实验3植物叶片活细胞和叶绿体的分离提取及观察
叶绿体色素的提取与分离、理化性质及含量测定 3
叶绿体色素提取分离与理化性质及含量测定▪（一）实验目的及意义▪（二）实验原理▪（三）实验步骤▪（四）实验报告实验目的和意义▪绿色植物的光合作用是在叶绿体中的叶绿体色素中进行的，了解叶绿体色素的组成、性质及测定对于理解光合作用的本质很有帮助。
▪因此，测定叶绿素含量便成为研究光合作用与氮代谢必不可少的手段，在作物育种、科学施肥、看叶诊断中有着广泛的应用叶绿体在细胞中运动视频叶绿体在细胞中的分布与结构类囊体膜的结构及功能实验原理植物叶绿体色素是吸收太阳光能，进行光合作用的重要物质。
它一般由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。
这些色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。
实验原理▪色素分离的方法有多种，纸层析是最简便的一种。
当溶剂（有机推动剂）不断从纸上流过时，由于混合物（叶绿素提取液）中各种成分在固定相（滤纸纤维素所吸附的水分）和流动相（有机推动剂）间具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间后，可将各种色素分开。
▪叶绿素是一种二羧酸——叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成醇（甲醇和叶绿醇）和叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开。
实验原理▪叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，表现出一定的吸收光谱，可用分光光度计精确测定。
叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回到基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。
叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。
▪叶绿素中的镁可以被氢离子所取代而成褐色的去镁叶绿素。
去镁叶绿素遇铜则成为铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。
实验步骤(1)▪根据朗伯一比尔定律，某有色溶液的吸光度D与其中溶液浓度C和液层厚度L成正比，即：▪D＝KCL▪D：吸光度，即吸收光的量，C：溶液浓度, K：为比吸收系数（吸光系数），L：液层厚度，通常为1cm.▪如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和，这就是吸光度的加和性。
实验三 叶绿体色素的提取、分离和性质分析
五、注意事项
分离色素用的圆形滤纸， 分离色素用的圆形滤纸，在中心打 的小圆孔，周围必须整齐， 的小圆孔，周围必须整齐，否则分 离的色素不是一个同心圆。 离的色素不是一个同心圆。
每次改变波长后，要用 每次改变波长后，要用95%乙醇重新调 乙醇重新调 零。
六、实验结果
画图说明叶绿体色素纸层析结果， 画图说明叶绿体色素纸层析结果，并解 释原因。 释原因。 解释叶绿素的荧光现象。 解释叶绿素的荧光现象。 解释光对叶绿素的破坏作用现象。 解释光对叶绿素的破坏作用现象。 解释叶绿体色素分子的替代作用现象。 解释叶绿体色素分子的替代作用现象。
实验五 叶绿体色素的提取、 叶绿体色素的提取、分离及性质
一、实验目的
掌握叶绿体色素的提取方法； 掌握叶绿体色素的提取方法； 掌握纸层析法分离叶绿体色素的原 理和步骤； 理和步骤； 掌握叶绿体色素的部分理化性质。 掌握叶绿体色素的部分理化性质。
二、实验原理
（一）叶绿体色素： 叶绿体色素： 叶绿素a 叶绿素a 1.叶绿素 叶绿素 叶绿素b 叶绿素b
