第十一章 单基因遗传性疾病的分子诊断
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【分子诊断学】_第十一章 遗传性疾病的临床分子诊断
第十一章 遗传性疾病的临床分子诊断
什么是遗传病（genetic disorders）
n 指完全或部分由遗传物质即DNA改变引起的 疾病。
n 几乎所有的疾病都受遗传物质的影响，这些 致病基因有的直接来自父母，有的来自后天 的随机突变或者环境致变；
n 典型的遗传病指由于遗传（inheritance）了 特殊的突变型基因而致病的一类疾病。
α地中海贫血——由于珠蛋白基因的缺失或突变使链 的合成受到抑制而引起的溶血性贫血，多由缺失引起。
β地中海贫血——由于珠蛋白基因的缺失或突变使链 的合成受到抑制而引起的溶血性贫血，多由突变引起。
α地中海贫血的分类
n α地中海贫血主要由基因缺失引起，目前全球已鉴定的缺失 超过20种，我国常见的类型是（--SEA/）、（-α3.7/）、（α4.2/）；
Transcription
E3 ------3`
Processing
5`-Cap---Translation
--polyAAAAA mRNA
异常血红蛋白病－镰状细胞病
（sicklemia）
n 第一个被揭示的“分子 病”；
n 属于常染色体隐性遗传病 （AR）;
n 珠蛋白基因的第6位密码 子突变，由GAG→GTG,导 致珠蛋白第6位氨基酸残 基由Glu →Val
RFLP
n 限制性内切酶MstⅡ 的识别序列是
n
CCT NAG G,
正常： 编码
CCT GAG GAG Pro Glu Glu
镰状： 编码
CCT GTG GAG Pro Val Glu
注意：酶切要彻底，防止将正常型误认为携带者，设置正常/ 携带者对照
PCR-RDB交
n 1.分别设计正常探针和 突变探针；
什么是遗传病（genetic disorders）
n 指完全或部分由遗传物质即DNA改变引起的 疾病。
n 几乎所有的疾病都受遗传物质的影响，这些 致病基因有的直接来自父母，有的来自后天 的随机突变或者环境致变；
n 典型的遗传病指由于遗传（inheritance）了 特殊的突变型基因而致病的一类疾病。
α地中海贫血——由于珠蛋白基因的缺失或突变使链 的合成受到抑制而引起的溶血性贫血，多由缺失引起。
β地中海贫血——由于珠蛋白基因的缺失或突变使链 的合成受到抑制而引起的溶血性贫血，多由突变引起。
α地中海贫血的分类
n α地中海贫血主要由基因缺失引起，目前全球已鉴定的缺失 超过20种，我国常见的类型是（--SEA/）、（-α3.7/）、（α4.2/）；
Transcription
E3 ------3`
Processing
5`-Cap---Translation
--polyAAAAA mRNA
异常血红蛋白病－镰状细胞病
（sicklemia）
n 第一个被揭示的“分子 病”；
n 属于常染色体隐性遗传病 （AR）;
n 珠蛋白基因的第6位密码 子突变，由GAG→GTG,导 致珠蛋白第6位氨基酸残 基由Glu →Val
RFLP
n 限制性内切酶MstⅡ 的识别序列是
n
CCT NAG G,
正常： 编码
CCT GAG GAG Pro Glu Glu
镰状： 编码
CCT GTG GAG Pro Val Glu
注意：酶切要彻底，防止将正常型误认为携带者，设置正常/ 携带者对照
PCR-RDB交
n 1.分别设计正常探针和 突变探针；
关于单基因遗传性疾病的分子诊断 (2)课件
School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University
2
分子诊断原理和技术·单基因遗传性疾病的分子诊断
• 单基因遗传病是指受一对等位基因控制的 遗传病，有6600多种，并且每年在以10-50 种的速度递增，单基因遗传病已经对人类 健康构成了较大的威胁。较常见的有红绿 色盲、血友病、白化病等。
School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University
3
分子诊断原理和技术·单基因遗传性疾病的分子诊断
单基因遗传病
• 常染色体显性遗传病 • 常染色体隐性遗传病 • X连锁显性遗传病 • X连锁隐性遗传病 • Y连锁遗传病
10
分子诊断原理和技术·单基因遗传性疾病的分子诊断
• 所有遗传性疾病都与某种或多种基因的突 变有关，对这类疾病进行分子诊断有两种 策略可供选择：
1. 直接诊断策略； 2. 间接诊断策略
School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University
析，比如荧光原位杂交法。 3.蛋白质水平的诊断：采用生物化学方法分析异常表达的蛋
白质或代谢产物。 4.疾病动物模型的辅助诊断：建立相应的转基因疾病动物模
型，辅助诊断或判定人类疾病的致病基因。
School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University
