《生物化学实验》(精)
《生物化学试验》实验五：改良Mohun法测定谷-丙转氨酶活性
临床意义
用本法测定血ALT正常值为40 U/ml以下
肝细胞中含ALT最丰富，因此当肝脏疾病致肝细胞 受损伤时，ALT即大量释放入血液，致使血清中ALT 活性增高。 测定ALT是检查肝功能的重要指标之一。 显著增高见于各种急性肝炎及药物中毒性肝细胞坏死， 中等程度增高见于肝癌、肝硬化、慢性肝炎及心肌梗塞， 轻度增高则见于阻塞性黄疸及胆道炎等疾病。
glutamate pyruvate
在520nm波长测定其光密度，与经同样处理标准
丙酮酸溶液比较，即可计算谷-丙转氨酶的活性。
pyruvate
2, 4-dinitrate phenylhydrazine
(brown) pyruvate dinitrate
phenylhydrazone
血清谷-丙转氨酶活性单位定义：每毫升血清在pH值7.4，
复习分光光度计的使用
（1） 开机，调波长，预热15-20分钟 （2）将待比色溶液倒入比色杯 • 高度2/3 - 4/5比色杯 • 手握毛面，注意光面整洁 • 依次放入样品室（空白管放第一槽，毛面朝向操作者）
（3）测定
T档 拉杆0档
调T100% ： 空白管
T档 拉杆1档
调T 0%, 转为A档 A=1.-----
1 、保温温度和时间要精确， 即谷丙转氨酶发挥催化作用环境
2 、概念：酶活性单位
3、 微量移液器的使用 P4
（1） 套吸头 （2） 吸取溶液： 按到第一档，垂直进入液面（0.5cm）
缓慢松开控制按钮，使之慢慢回到初始位置。 （3）移入试管中：吸头贴壁并有一定角度，将溶液全部吹出。
吸头弃于烧杯中，微量移液器放回盒内。
1.0
0.5
－
－
－
《生物化学实验》教学大纲
《生物化学实验》教学大纲《生物化学实验》课程实验教学大纲课程名称（中文）：生物化学实验课程名称(英文)experimentofbiochemistry课程编号课程类型专业必修课教材和实验说明名称教材：《生物化学实验》自编教材教学：生物化学实验原理与方法（北京大学出版社）是否独立设课是学时和学分：实验学时72实验学分2开始时间：二年级第二学期和第三学期适用于专业生物科学、生物技术、生态学和生物化学备注：课程类型分为公共必修课、公共选修课、专业必修课、专业选修课一、课程介绍和基本要求《生物化学实验》课程内容分为三个层次：基础验证实验、综合性实验和研究设计性实验。
基础验证实验是一些加强学生基本实验技能训练的传统实验。
综合实验包括一些新近发展起来的生化实验技术。
经过多层次的训练后，学生应达到下列要求：1.进一步巩固和加深对生物化学基础知识的理解，掌握生物化学实验的基础知识和基本操作技能。
如生化分离、制备、分析和鉴定技术。
2、提高观察问题、分析问题和解决问题的能力。
通过独立思考，深入钻研有关问题，初步具有解决生物化学实验问题的能力。
3.能正确使用仪器设备，掌握仪器的工作原理。
4、能利用所学知识准确分析实验结果，并能独立设计实验。
5、课前做好预习，课后认真完成实验报告，全面分析实验结果。
二、课程实验的目的和要求《生物化学实验》是《生物化学》理论教学的深化和补充，具有较强的实践性，是一门重要的基础实验课程，可作为生物技术、生物科学、药学专业学生的必修课。
掌握生化实验的基本知识和基本技能，包括生化分离、制备、分析和鉴定技术（如滴定、比色、色谱和电泳），并掌握各种仪器的使用。
随着生物化学的快速发展，新的实验方法和技术不断出现。
我们还需要掌握一些新的、实用的实验技能，比如一些分子生物学的基础实验。
