纳米膜过滤技术在提高人血浆制品安全性方面的应用

纳米膜过滤技术在提高人血浆制品安全性方面的应用来源：本站原创作者：代旭兰陈海陈代杰刘文芳（四川远大蜀阳药业股份有限公司，四川双流 610214）发布时间：2009-12-2病毒污染严重威胁血液制品的安全性，如何进一步提高制品的安全性是人们始终所关注的问题。

虽然经过改进原料血浆筛选的检测方法、增加血浆检疫期、增加制品有效病毒灭活/去除步骤、提高生产技术和GMP等措施已经使制品安全性得到了很大的提高，HIV、HBV和HCV）经由现代生产工艺制得的血液制品传播的可能性已经非常小，但仍有少量的病毒，如细小病毒B19（B19）等小型病毒，通过一些凝血因子浓缩物传播的危险还没有完全消除［1—3］，新出现的病原体，如变异型克雅氏病（vCJD），也是安全性关注的焦点［4,5］。

因此，血液制品的研究与生产厂家仍然要致力于不断研发增加病毒灭活/去除的新方法。

采用小孔径的膜过滤血浆蛋白溶液，是通过筛选机制截留并去除血浆中的病毒的一种方法；和常规的过滤不同，这项技术所采用的膜的平均孔径为纳米级别，且专为去除病毒而开发，所以又被称为纳米膜过滤。

目前，这项技术作为病毒灭活/去除方法的一种安全补充措施，已被广泛接受并应用于生物制品的病毒去除。

1 纳米膜过滤技术及其产品类型1.1 纳米膜过滤的原理该技术是根据根据分子筛原理，按膜孔径大小截留病毒，使目的蛋白通过滤器，大致分为错流（切向）过滤和直流（死端）过滤2种方式，其病毒去除率和蛋白透过率很大程度上都依赖膜的结构。

纳米膜过滤能有效去除大于膜平均孔径的病毒，对于小于或接近平均膜孔径的病毒、病毒聚合体、潜在的病毒与抗体复合物则去除效果不甚理想，蛋白质浓度和因电荷效应产生的膜表面吸附等因素都可能影响病毒清除的程度。

该技术的蛋白质回收率取决于蛋白浓度、蛋白质聚合物或高分子量组分、过滤表面积、pH和温度等因素。

市售的多数纳米膜为整装的易处理囊式膜包或盒式膜包，可在过滤前后对其进行完整性测试，以确保该滤器在使用中滤除病毒的能力，这是纳米膜过滤可靠性的一个额外的保障。

纳米膜过滤通常置于工艺中常规病毒去除步骤和层析纯化步骤之后，因为通过下游工艺处理后的料液的蛋白浓度降低，纯度提高，更有利于满足纳米膜过滤的要求。

纳米膜过滤之前往往会先做预过滤，以去除蛋白聚合体、DNA和其它的痕量污染物［6］。

有研究发现35 nm纳米膜过滤免疫球蛋白（IgG）并不能完全清除其中的HCV，即虽然纳米膜有良好的病毒去除能力，但不能作为单独的病毒灭活/去除步骤使用［7］。

本着确保制品安全性的原则，生产工艺中通常采用多种不同机制的方法联用，如结合S/D、pH4、巴氏、纳米膜过滤等技术以提高病毒安全性。

1.2纳米膜过滤产品的类型见表1。

旭化成公司（日本东京）于1989年推出了第1款专门为清除生物制药产品中病毒颗粒而设计的过滤器Planova ，由亲水铜铵再生纤维素制成的中空纤维微孔膜，装入聚碳酸酯壳体中。

Viresolve NFP膜（Millipore）是一种复合聚偏氟乙烯膜，过滤盒被设计来从高纯蛋白溶液中移除小型病毒，如B19，蛋白质溶液中，B19的去除量通常＞4 log；Viresolve NFR膜是一种铸塑的高分子膜，专门研发用于去除在生产重组蛋白的培养基和杂交瘤细胞培养物中可能污染的80—120 nm的逆转录病毒，在血液制品生产中的应用有限，因为它对＜80 nm的脂包膜和非脂包膜血浆传播病毒无法去除。