• 血友病A。病因：血浆中抗血友病球蛋白减少，AHG即第Ⅷ因子凝血 时间延长。临床表现：轻微创伤即出血不止，不出血时与常人无异。
第十一章 单基因遗传性疾病的分子诊断
ζ
ψζ ψα2 ψα1 α2 α1
θ1
表型 正常人 静止型α地中海贫血 轻型α地中海贫血 HbH病 Hb Bart综合征
基因型 αα/αα α－/αα －－/αα α－/－－ －－/－－
K27ey Laboratory of Laboratory Medicine, Ministry of Education, China
野生型 突变型
CCTG AGG
Mst II
CCTG TGG
1.15kb
0.2kb
1.35kb
K22ey Laboratory of Laboratory Medicine, Ministry of Education, China
限制酶切片段电泳后，经Southern Blot检测 1.35 kb 1.15 kb
发展趋势
（1） DNA （2） 单一 （3） 定性 （4）单基因 （5） 诊断
mRNA、protein 联合 定量
多基因 预防
Key Laboratory of Laboratory Medicine, Ministry of Education,5China
K6ey Laboratory of Laboratory Medicine, Ministry of Education, China
（一）α珠蛋白基因
K15ey Laboratory of Laboratory Medicine, Ministry of Education, China
（二）β珠蛋白基因
K16ey Laboratory of Laboratory Medicine, Ministry of Education, China
分子诊断技术：
单基因疾病的分子诊断(教材)
单基因疾病的三种遗传方式
1. 常染色体遗传（autosomal inheritance）包括： 常染色体显性遗传和常染色体隐性遗传。
2. X连锁遗传（ X-linked inheritance）包括：
X连锁显性遗传和X连锁隐性遗传。
3. 线粒体遗传（mitochondrial inheritance）
2、基因背景未知的点突变
• 单链构象多态性(single-strand conformational polymorphism, SSCP) • 变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE) • 异源双链分析(heteroduplex analysis, HA) • DNA序列测定 • 蛋白截短测试（protein truncation test, PTT）
Southern blot
DNA片段在琼脂 糖凝胶上电泳分 离
DNA片段从琼脂 糖凝胶上转印到 膜上
杂交信号的 检测
在缓冲液中将 标记的探针加 到膜上
膜上固定DNA 片段
分子诊断
二、单基因病的分子诊断
（一）血友病A的分子诊断 （二）珠蛋白合成障碍性贫血的分子诊断
二、单基因病的分子诊断
（一）血友病A的分子诊断 1.凝血因子Ⅷ基因的主要遗传缺陷
第22号内含子倒位的ຫໍສະໝຸດ 制二、单基因病的分子诊断2. FⅧ基因的直接检测——22号内含子倒位检测
12kb/
11kb/12kb
11kb/
12kb/
长距离PCR扩增22号内含子
二、单基因病的分子诊断
3. FⅧ基因连锁分析—— FⅧ基因st14位点多态性检测
C/ B/D
分子诊断学遗传性疾病的分子诊断
simultaneously：同时地；
multiplex：多样化； exon：外显子；
deletion：缺失
01
02
Phenylketonuria is an inborn error of metabolism resulting from a deficiency of phenylalanine hydroxylase. There are many techniques that can be used to mutation screening, such as PCR-STR, PCR-SSCP, PCR-RFLP, PCR-DGCE, and so on.
主要是由于肝内苯丙氨酸羟化酶（phenylalanine hydroxylase, PAH）严重缺失所致的苯丙氨酸代谢异常，为常染色体隐性遗传病 临床表现：智力障碍、色素减少、尿特殊气味及神经和精神症状
分子诊断方法：
1
PCR-STR连锁分析
2
PCR-RFLP
3
多重ASPCR法 PCR-DGGE法
Phenylketonuria：苯丙酮尿 phenylalanine hydroxylase：苯基丙氨酸羟化酶
Cystic fibrosis(CF) is caused by mutations in the CFTR gene. Five tests are most frequently used: resctriction enzyme analysis, the heteroduplex analysis, ARMS, reverse hybridization and OLA.