通过本课程的学习，学生可以巩固和深化生物化学的理论知识，进一步增强通过实践分析和解决问题的能力，提高设计和创新能力，使学生具有一定的科研能力和严谨的科学态度，为学生进行更高水平的生物化学和分子生物学实验奠定基础。
《生物化学》实验讲义
实验一蛋白质及氨基酸的颜色反应一、目的意义1、学习几种鉴定氨基酸与蛋白质的一般方法及其原理。
2、学习和了解一些鉴定蛋白质的特殊颜色反应及其原理。
二、实验原理1、双缩脲反应当尿素加热到180℃左右时，2分子尿素发生缩合放出1分子氨而形成双缩脲.双缩脲在碱性溶液中与铜离子结合生成复杂的紫红色化合物,这一呈色反应称为双缩脲反应。
蛋白质分子中含有多个与双缩脲相似的键，因此也具有双缩脲的颜色反应.借此可以鉴定蛋白质的存在或测定其含量。
应当指出，双缩脲反应并非蛋白质的特异颜色反应，因为凡含有肽键的物质并不都是蛋白质.2、茚三酮反应蛋白质与茚三酮共热,产生蓝紫色化合物，此反应为一切蛋白质及α-氨基酸（除脯氨酸和羟脯氨酸）所共有。
含有氨基酸的其他化合物也呈此反应.该反应十分灵敏，1:1500000浓度的氨基酸水溶液就能呈现反应。
因此，此反应广泛用于氨基酸的定量测定.3、黄色反应含有苯环侧链的（特别是含酪氨酸）蛋白质溶液与硝酸共热时，呈黄色（硝基化合物)，再加碱则变为橙黄色，此反应也称为黄蛋白反应。
OH+HNO3HO NO2+H2OHO NO2+O NOH三、仪器与试剂1、试剂(1) 蛋白质溶液：取10mL鸡蛋清,用蒸馏水稀释至100mL,搅拌均匀后用纱布过滤得上清液。
（2) 0。
3％色氨酸溶液、0。
3%酪氨酸溶液、0。
3％脯氨酸溶液、0。
5％甘氨酸溶液、0.5%苯酚溶液。
(3） 0.1％茚三酮－乙醇溶液:称取0。
1g茚三酮，溶于100mL 95％乙醇。
(4） 10%NaOH溶液、1％硫酸铜溶液、尿素、浓硝酸.2、仪器：试管及试管夹、酒精灯。
四、操作方法1、双缩脲反应(1) 取一支干燥试管，加入少量尿素,用微火加热使之熔化,待熔化的尿素开始变硬时停止加热。
此时，尿素已缩合为双缩脲并放出氨气（可由气味辨别）.待试管冷却，加入约1mL10％NaOH溶液，振荡使其溶解，再加入1滴1%硫酸铜溶液。
混匀后观察出现的粉红色. (2）另取1支试管，加入1mL蛋白质溶液，再加入2mL 10%NaOH溶液摇匀，然后再加入2滴1%的硫酸铜溶液。
《生物化学》实验课件：实验三 组织匀浆的制备方法和琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制的观察
血液化学分析干扰少。
• 肝素抗凝血不宜作血细胞培养，不宜作纤维蛋白原测定，作 DC时，染色性较差。作血液量元素分析时慎用。
• 一般配成1%水溶液，取0.5ml于试管，37～50℃烘干，可抗 凝5ml血液。
• 2．血液样品的区别 • ①血浆与血清的区别 • 血浆：抗凝采血后立即分离，含有纤维蛋原和前凝血酶 • 血清：血液凝固，血清析出后分离，不含纤维蛋原和前
凝血酶。 • ②全血一般用于血细胞分析，不宜作系列化分析。
生化分析一般用血清或血浆。
• 3．常用抗凝剂
• ①EDTA—Na2 ：能较好地保存血细胞成分，可得较纯的细胞 悬液。对血细胞形态影响很小，适于血细胞分析。
剪碎，
3-4ml 1/15mol/L Na2HPO4 1 g 猪心
匀浆
6-7ml, 1/15mol/L Na2HPO4
放置20min
2000r / min 上 清 液 离心10min （酶液）
细胞破碎
抽提
分离
2ห้องสมุดไป่ตู้ 琥珀酸脱氢酶的作用及酶竞争抑制作用的观察
试管号
1 2 3 4
心脏提取 琥珀酸钠 丙二酸钠 蒸馏水
实验器材与试剂:
（一）试剂 pH=7.4 磷酸缓冲液 1.5% 琥珀酸钠溶液 1% 丙二酸钠溶液 0.02% 甲烯蓝溶液 生理盐水 液体石蜡