新鲜的菠菜叶片。 新鲜的菠菜叶片。 95%乙醇 、CaCO3、醋酸铜结晶、浓 乙醇 醋酸铜结晶、 盐酸、汽油。 盐酸、汽油。 量筒，滤纸，大培养皿一只， 量筒，滤纸，大培养皿一只，小培养皿 一只，长滴管，剪刀。 一只，长滴管，剪刀。
四、实验步骤
1、 叶绿体色素提取： 、 叶绿体色素提取： 将菠菜叶片擦净， 剪碎， 将菠菜叶片擦净，去中脉后取 10g剪碎，加少许碳酸钙和石英砂， 擦净 剪碎 加少许碳酸钙和石英砂， 再分次加入 分次加入10mL酒精研磨，过滤，定容至50ml，分装于4个试管内。 酒精研磨，过滤，定容至 ，分装于 个试管内。 加入 酒精研磨 个试管内
标明各层成 分名称和判 断依据。
植物细胞分离实验报告
植物细胞分离实验报告实验目的本次实验的主要目的是通过采用玫瑰叶片作为实验材料，利用质外提取法和细胞外提取法，分离植物细胞，并观察植物细胞的结构。
实验材料和仪器- 材料：新鲜的玫瑰叶片、无菌蒸馏水、乙醇、碘酒- 仪器：显微镜、离心机、试管、移液管、玻璃片实验步骤步骤一：质外提取法1. 取一片新鲜的玫瑰叶片，用无菌蒸馏水将其冲洗干净。
2. 将玫瑰叶片切碎，并放入一个试管中，加入少量无菌蒸馏水。
3. 使用活力纤维素酶溶液，将玫瑰叶片浸泡在37C恒温水浴中，保持30分钟。
4. 轻轻倒出试管中的溶液，用离心机以3000转/分钟的速度离心5分钟。
5. 去除上层液体，用无菌蒸馏水洗涤沉淀3次。
6. 加入碘酒，用显微镜观察沉淀中细胞的结构。
步骤二：细胞外提取法1. 取一片新鲜的玫瑰叶片，用无菌蒸馏水将其冲洗干净。
2. 将玫瑰叶片切碎，并放入一个试管中，加入少量无菌蒸馏水。
3. 使用活力纤维素酶溶液，将玫瑰叶片浸泡在37C恒温水浴中，保持30分钟。
4. 轻轻倒出试管中的溶液，用离心机以3000转/分钟的速度离心5分钟。
5. 去除上层液体，将沉淀转移到一片干净的玻璃片上。
6. 用显微镜观察细胞的结构。
实验结果与观察经过质外提取法处理的玫瑰叶片样品，在显微镜下观察到细胞壁、细胞质和细胞核等结构清晰可见。
细胞壁呈现为一层薄而均匀的透明物质，细胞质内含有大量的细胞器，如叶绿体、线粒体等。
细胞核位于细胞质中心，呈现圆形或椭圆形，内含有染色体等成分。
而经过细胞外提取法处理的玫瑰叶片样品，则观察到了仅有细胞质的结构。
细胞壁被溶解，细胞质内的细胞器呈现出更为明显的特征，如叶绿体的绿色色素和线粒体的椭圆形结构。
实验分析与讨论通过本次实验，我们成功地利用质外提取法和细胞外提取法，分离了玫瑰叶片中的植物细胞，并观察到了它们的结构特征。
在质外提取法中，我们使用活力纤维素酶溶液将细胞壁溶解，使细胞质得以完整地保留。
这样可以更直接地观察到细胞质中的细胞器结构，并通过观察细胞核的位置和形态，了解细胞的生长状态和分裂能力。
叶绿素的提取、分离及化学性质鉴定
植物生理学实验报告实验题目：叶绿素的提取、分离及化学性质鉴定姓名班级学号一、实验原理和目的目的：1.练习叶绿素提取和分离的方法2.进一步了解叶绿素色素成分提取、分离原理：1、溶解性。
叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂，常用95%的乙醇或80%的丙酮提取2、吸附性。
滤纸对Chlb、Chla、叶黄素、胡萝卜素的吸附能力不同，当用石油醚作推动剂时，其在滤纸上的移动速度不同，可相互分离。
二、实验器具和步骤材料:新鲜植物叶片器具：研钵一个，漏斗一个，刻度试管两支，剪刀一把，长滴管一个，培养皿(直径9cm)一个，圆形滤纸（11cm和7cm)各一张，滤纸条一张试剂：95%乙醇，石油醚步骤：1.色素提取（乙醇粗提液）a.取新鲜叶片洗净擦干，去中脉称1g左右剪碎于研钵b.研钵中加3-5ml95%乙醇研磨成匀浆过滤于刻度试管残渣用少许乙醇冲洗一并过滤定容至10ml2.荧光观察将乙醇提取液试管放于太阳光下观察反射光和透射光下的颜色现象：透射光下呈绿色，反射光下呈红色为叶绿素荧光3.色素萃取（石油醚提取液）取乙醇提取液5ml与另一支试管加2ml石油醚摇荡静止片刻上层深绿色为石油醚提取液4.色素分离a.将（11cm)圆滤纸中间剪一小圆孔取滤纸条捻成紧实芯一端插入圆滤纸中心（孔缘与纸芯紧贴且露出少许，最好相平）用长滴管吸少许石油醚提取液滴于纸芯上端待风干后再滴加几次b.将盛有石油醚的内盖（不要过满）放于培养皿中央将插上纸芯的滤纸放在培养皿上纸芯下端浸入石油醚迅速盖好培养皿。