按照合成速率降低的珠蛋白类型分为α、β、γ、δ地中海贫血
α-地中海贫血（ α -thalassemia） α0地贫是α链完全不能合成者 α+地贫是部分α链合成者
遗传疾病的分子诊断方法
遗传疾病的分子诊断方法遗传疾病是由遗传因素引起的一类疾病，常常对患者和家庭造成严重的心理和生理负担。
传统的诊断方法通常基于症状和家族史，但这种方法往往不准确且不可靠。
然而，随着分子生物学和遗传学的发展，越来越多的分子诊断方法被应用于遗传疾病的诊断，这为早期检测和有效管理这些疾病提供了新的途径。
一、基因突变检测基因突变是许多遗传疾病的主要致病因素之一。
通过检测患者体内的基因突变，可以准确诊断某些遗传疾病。
常用的基因突变检测方法包括多态性分析、限制性片段长度多态性（RFLP）分析、单体型分析、串联重复序列分析、PCR扩增测序等。
这些方法能够快速、准确地检测基因突变，为遗传疾病的确诊提供重要依据。
二、基因表达分析遗传疾病的发生往往与异常基因表达有关。
通过测定基因的表达水平，可以发现一些与遗传疾病发生发展相关的关键基因。
常用的基因表达分析方法包括荧光定量PCR（qPCR）、北方印迹等。
这些方法可以对基因的转录水平进行定量分析，帮助了解遗传疾病的发病机制。
三、蛋白质表达分析蛋白质是核酸的产物，也是细胞功能的主要执行器。
许多遗传疾病与蛋白质结构或功能异常相关。
通过蛋白质表达分析，可以直接了解遗传疾病患者体内的蛋白质异常情况。
常用的蛋白质分析方法包括Western blotting和质谱法等。
这些方法可以检测蛋白质的表达水平、修饰状态和互作关系，为遗传疾病的诊断和治疗提供重要信息。
四、基因组分析遗传疾病涉及的基因往往不止一个，而是涉及多个基因的协同作用。
通过对整个基因组的分析，可以发现遗传疾病的新致病基因或潜在易感基因。
常用的基因组分析方法包括全基因组测序和基因芯片技术。
这些方法可以对整个基因组进行高通量的测定，帮助发现与遗传疾病相关的基因变异。
总结遗传疾病的分子诊断方法通过检测基因突变、基因表达、蛋白质表达和基因组等方面的异常，能够快速、准确地诊断遗传疾病，为患者提供个体化的医学服务。
这些分子诊断方法的发展不仅提高了遗传疾病的早期诊断率，还为疾病的预防、干预和治疗策略的制定提供了有效依据。
单基因遗传性疾病的分子诊断课件
杂交
不杂交
不杂交
杂交
正常 杂合子轻型 重型
,
44
• 反向点杂交同时诊断β基因多个点突变
M1 M2 M3 M4 M5 M6
正常探针 突变探针
基因芯片技术
现在已经开发了多种诊断β地贫的芯片检测阅读
系统，系统多采用国际先进的体外扩增结合芯片
反向点杂交检测技术，可快速准确检测全血样本
中β珠蛋白基因上多个基因, 位点的突变
,
11
直接诊断策略和方法：
1、点突变的诊断
• 直接检测基因点突变：等位基因特异性寡核苷酸杂交（）、 －、等位基因特异性扩增（）、－、基因芯片技术等；
• 基因背景未知的点突变：单链构象多态性（）、变性梯度 凝胶电泳（）、异源双链分析（）、序列测定、蛋白截短 测试等。
,
12
2、片段性突变的检测
• 片段性突变是指分子中较大范围的碱基发生突变， 如碱基的缺失、插入、扩增和重组。对于少数核苷 酸缺失或插入，可以采用检测点突变的方法，而对 于大的片段突变，则使用印迹技术和多重技术。
654* 579
↓ IVS II
b-globin gene
B
IVS I
IVS II
mRNA(N)
C
mRNA(M)
73bp
b654 的剪接模式
,
42
• β654基因突变的分子诊断－法诊断剪切异
常
Normal
Patient
ββ
β β０ β０ β０
254bp 181bp
轻型 重型
,
43
• β654基因突变的分子诊断－方法
1.分子水平的诊断：包括限制性片段长度多态性的酶切分析、 基因型和单体型的连锁和关联分析、基因的序列分析。
第11章-单基因遗传病PPT课件
• 高铁血红蛋白还原酶缺乏症, 由于基因突变使高
铁血红蛋白还原酶缺乏所致,使红细胞内三价铁不 能被还原成二价铁,影响血红蛋白正常的带02能力, 出现紫绀和代偿性红细胞增多。
• 呈常染色体显性遗传
.