实验器材与试剂：
（二）器材
研钵、手术剪、手术镊子 2 mL 移液管 1000 uL微量可调仪器 10 mL 离心管 低速离心机等
实验操作：
1. 琥珀酸脱氢酶酶液的制备
本实验设计在无氧的条件下使底物脱下来的氢交给氧化型的受氢体甲烯 蓝（蓝色）使之成为还原型受氢体甲烯白（无色），通过观察蓝色到无色的 变化从而了解脱氢酶的活性。
生物化学实验
生物化学实验》课程实验大纲一、学时学分总学时：30 学分：1 实验时数：30二、实验目的生物化学是生物技术及生命科学相关专业的专业基础课程，其实验教学是使学生理解和掌握生物化学基本原理的必需环节。
生物化学实验所包含的基本技能涉及生物科学的各个领域，是完成其它专业课程实验的基础，在教学中占有重要地位。
本课程的实验目的主要包括：（1）加深生物化学基本概念和基本原理的理解与掌握；（2）培养学生掌握基本生化实验方法和实验技术，掌握各个实验的基本原理；（3）系统训练专门的实验技能，熟练使用各种常用生化实验仪器；（4）训练学生观察实验现象、准确记录实验数据、正确处理与分析实验结果的技能，培养严谨细致的科学作风。
三、实验基本原理蛋白质的溶解受盐、酸、碱、重金属等因素的影响，发生可逆和不可逆沉淀；在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，加入SDS后由于各种蛋白质分子量大小不同，所以蛋白质在电泳中迁移率也会有不同；蛋白质的分子大小不同，小分子蛋白质由于扩散作用进入凝胶颗粒内部而被滞留，大分子被排阻在凝胶颗粒外面而迅速通过层析柱；碱性缓冲液中DNA分子带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动；激活剂、抑制剂、温度等对酶促反应速度有极大影响；电子传递过程中的氧化还原反应可通过伴有颜色变化的化合物作受体来研究；纸层析技术可以用于转氨基作用中不同物质的检测。
四、实验基本要求严格遵守实验室各项规章制度；实验前认真预习实验指导书中有关实验的原理与步骤；认真听取理解教师在实验进行前的重点讲解；分小组进行实验，保持实验室安静，保持实验台整洁有序；正确使用实验仪器；认真观察与分析实验现象，客观真实地填写实验数据并进行结果分析；认真、准确、整洁地撰写实验报告并按时上交。
五、考核与报告考核分笔试和平时成绩两项。
笔试成绩占70%，平时成绩占30%。
平时成绩根据整个课程实验过程中学生的各方面表现和实验报告撰写情况打分。
六、主要仪器与设备组织捣碎机、水浴锅、高速冷冻离心机、台式离心机、柱层析系统、电泳仪、垂直与水平电泳槽、紫外与可见分光光度计、蛋白质检测仪、紫外透射反射仪、冰箱、电子天平、反渗透系统等。
生物化学实验
实验一、甲醛滴定法测定氨基氮一、 实验目的：初步掌握甲醛滴定法测定氨基酸含量的原理和操作要点。
二、 实验原理氨基酸是两性电解质，在水溶液中有如下平衡：对溶液氨基酸含量的测定主要依据平衡中电离H +的浓度来确定。
因此，反应平衡应向右进行。
平衡向右的促进方式：1）增加底物的浓度——A 、增加AA 的浓度（本实验目的是测定氨基酸的含量，必须保证固定的氨基酸浓度；B 、加碱，让H +电离。
但—NH 3+ 是弱酸，完全解离时pH 为11~12或更高，若用碱滴定—NH 3+所释放的H + 不测量氨基酸，一般指示剂色域小于10，很难准确指示终点。
因此，直接用碱滴定是不可行的。
2）降低产物的浓度——在本实验中用加入过量甲醛的方式：常温下，甲醛能迅速与氨基酸的氨基结合，生成羟甲基化合物，使平衡右移，促使—NH 3+释放H +，使溶液的酸度增加，同时也使滴定终点从强碱区域（pH11~12）移至弱碱区域（pH9.0左右）。