c.推动剂前缘接近滤纸边缘时取出滤纸，风干可见分离色带，用铅笔标出各种色素位置和名称三、实验数据和作业四、数据分析研磨叶片不充分，提取的叶绿体色素溶液浓度稀，荧光现象不明显分离色带较少的原因：提取的叶绿素的浓度稀胡萝卜素叶黄素。
叶绿体色素的提取、分离及含量测定
叶绿体色素的提取、分离及含量测定实验目的叶绿素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主要有叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。
叶绿素a与叶绿素b是高等植物叶绿体色素的重要组分，约占到叶绿体色素总量的75%左右。
叶绿素在光合作用中起到吸收光能、传递光能的作用(少量的叶绿素a还具有光能转换的作用)，因此叶绿素的含量与植物的光合速率密切相关，在一定范围内，光合速率随叶绿素含量的增加而升高。
另外，叶绿素的含量是植物生长状态的一个反映，一些环境因素如干旱、盐渍、低温、大气污染、元素缺乏都可以影响叶绿素的含量与组成，并因之影响植物的光合速率。
因此叶绿素含量a与叶绿素b含量的测定对植物的光合生理与逆境生理具有重要意义。
实验原理从植物叶片中提取和分离叶绿体色素是对其认识和了解的前提。
利用叶绿体色素能溶于有机溶剂的特性，可用95%乙醇提取。
分离色素的方法有多种，如纸层析、柱层析等。
纸层析是其中最简单的一种。
当溶剂不断地从层析滤纸上流过时，由于混合色素中各种成分在两相(即流动相和固定相)间具有不同的分配系数，它们的移动速度不同，使样品中的各种成分得到分离。
强光可以破坏离体的叶绿素，因为植物体内本来有还原酶，可以破坏光产生的强氧化物质。
而离体的叶绿素提取液中不含有还原酶，光产生的强氧化物质会破坏叶绿素。
叶绿素提取液中同时含有叶绿素a和叶绿素b，二者的吸收光谱虽有不同，但又存在着明显的重叠，在不分离叶绿素a和叶绿素b的情况下同时测定叶绿素a和叶绿素b的浓度，可分别测定在663nm和645nm（分别是叶绿素a和叶绿素b在红光区的吸收峰）的光吸收，然后根据Lambert-Beer定律，计算出提取液中叶绿素a和叶绿素b的浓度。
A663=82.04Ca+9.27Cb（1）A645=16.75Ca+45.60Cb（2）公式中Ca为叶绿素a的浓度，Cb为叶绿素b浓度（单位为g/L），82.04和9.27分别是叶绿素a和叶绿素b在663nm下的比吸收系数（浓度为1g/L，光路宽度为1cm时的吸光度值）；16.75和45.60分别是叶绿素a和叶绿素b在645nm下的比吸收系数。
实验三 叶绿体的分离、提取、观察
实验三叶绿体的分离、提取、观察2011.03.23班级：姓名：一．试验目的1．学习使用差速离心方法分离获取叶绿体。
2．理解叶绿体的分离与保存环境。
3．叶绿体的形态观察、测量、叶绿体悬液的荧光现象观察。
二．实验原理1．叶绿体是植物叶肉细胞内重要的细胞器，是植物光合作用的场所。
分离提取得到的活体叶绿体，既能进行光合作用速率测定，也能进行叶绿体色素的分离提取。
2．差速离心法常用于获取细胞中的某一物质，其原理是在一定转速条件下，不同密度大小的物质沉降速度不一样，最终使有密度差异的物质得以分离。
三．实验用具1．材料与试剂：菠菜叶、0.35mol/L NaCL、95%乙醇、石英砂。
2．器具：离心机、天平、量筒、研钵、玻棒、纱布等四．实验步骤1．选用生长健壮的菠菜叶片洗净后去除中脉，然后放入0—4 ℃冰箱或冰瓶中预冷。