18
珠蛋白生成障碍性贫血 • α珠蛋白生成障碍性贫血 • β珠蛋白生成障碍性贫血（地中海贫血）
.
19
α珠蛋白生成障碍性贫血(AD)
• 常染色体显性遗传 • 突变基因杂合子及纯合子均表现出临床表
现,但存在着明显的剂量效应
• 纯合患者的临床表现比杂合患者要严重 • 突变导致LDL不能被细胞摄取, 导致胆固醇
代谢异常
.
33
五、膜转运蛋白病
• 囊性纤维性变(cysticfibrosis,CF)是一种
发现
• 红细胞在缺氧状态下变成镰刀状, 极易
被破坏而引起溶血性贫血
• 分子基础是Hbβ链N端的谷氨酸被缬氨
酸所取代
.
16
.
17
高铁血红蛋白血症 （血红蛋白M病）
• 02转运异常为特征； • 主要是由于α或β基因突变,造 成α链或β链中与铁
原子相结合的组氨酸被酪氨酸替代, 使铁原子呈 稳定的高铁状态, 影响 了正常的带氧功能,导致组 织供氧不足,出现发绀和继发性的红细胞增多;
此症共有6种类型，分别决定于不同的位点。其中2型是由于细胞膜上低 密度脂蛋白受体缺陷而导致。
低密度脂蛋白(LDL) (LDL)受体
溶酶体 水解
脂酰辅酶A (+) 胆固醇脂酰转移酶
释放的胆固醇 β -羟基β-甲基戊二酰辅酶A还原酶
胆固醇酯
(–) 胆固醇合成
储存
LDL受体缺陷使负反馈受阻
.
铁血红蛋白还原酶缺乏所致,使红细胞内三价铁不 能被还原成二价铁,影响血红蛋白正常的带02能力, 出现紫绀和代偿性红细胞增多。
• 呈常染色体显性遗传
.
18
珠蛋白生成障碍性贫血 • α珠蛋白生成障碍性贫血 • β珠蛋白生成障碍性贫血（地中海贫血）
.
19
α珠蛋白生成障碍性贫血(AD)
• 常染色体显性遗传 • 突变基因杂合子及纯合子均表现出临床表
现,但存在着明显的剂量效应
• 纯合患者的临床表现比杂合患者要严重 • 突变导致LDL不能被细胞摄取, 导致胆固醇
代谢异常
.
33
五、膜转运蛋白病
• 囊性纤维性变(cysticfibrosis,CF)是一种
发现
• 红细胞在缺氧状态下变成镰刀状, 极易
被破坏而引起溶血性贫血
• 分子基础是Hbβ链N端的谷氨酸被缬氨
酸所取代
.
16
.