而这一区域正好是酚酞的敏感变色区域(pH8~10)。
因此，可用酚酞用指示剂，用标准氢氧化钠溶液滴定（刚好微红）。
由滴定所用的NaOH 量就可计算出溶液中氨基酸的含量，这就称氨基酸的甲醛滴定法。
如样品为一种已知的氨基酸，从甲醛滴定的结果可算出氨基氮的含量。
当然，如样品是蛋白质水解液，（实际上是多种氨基酸的混合物），则滴定结果不能作为氨基酸的定量依据。
但是，基本规律如下：当蛋白质水解时，放出游离的氨基，随着水解程度的增加，滴定值也增加。
当滴定值不再增加，表示水解作用已完全。
相反，蛋白质合成时游离氨基减少。
因此，可以用此法测定溶液中的氨基量，就能大体判断出蛋白质水解或合成的进度。
二羟甲基氨基酸三、实验器材1、25ml锥形瓶2、微量滴定管3、吸管4、移液管四、实验试剂1、0.1mol/L标准甘氨酸溶液300ml准确称取750mg甘氨酸，溶解后定容至100ml。
2、0.1mol/L 标准氢氧化钠溶液500ml3、酚酞指示剂20ml0.5%酚酞的50%乙醇溶液4、中性醛溶液400ml在50ml 36%~37% 分析纯甲醛溶液中加入1mL 0.1% 酚酞乙醇水溶液，用0.1mol/L的NaOH溶液滴定到微红，贮于密闭的玻璃瓶中。
生物化学实验
生物化学实验一、糖的颜色反应及还原作用实验一：糖的颜色反应实验1.1 莫氏实验一、目的精品文档，你值得期待掌握莫氏（molisch）实验鉴定糖的原理和方法。
二、原理糖经浓无机酸（浓硫酸、浓盐酸）脱水产生糠醛或糠醛衍生物，后者在浓无机酸作用下，能与α-萘酚生成紫红色缩合物，在糖液和浓硫酸的液面间形成紫环，因此又称“紫环反应”，其反应如下图：利用这一性质可以鉴定糖。
三、实验器材1、棉花或滤纸。
2、吸管1.0ml(*4)、2.0ml(*1)。
3、试管1.5*15cm(*4)。
四、实验试剂1、莫氏试剂：称取α-萘酚5g，溶于95%乙醇并稀释至100ml。
此试剂需新鲜配置，并贮于棕色试剂瓶中。
2、1%蔗糖溶液：称取蔗糖1g，溶于蒸馏水并定容至100ml。
3、1%葡萄糖溶液：称取葡萄糖1g，溶于蒸馏水并定容至100ml.4、1%淀粉溶液：讲1g可溶性淀粉与少量冷蒸馏水混合溶液合成薄浆状物，然后缓缓倾入沸蒸馏水中，边加边搅。
最后以沸蒸馏水稀释至100ml。
五、操作于4支试管中，分别加入1ml1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液、1%淀粉溶液和少许纤维素（棉花或滤纸浸在1ml水中）。
然后各加莫氏试剂2滴1，摇匀，讲试管倾斜，沿管壁慢慢加入浓硫酸1.5ml(切勿振摇！)硫酸层沉于试管底部与糖溶液分成两层，观察液面交界处有无紫色环出现。
六、注意事项1、试管中加入各种糖后，应做好标记，浓硫酸加入的方式应保持一致。
2、莫氏反应非常灵敏，所用的试剂应洗净，不可再样品中混入纸屑等杂物。
3、当糖浓度过高时，由于浓硫酸对他的焦化作用，将呈现红色及褐色而不呈现紫色，需稀释后再做。
思考题：1、解释α-苯酚反应的原理。
2、用莫氏试验鉴定糖时需注意哪些？试验1.2 塞氏试验一、目的掌握塞氏（Seliwanoff）实验鉴定酮糖的原理和方法。
二、原理酮糖在浓酸的作用下，脱水生产5-羟甲基糠醛，后者与间苯二酚作用，呈红色反应，有时亦同时产生棕色沉淀，此沉淀溶于乙醇，呈鲜红色沉淀2，以果糖为例，其反应如下：三、实验器材1、吸管0.5ml(*3)、5.0ml(*1)。
《生物化学实验》课程大纲