2．取叶片经滤纸吸干水后，称取5g剪成碎片，于10—15 mL0.35mol/L氯化钠溶液中，置于研钵中，加少量石英砂，手工快速研磨，(注意不要用力过猛，也不必研磨过细)。
3．研磨后将匀浆用2层新纱布过滤，滤液盛于烧杯中。
4．将滤液装入预冷过的离心管，经天平平衡后，以1200r/min离心2min，弃去沉淀。
5．上清液再经3000 r/min离心5 min ，倾去上清液，沉淀即为叶绿体。
6．沉淀用2 mL 0.35mol/L氯化钠溶液悬浮，备用。
7．用滴管取少量悬浮液于载玻片上，加盖玻片后，吸水纸吸去多余的溶液，置显微镜下镜检观察。
可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。
测量叶绿体的长轴和短轴，分别测量5~10个叶绿体，求其平均值。
8．称取叶片5g剪成碎片，加10—15 mL95%乙醇及少量石英砂，于研钵中快速研磨，然后2层纱布过滤，取滤液，将其装入离心管，以2500r/min离心3min，收集上清液于试管中。
9．叶绿体荧光现象的观察：用强的柱状光源照射盛装叶绿素提取液的试管，然后顺着光源方向观察提取液颜色，并和对着光管观察是的情况进行比较。
植物生理学实验报告叶绿体色素的提取分离理化性质和叶绿素含量的测定
植物生理学实验报告叶绿体色素的提取分离理化性质和叶绿素含量的测定引言：叶绿体是植物细胞中的一个重要细胞器，其中主要存在着叶绿素等色素，它们在光合作用中起着重要的作用。
研究叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定，对于了解光合作用的机理以及研究植物生理生化过程具有重要意义。
本实验旨在通过实验手段提取叶绿体色素，进行色素的分离、理化性质的研究和叶绿素含量的测定。
材料与方法：材料：菠菜叶片、研钵、磨杵、丙酮、乙醇、石油醚、叶绿素提取液、测色皿、高锰酸钾溶液、浓硫酸。
方法：1.取适量菠菜叶片放入研钵中，加入适量丙酮，用磨杵捣碎成糊状。
2.将捣碎的菠菜糊状物转移到玻璃漏斗中，用石油醚冲洗3次，使叶绿体附着物进一步析出。
3.将漏斗中的上清液收集，并加入适量乙醇，振摇混合，使叶绿素慢慢析出。
4.将释放出的叶绿体颗粒通过离心机离心沉淀10分钟，收集沉淀。
5.取收集到的叶绿体沉淀，加入适量叶绿素提取液，用乳钙酸钠解离剂进行叶绿素含量的测定。
6.将其中一部分叶绿体溶液加入高锰酸钾溶液，观察颜色变化。
7.将其余叶绿体溶液与浓硫酸混合，观察颜色变化。
结果与讨论：通过上述方法，我们成功地提取并分离出菠菜叶片中的叶绿体色素。
加入石油醚可以去除一部分杂质，使叶绿体进一步纯化。
加入乙醇可以使叶绿素从叶绿体中溶出。
通过离心沉淀，我们收集到了叶绿体的沉淀物。
叶绿体的提取液与高锰酸钾溶液反应后呈现蓝色或紫色，这是由于高锰酸钾通过氧化反应将一些具有现菌酮结构的物质氧化为合成叶绿素的前体物质所引起的。
这种反应也证实了叶绿体的存在。
叶绿体溶液与浓硫酸混合后呈现蓝绿色，这是由于浓硫酸通过剥离叶绿体周围的蛋白质和其他有机物质，将叶绿素分子释放出来，产生颜色变化。
叶绿素的含量测定是通过与乳钙酸钠解离剂反应来进行的。
乳钙酸钠解离剂能够与叶绿体中的叶绿素结合，并形成稳定的叶绿素-乳钙酸钠络合物。
这种络合物通过光密度的测定，可以根据比色法来测量叶绿素的含量。
叶绿体的分离实验报告
一、实验目的1. 学习叶绿体的分离方法。
2. 观察叶绿体的形态和结构。
3. 了解叶绿体在植物细胞中的分布。
二、实验原理叶绿体是植物细胞中进行光合作用的细胞器，主要分布在植物的叶片细胞中。
叶绿体含有叶绿素等色素，能够吸收光能并将其转化为化学能。
本实验通过研磨植物叶片，利用叶绿体在水中溶解度低、在丙酮中溶解度高的特性，将叶绿体从细胞中分离出来。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：新鲜植物叶片（如菠菜叶）。