17
高铁血红蛋白血症 （血红蛋白M病）
• 02转运异常为特征； • 主要是由于α或β基因突变,造 成α链或β链中与铁
原子相结合的组氨酸被酪氨酸替代, 使铁原子呈 稳定的高铁状态, 影响 了正常的带氧功能,导致组 织供氧不足,出现发绀和继发性的红细胞增多;
此症共有6种类型，分别决定于不同的位点。其中2型是由于细胞膜上低 密度脂蛋白受体缺陷而导致。
低密度脂蛋白(LDL) (LDL)受体
溶酶体 水解
脂酰辅酶A (+) 胆固醇脂酰转移酶
释放的胆固醇 β -羟基β-甲基戊二酰辅酶A还原酶
胆固醇酯
(–) 胆固醇合成
储存
LDL受体缺陷使负反馈受阻
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基因结构异常
DNA
基因表达异常
mRNA 蛋白质
核酸杂交 PCR 测序
基因芯片
RT-PCR 荧光PCR
NorthernBlot 基因芯片
Western Blot
组化
ELISA 蛋白芯片
Key Laboratory of Laboratory Medicine, Ministry of Education,3China
（二）镰状细胞贫血的分子诊断方法
限制性内切酶MstⅡ识别序列为CCTNAGG，N可以 是任意核苷酸。因此β珠蛋白基因的第5、6密 码子和第7密码子的第一个核苷酸序列是该内切 酶的识别位点。但是在发生镰状突变后该酶切位 点消失。
K7ey Laboratory of Laboratory Medicine, Ministry of Education, China
基因突变
点突变 密码子插入或缺失 移码突变 缺失或重复 基因倒位 基因融合 动态突变
K8ey Laboratory of Laboratory Medicine, Ministry of Education, China
血红蛋白病
血红蛋白病是由于珠蛋白基因异常导致 珠蛋白肽链结构异常或合成异常所引起的 遗传性血液病。
K17ey Laboratory of Laboratory Medicine, Ministry of Education, China
结构异常： 异常血红蛋白 （镰状细胞贫血）
合成异常： a-地中海贫血 b-地中海贫血
单基因遗传病（single-gene disorders） 遗传性疾病
多基因遗传病（polygenic disorders）
单基因病：指一种遗传病的发生只受一对等位基因的控制， 其遗传方式遵循孟德尔分离定律。
单基因病
常染色体遗传（autosomal inheritance） X连锁遗传（X-linked inheritance） 线粒体遗传(mitochondrial inheritance)
K18ey Laboratory of Laboratory Medicine, Ministry of Education, China
镰状细胞贫血由β链基因点突变引起， 该病的主要原因是因为珠蛋白的β基因发 生单一碱基突变，正常β基因的第6位密 码 子 为 GAG ， 编 码 谷 氨 酸 ， 突 变 后 为 GTG，编码缬氨酸，成为HbS。
K1ey Laboratory of Laboratory Medicine, Ministry of Education, China
分子诊断学∙第十一章
单基因遗传性疾病的分子诊断
分子诊断
通过检测基因的结构异常或其表达异常，对 人体的健康状态和疾病做出诊断的方法。
Key Laboratory of Laboratory Medicine, Ministry of Education,2China
第一节 血红蛋白病
K13ey Laboratory of Laboratory Medicine, Ministry of Education, China
血红蛋白的构成
正常成年人血红蛋白A-HbA （a2b2）
K14ey Laboratory of Laboratory Medicine, Ministry of Education, China
K19ey Laboratory of Laboratory Medicine, Ministry of Education, China
HbS四聚体在脱氧 时，聚集成阵列， 几乎变为结晶体， 使红细胞发生镰变 （sickling），弹 性几乎丧失，无法 通过直径比红细胞 小的毛细血管。
K20ey Laboratory of Laboratory Medicine, Ministry of Education, China
发展阶段
（1）DNA分子杂交技术 （2）PCR技术为基础的DNA诊断，特别是
定量PCR和实时PCRБайду номын сангаас应用 （3）生物芯片（biochip）技术为代表的高
通量密集型检测技术
Key Laboratory of Laboratory Medicine, Ministry of Education,4China
（一）α珠蛋白基因
K15ey Laboratory of Laboratory Medicine, Ministry of Education, China
（二）β珠蛋白基因
K16ey Laboratory of Laboratory Medicine, Ministry of Education, China
分子诊断技术：
点杂交 限制性内切酶酶谱 寡核苷酸探针 PCR 基因芯片 DNA测序
K9ey Laboratory of Laboratory Medicine, Ministry of Education, China
基因诊断的策略
从基因产物入手 从基因定位入手 从比较正常和异常基因的差异入手
K10ey Laboratory of Laboratory Medicine, Ministry of Education, China
诊断的时机 症状前诊断 产前诊断 着床前诊断
K11ey Laboratory of Laboratory Medicine, Ministry of Education, China
DNA诊断 RNA诊断 FISH诊断 fluorescence in situ hybridization
K12ey Laboratory of Laboratory Medicine, Ministry of Education, China
发展趋势
（1） DNA （2） 单一 （3） 定性 （4）单基因 （5） 诊断
mRNA、protein 联合 定量
多基因 预防
Key Laboratory of Laboratory Medicine, Ministry of Education,5China
K6ey Laboratory of Laboratory Medicine, Ministry of Education, China