影响不大。
但3′端绝对不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从3′端开始的。
这里还需提醒的是3′端不要终止于密码子的第3位，因为密码子第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。
综上所述我们可以归纳十条PCR引物的设计原则：1.引物设计在核酸序列的保守区域，具有特异性。
2、产物不能形成二级结构。
3、引物长度一般在15~30碱基之间。
4、G+C含量在40%~60%之间。
5、碱基要随机分布。
6.引物本身不能与四个连续的碱基互补。
7.引物不能与四个连续的碱基互补。
8、引物5′端可以修饰。
9、引物3′端不可修饰。
10、引物3′端要避开密码子的第3位。
PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。
如前述，引物的优劣直接关系到PCR 的特异性与成功与否。
对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。
1、引物的特异性引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
PCR引物的设计原则：
①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
②产物不能形成二级结构。
③引物长度一般在15~30碱基之间。
④G+C含量在40%~60%之间。
⑤碱基要随机分布。
⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。
⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。
⑧引物5′端可以修饰。
⑨引物3′端不可修饰。
⑩引物3′端要避开密码子的第3位。
1.引物的特异性
引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。
2.避开产物的二级结构区
某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。
用有关计算机软件可以预测估计mRNA 的稳定二级结构，有助于选择模板。
实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。
若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。
3.长度
寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为18~27mer。
引物的有效长度：Ln=2（G+C）+（A+T），Ln值不能大于38，因为>38时，最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度（74℃),不能保证产物的特异性。
4.G+C含量
G+C含量一般为40%~60%。
其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。
若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm 值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
上下游引物的GC含量不能相差太大。
5.碱基随机分布
引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。
尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。
6.引物自身
引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构引物本身复性。
这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。
若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。
7.引物之间
两引物之间不应具有互补性，尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。
一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。
引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。
否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。
8.引物的3′端
引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。
3′端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反应中，引物3′端不能发生错配。
在标准PCR反应体系中，用2U Taq DNA聚合酶和800μmol/L dN TP（四种dNTP各200μmol/L）以质粒（103拷贝）为模板，按95℃，2 5s；55℃，25s；72℃，1min的循环参数扩增HIV-1 gag基因区的条件下，引物3′端错配对扩增产物的影响是有一定规律的。
A∶A错配使产量下降至1/20，A∶G和C∶C错配下降至1/100。
引物A：模板G与引物G：模板A错配对PCR影响是等同的。
9.引物的5′端
引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。
因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。
引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。
10.密码子的简并
如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。
11. 引物3′端不能选择A，最好选择T。
引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T 时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。
12. 引物5′ 端和中间△G值应该相对较高，而3′ 端△G值较低。
△G值是指DNA 双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。
应当选用5′ 端和中间△G值相对较高，而3′ 端△G值较低（绝对值不超过9）的引物。
引物3′ 端的△G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。
（不同位置的△G值可以用Oligo 6软件进行分析）
13. 引物应具有特异性。
引物设计完成以后，应该对其进行BLAST检测。
如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。
关于BLAST（使用方法以后将会讲解）的作用应该是通过比对，发现你所设计的这个引物，在已经发现并在GENBANK中公开的不物种基因序列当中，除了和你的目标基因之外，还有没有和其他物种或其他序列当中存在相同的序列，如和你的目标序列之外的序列相同的序列，则可能扩出其他序列的产物，那么这个引物的特异性就很差，从而不能用。
下面我们调用PRIMER PREMIER 5.0（以primer premier 5.0为例），讲解它的特点和使用方法，目的是要达到能够自己设计一对简并引物、可以分析一段序列或基因的酶切位点。