2. 实验仪器：研钵、研杵、蒸馏水、丙酮、载玻片、盖玻片、显微镜、酒精灯、镊子等。
四、实验步骤1. 取新鲜植物叶片，用剪刀剪成小块。
2. 将叶片放入研钵中，加入适量蒸馏水。
3. 用研杵充分研磨叶片，使细胞破裂，叶绿体释放出来。
4. 将研磨液过滤，去除叶片碎片。
5. 取少量过滤液，加入等体积的丙酮，充分混合。
6. 静置一段时间，待叶绿体在丙酮中沉淀。
7. 用镊子取出沉淀，滴在载玻片上。
8. 将载玻片放在显微镜下观察叶绿体的形态和结构。
五、实验结果与分析1. 观察到载玻片上的叶绿体呈绿色，呈扁平的椭球形或球形。
2. 叶绿体在显微镜下具有明显的网状结构，其中包含类囊体、叶绿素等成分。
3. 通过比较实验前后叶绿体的形态和结构，可以判断叶绿体在植物细胞中的分布。
六、实验讨论1. 实验过程中，为什么加入丙酮可以使叶绿体沉淀？答：叶绿体在水中溶解度低，在丙酮中溶解度高，加入丙酮可以使叶绿体从溶液中沉淀出来。
2. 实验过程中，为什么研磨叶片时需要加入蒸馏水？答：蒸馏水可以破坏细胞结构，使叶绿体释放出来，同时保持实验液的清洁。
3. 实验过程中，为什么需要过滤研磨液？答：过滤可以去除叶片碎片，保证实验结果的准确性。
4. 实验过程中，为什么需要观察叶绿体的形态和结构？答：通过观察叶绿体的形态和结构，可以了解叶绿体的基本特征，进一步了解其在植物细胞中的分布和功能。
七、实验结论本实验成功分离出植物叶片中的叶绿体，并观察到叶绿体的形态和结构。
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五、实验方法和步骤
1．取材：取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后，除 取材：取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后， 叶梗及粗脉，剪成0.5x0.5cm小块。 0.5x0.5cm小块 叶梗及粗脉，剪成0.5x0.5cm小块。 匀浆：将称取60g 60g叶片小块放入组织捣碎机套 2．匀浆：将称取60g叶片小块放入组织捣碎机套 筒内，加入200ml SNT溶液 匀浆20 溶液， 20秒 筒内，加入200ml SNT溶液，匀浆20秒(最高 速度)制成匀浆液。 速度)制成匀浆液。 过滤：将匀浆液经四层纱布过滤， 400目尼 3．过滤：将匀浆液经四层纱布过滤，或400目尼 龙网过滤，滤液分装离心管，平衡。 龙网过滤，滤液分装离心管，平衡。
三、实验用具和试剂
1/3000中性红染液 中性红染液: ③ 1/3000中性红染液: 称取0.5中性红溶于50ml Ringer溶液 0.5中性红溶于 溶液， 称取0.5中性红溶于50ml Ringer溶液， 稍加热（30~400C）使之很快溶解， 稍加热（30~400C）使之很快溶解，用滤纸过 装入棕色瓶于暗处保存，否则易氧化沉淀， 滤，装入棕色瓶于暗处保存，否则易氧化沉淀， 失去染色能力。 失去染色能力。 临用前，取已配制的1%中性红溶液1ml 1%中性红溶液1ml， 临用前，取已配制的1%中性红溶液1ml， 加入29ml Ringer溶液混匀 装入棕色瓶备用。 溶液混匀， 加入29ml Ringer溶液混匀，装入棕色瓶备用。 ④ 香柏油 材料： 3．材料：新鲜菠菜
叶肉细胞
细胞核
活细胞及细胞核
叶绿体
绘图参考
提示： 提示：下次实验为 实验五 细胞膜的通透性 实验六 细胞凝集反应
六、实验结果