《生物化学实验》课程大纲一、课程概述课程名称（中文）：生物化学实验（英文）：Biochemistry Experiment课程编号：课程学分：1.0课程总学时：30课程性质：科类基础课前修课程：无机化学实验，有机化学实验二、课程内容简介（300字以内）生物化学是农学、畜牧学、生物学等各专业相关课程的重要基础课程，是一门实验性很强的学科，其生物化学实验课在生物化学教学中占据重要地位。
生物化学实验紧密围绕生物化学实验技术的教学需求，主要针对蛋白质、酶、核酸、脂类、糖、维生素等生物分子的分离、提取、分析、鉴定和定量测定技术等内容进行课程实验项目的设计和教学，加强学生对生物化学实验技术的学习，巩固和掌握生物化学实验技术的基本理论、基本知识、实验技能，提高学生创新思维意识、综合分析问题和科学实验的能力，鼓励学生将所学知识运用于实际工作中去。
三、教学目标与要求生物化学实验是农业院校重要的专业基础课程，是培养学生创新精神、实践能力的重要平台，是塑造高层次农业科技专门人才的基本环节之一。
通过该课程的学习后，学生能够掌握生物化学实验的基本原理和操作方法，能够独立进行实验并具有发现问题和解决问题的能力，能够根据实验记录，结合理论知识，合理地分析结果，并学习对实验中出现的问题进行讨论，提出解决方案或改进措施。
总的目标是提高学生综合分析能力，培养学生熟悉科学研究的基本程序和基本思维。
四、学时分配注：生物化学实验课程总计1学分，安排8次实验（不含选修），其中验证性实验占62.5%，综合性、设计性实验占37.5%。
五、教学内容与安排实验一：酶促转氨反应的分析鉴定(3学时)（一）实验目的：通过本实验掌握纸层析的一般原理和方法；掌握利用纸层析研究代谢的基本方法，了解酶促转氨反应在中间代谢中的意义。
（二）实验主要仪器：层析缸；培养皿；电吹风机；烘箱；恒温水浴锅；培养皿；毛细管；研钵；针、线。
（三）实验内容与方法：1. 提取材料的酶液；2. 用纸层析法鉴定酶促转氨反应中转氨基产物丙氨酸的存在与否；3. 通过计算其R f并与标准氨基酸对照，判断反应产物样品的氨基酸组成。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
《生物化学实验》
教学方案
湖南文理学院生命科学学院学院生化与分子生物学教研组
实验一蛋白质的性质实验（1）—蛋白质和氨基酸的呈色反应
实验二蛋白质的性质实验（2）—蛋白质等电点的测定和沉淀反应
实验三牛乳中蛋白质的提取与鉴定
教学内容提要及时间分配
1、实验原理讲解： 8分钟
➢蛋白质在其等电点pH溶液中溶解度降底。
根据这个原理，将牛乳的pH调整至4.8，即酪蛋白的等电点时，酪蛋白即沉淀出来。
用乙醇除去酪蛋白沉淀中不溶于水的脂肪，得到纯的酪蛋白
➢所得酪蛋白的定性鉴定
2、实验条件及步骤讲解： 7分钟
➢酪蛋白的制备
➢酪蛋白的性质鉴定
➢乳清中可凝固性蛋白质的鉴定
实验四氨基酸的分离鉴定——纸层析法
实验五酶的特性（设计型实验）
教学内容提要及时间分配
1、实验原理讲解： 10分钟
➢酶的催化作用受温度的影响。
在最适温度下，酶的反应速度最高。
大多数动物酶的最适温度为37-40℃，植物酶的最适温度为50-60℃
➢酶的活力受环境pH的影响极为显著。
不同酶的最适pH值不同
➢酶的活性受活化剂或抑制剂的影响
➢酶具有高度的专一性，淀粉和蔗糖无还原性
2、实验设计方案讲解： 5分钟
实验六酵母核糖核酸的分离及组分鉴定
实验七紫外分光光度法测定核酸的含量
实验八维生素C的定量测定
实验九血糖的定量测定—GOD-PAP法
实验十 DNA的琼脂糖凝胶电泳
实验十一蛋白质的透析
实验十二 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离细菌蛋白质。