Ultipor VF（病毒过滤）DV50和DV20是美国Pall公司的亲水改性聚偏氟乙烯微孔折叠膜；Sartorius生产的Virosart CPV为聚醚砜过滤器，能去除＞4 log的PPV和＞6 log的逆转录病毒。

表1 常见的纳米膜产品类型2 纳米膜过滤的特点2.1针对性强，实用性广目前血液制品生产中常用的病毒灭活/去除工艺主要有巴氏灭活、S/D处理、低pH孵放、干热灭活和辛酸盐灭活，不同于这些病毒灭活/去除步骤，纳米膜过滤只与病毒和目的蛋白的大小有关，无论病毒是否有脂包膜外壳、是否耐热，纳米膜过滤都能将之去除。

对于标准的分离/纯化方法（如离心法和色谱法），其工作的条件主要是为蛋白纯化服务，其病毒清除效果往往是偶然达到的［8］，若要同时保持病毒清除和避免批间污染，将耗费大量的时间，成本昂贵。

相比之下，专门为去除病毒设计的纳米膜能用规模较小的模型和完整性检测进行验证，操作相对简单，便于整合到生产过程的各个步骤，而其它去除病毒的方法在这方面的潜力通常较小。

2.2毒性小，下游污染少能有效去除杀灭病毒后可能留下的如抗原和核酸蛋白混合物等病毒标志物，有效降低下游污染，是纳米膜的另一特点。

大多数病毒灭活处理都使用有毒或致突变的理化试剂，从而必须在使用后从蛋白质溶液中清除，而纳米膜过滤不存在毒性问题，只是在验证中要考虑到滤器浸出物的风险。

在大多数情况下，纳米膜过滤都位于在工艺过程最后，在细菌过滤和无菌灌装之前进行，因此“最小化”了传染源下游污染的风险。

2.3蛋白活性高，回收率高一些非脂包膜病毒的灭活相对脂包膜病毒需要更严苛的条件，一些病毒灭活方法也可能引起产品的大量损失或是产生新抗原，如热处理可能会损失20％或更多的蛋白质。

而纳米膜过滤是在正常条件下的pH、渗透压和温度下进行的温和的生产步骤，其蛋白回收和活性都很高，通常在90%—95％。

基于体外分析、实验研究和临床经验，纳米膜过滤试验都没有显示出蛋白质改变或是新抗原的产生。

相比之下，有报道指出血友病患者出现抑制剂案例的增加，与使用血浆凝血因子FⅧ制品采用热病毒灭活或某些纯化步骤有关［9,10］。

纳米膜过滤不改变制品特性，这一特点促进了监管机构认可和产品的注册。

2.4有效去除朊病毒目前还未发现经常接受血液制品注射的血友病患者或是接受输血的患者患vCJD的案例［11~13］，但vCJD可能存在于血浆中和通过输注传播的可能性尤其令人担忧［14］。

由于感染该朊病毒的患者在发病前长期处于无症状状态，目前也还没有适当的能用于原料血浆检测的方法，难以有效避免vCJD通过血液传播的风险；而且朊病毒具有很强的抗性，已知的病毒灭活工艺很难对它进行灭活。

有研究显示纳米膜过滤是一种有效的清除朊病毒的方法，采用Planova 35 N纳米膜能去除1.61 log的朊病毒，存在去垢剂（月甲基氨基乙酸钠）的条件下可去除4.93 log；同样条件下，采用15 N的纳米膜去除朊桂酰 N病毒≥5.87 log，存在去垢剂时去除朊病毒≥4.21 log。

使用15 nm或更小孔隙纳米膜的时候都没有检测到任何残余的传染性物质［15］。

当生产涉及使用人源或动物源性材料，或牛源性的医药产品时，采用纳米膜过滤作为朊病毒分离步骤将会大大提高人血液制品和其它的生物制药产品的安全性。

3 纳米膜过滤在血浆制品中的应用近年来，纳米膜的各种规格已得到较大的完善，能进行高浓度的蛋白 病毒分离，基本上适用于所有类别的血浆制品。

纳米膜过滤在生物制药产品行业的首次工业应用是用于血浆来源的FⅨ浓缩物的制备，渐渐地被应用到较大分子量的制品中。

3.1 凝血因子3.1.1 凝血因子Ⅸ（FⅨ）FⅨ相对分子量较低（57 kD），是纳米膜过滤工艺成功应用的第1个制品。

病毒验证表明：纳米膜过滤可以去除HIV、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、猪伪狂犬病病毒（PPRV）、呼肠孤病毒3型（RT3）和猴病毒40（SV40），去除病毒量从＞5.7 log到＞7.8 log不等［16］。