1．在普通光学显微镜下，在悬浮液1滴片中可以看到含细胞核 在普通光学显微镜下，在悬浮液1 和大量叶绿体的叶肉细胞 叶肉细胞（ 和大量叶绿体的叶肉细胞（形态为球形或椭圆形的原生质 体）。 在普通光学显微镜下，在悬浮液2滴片中可以看到细胞核 2．在普通光学显微镜下，在悬浮液2滴片中可以看到细胞核 形态为球形）。 （形态为球形）。 在普通光学下，在悬浮液1 滴片中性红染色可以鉴别活细 3．在普通光学下，在悬浮液1、2滴片中性红染色可以鉴别活细 胞及细胞核（中性红是液泡系特殊的活体染色剂， 胞及细胞核（中性红是液泡系特殊的活体染色剂，在细胞处 于生活状态时，中性红只将液泡染成红色， 于生活状态时，中性红只将液泡染成红色，而细胞质及细胞 核不着色。如果细胞死亡，红色会弥散在整个细胞中）。 核不着色。如果细胞死亡，红色会弥散在整个细胞中）。 在普通光学显微镜下，在悬浮液3滴片中可以看到叶绿体 4．在普通光学显微镜下，在悬浮液3滴片中可以看到叶绿体 叶绿体为绿色椭圆形， （叶绿体为绿色椭圆形，在高倍镜下可以看到叶绿体内部含 有较深的绿色小颗粒，即基粒）。 有较深的绿色小颗粒，即基粒）。
四、实验内容
1．组织匀浆液的制备（组织捣碎法）。 组织匀浆液的制备（组织捣碎法）。 细胞及细胞器（细胞核、叶绿体等） 2．细胞及细胞器（细胞核、叶绿体等）的分 纯化（离心分离法）。 离、纯化（离心分离法）。 细胞、细胞核、叶绿体的镜检（根据形态、 3．细胞、细胞核、叶绿体的镜检（根据形态、 大小、分布位置、数量识别法）。 大小、分布位置、数量识别法）。 分离细胞活性的鉴别（ 4．分离细胞活性的鉴别（中性红活体染色 法）。
二、实验原理
细胞器的分离是研究细胞器的结构、 细胞器的分离是研究细胞器的结构、功能和化学 组成的技术基础，保持分离的细胞器的纯度、 组成的技术基础，保持分离的细胞器的纯度、结 构完整及其生理、生化活性是本实验的三大要素。 构完整及其生理、生化活性是本实验的三大要素。 细胞核是植物细胞中最大、最重要的细胞器， 细胞核是植物细胞中最大、最重要的细胞器，使 细胞各种生命活动的指挥中心。 细胞各种生命活动的指挥中心。叶绿体是植物细 胞进行光合作用，将光能转变成化学能的重要细 胞进行光合作用， 胞器。由于它们的重要功能， 胞器。由于它们的重要功能，所以它们一直是细 胞生物学、遗传学、 胞生物学、遗传学、和分子生物学研究的重要对 利用离心技术可分离、纯化细胞、 象。利用离心技术可分离、纯化细胞、细胞核和 叶绿体。 叶绿体。
5．悬浮：分别收集沉淀，用少量的SNT溶液 悬浮：分别收集沉淀，用少量的SNT溶液 SNT 分别将沉淀1 悬浮。 分别将沉淀1、2、3悬浮。 镜检： 6．镜检： 取悬浮液1 分别做滴片镜检。 ① 取悬浮液1、2分别做滴片镜检。 然后加几滴中性红染色5 10min， 然后加几滴中性红染色5-10min，盖 上盖玻片镜检。 上盖玻片镜检。 取悬浮液3做滴片盖上盖玻片， ② 取悬浮液3做滴片盖上盖玻片，用油镜 观察。 观察。
三、实验用具和试剂
1．仪器：组织捣碎机、高速冷冻离心机、托盘天平、 仪器：组织捣碎机、高速冷冻离心机、托盘天平、 普通光学显微镜、剪刀、培养皿、250ml烧杯 烧杯、 普通光学显微镜、剪刀、培养皿、250ml烧杯、量 玻璃漏斗、移液管、离心管、滴管、滤纸、 筒、玻璃漏斗、移液管、离心管、滴管、滤纸、 纱布一大块或400目尼龙网、载玻片、盖玻片。 400目尼龙网 纱布一大块或400目尼龙网、载玻片、盖玻片。 SNT溶液 0.4M蔗糖 溶液： 蔗糖、 2．试剂：① SNT溶液：0.4M蔗糖、0.01M NaCl 试剂： ② 0.05M Tris-HCL缓冲液 ： Tris-HCL缓冲液 Tris（ 0.2M Tris（三羟甲基氨基甲烷） 50ml 500.1N HCL 50-55ml 两液混匀后，加蒸馏水至200ml 200ml， 两液混匀后，加蒸馏水至200ml，pH7.6
八、实验作业
1.绘制出一个完整的叶肉细胞图（内含细胞核、叶绿体） 1.绘制出一个完整的叶肉细胞图（内含细胞核、叶绿体）。 绘制出一个完整的叶肉细胞图 2.得到结构真实、完整并具生理、 2.得到结构真实、完整并具生理、生化活性的细胞器应注 得到结构真实 意哪些问题？谈谈SNT溶液中的各种成分的作用。 意哪些问题？谈谈SNT溶液中的各种成分的作用。 SNT溶液中的各种成分的作用 3.分离各种细胞器所需的相对离心力与哪些因素有关？ 3.分离各种细胞器所需的相对离心力与哪些因素有关？ 分离各种细胞器所需的相对离心力与哪些因素有关 4.对你设计的实验的成败谈谈感想，提出改进的措施。 4.对你设计的实验的成败谈谈感想，提出改进的措施。 对你设计的实验的成败谈谈感想 5.做哪些研究需要分离制备叶绿体？ 5.做哪些研究需要分离制备叶绿体？ 做哪些研究需要分离制备叶绿体
4．离心： 滤液 离心： 200× 1000rpm/分 ↓200×g（1000rpm/分）1分 ________________________ ↓ ↓ 沉淀1 上清,平衡, 沉淀1 上清,平衡,离心 含叶肉细胞） 500× 1500rpm/分 （含叶肉细胞） ↓500×g（1500rpm/分）1分 ↓ ↓ 沉淀2 含细胞核） 上清,平衡, 沉淀2（含细胞核） 上清,平衡,离心 1000× 3000rpm/分 ↓1000×g（3000rpm/分）5分 ↓ ↓ 沉淀3 上清， 沉淀3 上清，弃 含大量叶绿体） （含大量叶绿体）
二、实验原理
将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心， 将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离 等渗介质中进行差速离心 各种细胞器的常用方法。 各种细胞器的常用方法。颗粒在离心场中的沉降速率取决于 颗粒的大小、形状和密度， 颗粒的大小、形状和密度，也与离心力以及悬浮介质的粘度 有关。在一给定的离心场中，一定时间内， 有关。在一给定的离心场中，一定时间内，密度和大小不同 的颗粒其沉降速率不同，依次增加离心力和离心时间， 的颗粒其沉降速率不同，依次增加离心力和离心时间，能使 非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心 非均一悬浮液中的颗粒按其大小、 管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分， 管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分，最先沉淀的是 细胞，其次是细胞核，接下来是叶绿体。 细胞，其次是细胞核，接下来是叶绿体。 悬浮介质通常用缓冲的等渗溶液，它与细胞质的分散相 悬浮介质通常用缓冲的等渗溶液， 缓冲的等渗溶液 接近，在一定程度上能保持细胞器的真实结构和酶的活性 能保持细胞器的真实结构和酶的活性。 接近，在一定程度上能保持细胞器的真实结构和酶的活性。
பைடு நூலகம்
七、实验注意事项
• 得到结构真实、完整并具生理、生化活性的细 得到结构真实、完整并具生理、 胞器应注意的问题？ 胞器应注意的问题？ 1．细胞和各种细胞器的分离应在等渗溶液中 进行， 进行，以免渗透压的改变使细胞和细胞器 的受到损伤。 的受到损伤。 要注意整个实验的分离过程必须在0 2．要注意整个实验的分离过程必须在0～5℃ 的条件下进行，避免酶的失活； 的条件下进行，避免酶的失活；如果在室 温下，要迅速分离和观察。 温下，要迅速分离和观察。 离心过程中要注意离心力和离心时间。 3．离心过程中要注意离心力和离心时间。
实验四
植物叶片活细胞和叶绿体的 分离提取及观察
College of Life Science and Technology, XINJIANG Univercity
一、实验目的
初步掌握运用机械法分离活细胞和细胞器 的方法； 的方法； 掌握运用差速离心或密度梯度离心分离纯 化叶肉细胞，细胞核，叶绿体的方法； 化叶肉细胞，细胞核，叶绿体的方法； 掌握分离的细胞的活性鉴别方法； 掌握分离的细胞的活性鉴别方法； 熟悉叶肉细胞或原生质体、细胞核、 熟悉叶肉细胞或原生质体、细胞核、叶绿 体的形态大小。 体的形态大小。