体外数据显示纳米膜过滤处理后制品性质没有变化，FⅨ活性也未出现改变。

在标志物的体外活化试验中，兔Wessler模型血栓试验和低血压大鼠模型未发现任何纳米膜过滤步骤的影响。

乙型血友病患者的临床研究数据表明，经过纳米膜过滤的制品具有正常的半衰期和回收，没有血栓产生［17,18］。

通过金属螯合层析和S/D病毒灭活制备的高纯FⅨ浓缩物通过Planova 15 N过滤，许多脂包膜病毒，如单纯疱疹病毒 1（HSV 1）、辛德毕斯病毒（Sindbis），都能去除病毒＞7 log；对于非脂包膜病毒，如牛细小病毒（BPV）和HAV被去除＞6 log，脊髓灰质炎病毒可去除＞5.6 log，脑心肌炎病毒为5.7 log；临床前和临床试验没有发现可探测到包括血栓在内的影响［19］。

串联Planova 35 N和15 N进行纳米膜过滤制备高纯FⅨ制品［20］，其中HAV减少6.7 log，BVDV减少5.8 log［20］。

Shackel等［21］采用Planova 15 N过滤FⅨ中间品，B19减少6—7 log，Planova 35 N过滤去除B19＜1 log。

由于回收率高，相对易于使用和临床没有副作用，小孔径纳米滤器过滤技术因此广泛应在FⅨ浓缩物的生产中。

3.1.2凝血酶原复合物（PCC）由于PCC具有高蛋白含量，并含有多种凝血因子（分子量介于55—72 kD）和高分子量蛋白质，如高分子激肽原（110 kD），因此很难达到纳米膜过滤的要求。

第1个应用纳米膜过滤技术的PCC制品经过巴氏灭活后采用了Planova 35 N过滤，去除大型脂包膜病毒（HSV 1、HIV 1）＞7 log，去除中型脂包膜病毒（HBV、BVDV）约4 log，而脊髓灰质炎病毒没有截留；该制品特性没有受到纳米膜过滤步骤的影响，也未出现血栓增加状况［22］。

经过S/D灭活和纳米膜过滤的PCC制品在体外或动物模型和临床使用中都没有出现血栓的证据［23］；以串联的Planova 15 N滤器进行纳米膜过滤能增强去除病毒能力，研究数据表明能清除＞5.9 log的犬细小病毒［24］。

3.1.3凝血因子Ⅷ(FⅧ) 自1990年代初以来，大多数凝血FⅧ浓缩物引入层析法进行纯化，去除了可能在甲型血友病患者体内引起免疫抑制的外源血浆蛋白，减少了蛋白质含量，使F Ⅷ的纯度提高了100—1 000倍，加速了如磷酸正丁酯（TNBP）、Tween 80或Triton X 100等病毒灭活试剂的去除，因此尽管FⅧ的分子量相对较大（330 kD），仍然实现了纳米膜过滤。

Planova 35 N过滤的FⅧ的体外特性稳定，与非纳米膜过滤的制品相似，病毒性验证的数据显示能如预期般有效去除大中型病毒，但是对于小型非脂包膜病毒，如EMC、HAV和B19的去除率并不好。

然而，当常规引入纳米膜过滤时，最后的FⅧ浓缩物中的B19 DNA含量明显降低，这显示35 N过滤有助于去除一些病毒［25］。

Chtourou等［26］用串联的Planova 35 N 和15 N进行纳米膜过滤，病毒验证的数据表明双过滤步骤中BVDV、HIV、HAV和PPV的病毒去除分别为＞4.06、＞3.77、＞3.72及＞6.08 log。

体外分析表明，FⅧ在纳米膜过滤过程中并不会被激活或降解；在凝血酶存在的情况下，激活因子Ⅹ（FⅩ）的产生，与磷脂结合、蛋白质水解的动力学都与未经过纳米膜过滤的制品相似，兔免疫原性试验没有显示出有新抗原的产生。