肠道微生物的分离与鉴定方法
一、有益菌：乳酸杆菌，双歧杆菌，柔嫩梭菌，丁酸梭菌，芽孢杆菌（枯草、地衣）。5种
有害菌：大肠杆菌，沙门氏菌，产气荚膜梭菌，空肠弯曲杆菌。4种
二、厌氧菌：乳酸杆菌，双歧杆菌，产气荚膜梭菌，丁酸梭菌，柔嫩梭菌。5种
需氧菌：芽孢杆菌。1种
兼性厌氧菌：大肠杆菌，沙门氏菌。2种
注：
境中生长最好。最适温度为37～42℃。在正常大气或无氧环境中均不能生长。
肠道正常菌群中95%以上为专性厌氧菌，兼性厌氧菌和需氧菌在正常菌群中所占比例较少。
三、一般检测菌株包括厌氧菌中的双歧杆菌、拟杆菌、优杆菌、消化性球菌、乳杆菌及梭菌。
需氧菌中的肠杆菌、肠球菌、葡萄球菌，及酵母菌等。
四、无氧环境的简易操作：
1、方法来自文献《健康羊驼粪球中主要正常菌群的分离与初步鉴定》
采用干燥器培养，1m3空间用焦性没食子酸10g、10%氢氧化钠溶液l00mL，按比例取10%的氢氧化钠液置于干燥器皿底部，然后放置2到3个略高于液面的青霉素小瓶，再按比例称取焦性没食子酸用纸
包好，放在圆柱上。继而放上隔板,将接种完毕的培养基放于隔板上，同时放美蓝指示剂一管。盖上缸盖并用石蜡封闭。再轻轻摇动干燥器，使焦性没食子酸掉人氢氧化钠液中，反应后，干燥器内无氧，美蓝指示剂由蓝变白。置于温箱37℃培养24一48h观察结果。
2、方法来自文献《健康猪肠道菌群的分离培养与耐药性分析》
后者先拧紧瓶盖,放入密封性较好的玻璃罐(用凡士林封口)，通过蜡烛燃烧法制作简易厌氧装置。
五、CO2培养箱不可代替无氧培养箱
厌氧箱一般是组合气体90%氮气+5%氢气+5%二氧化碳，厌氧箱里面培养的微生物都是厌氧微生物；而二氧化碳培养箱里面是5%二氧化碳+95%空气，里面是有一部分氧气的。一般的研究认为严格厌氧菌的培养环境中O2的浓度必须小于1000ppm（千分之一），更严格的环境是小于300ppm（万分之三），本实验室CO2培养箱CO2浓度范围为280-2000ppm，所以CO2培养箱是不能用来培养严格厌氧菌。（1ppm即百万分之一）。
目前培养厌氧微生物的简便而又有效的技术包括有：厌氧箱培养技术；厌氧罐培养技术；厌氧袋培养技术；
1.一般性的细菌培养标本若需延迟送检时，应置于4度冰箱保存，且不能超过24小时。
2.临床标本最佳运送时间取决于标本的量，少量液体（小于1ml）
或组织（小于1cm3）应在15~30分钟内送到实验室，较多量的标本置于运送培养基中可放12~24小时，厌氧培养标本原则上是床边接种，如延迟送检，需保存在厌氧运送培养基中，室温保存，不得超过24小时。低温对一些厌氧菌有害。
1.采样和运输：同时间、同地点、同位置分别取两管平行粪样，可适量
多取，一管做需氧菌分离和提纯，另一管做厌氧菌的分离和提纯；需氧菌按原方案用冰块运输，厌氧菌放置于厌氧生物袋常温运输（一般认为，低温对某些厌氧菌有害，并且氧的溶解度较高）。
2.保存: 标本送至实验室后，应尽快处理，最迟不超过24h。需氧菌放
置于4℃冰箱保存，厌氧菌放置于常温保存。
3.分离、纯化：需氧菌按原计划进行。厌氧菌培养基中添加万分之五的
半胱氨酸或硫化钠做还原剂，消除培养皿内部氧气。
1.一般性的细菌培养标本若需延迟送检时，应置于4度冰箱保存，且
不能超过24小时。
2.临床标本最佳运送时间取决于标本的量，少量液体（小于1ml）
或组织（小于1cm3）应在15~30分钟内送到实验室，较多量的标本置于运送培养基中可放12~24小时，厌氧培养标本原则上是床边接种，如延迟送检，需保存在厌氧运送培养基中，室温保存，不得超过24小时。低温对一些厌氧菌有害。
文献名称研
究
位
置
样
品培养基种类
培养
条件培养时间
培
养
温
度
微生
物种
类
胃肠道菌群和胃肠黏膜屏障的检测胃
肠
道
菌
粪
便
选择性培养基，具体
不详
需
氧，
厌氧 24-72h
检测
菌株
包
括：
双歧
杆
菌，
拟杆
菌，
优杆
菌，
消化
性球
菌，
乳杆
菌及
菌，
肠杆
菌，
肠球
菌，
葡萄
球
菌，
及酵
母
菌。
10种
贵州小型
猪胃肠道
正常菌群的初步检测肠
道
菌
粪
便
10种菌的选择性培养
基和需氧、厌氧的非
选择性培养基
需
氧，
厌氧
需氧
菌:24-48h,厌
氧菌:48-72h 37℃
双歧
杆
菌，
乳酸
菌，
拟杆
菌，
消化
球
荣球
菌，
梭
菌，
肠杆
菌，
肠球
菌，
葡萄
球
菌，
酵母
菌。
10种
健康羊驼
粪球中主
要正常菌
群的分离与初步鉴定肠
道
菌
粪
便
普通琼脂培养基，甘
油肉汤浸液琼脂，EC
培养基，伊红美蓝培
养基，乳酸杆菌选择
培养基，生化试验用
培养基
需
氧，
厌氧 24-48h 37℃
双歧
杆
菌，
乳酸
杆
菌，
酵母
拟杆
菌，
芽孢
杆
菌。5
种
健康猪肠
道菌群的
分离培养与耐药性分析肠
道
菌
粪
便
麦康凯琼脂，MRS增
菌液，HYA琼脂，TYP
琼脂
需
氧，
厌氧
需氧菌:24h,
厌氧菌:48h 37℃
大肠
杆
菌，
乳酸
杆
菌，
双歧
杆
菌。3
种
健康与腹泻幼犬肠
道菌群数量差异分析研究肠
道
菌
粪
便
普通和SS琼脂培养
基，甘油肉汤浸液琼
脂培养基，MRS乳酸
菌、EC肠球菌、EMB
肠杆菌，TPY双歧杆
需
氧，
厌氧 24-48h 37℃
大肠
杆
菌，
沙门
氏
菌选择培养基，麦康凯培养基，生化试验用培养基菌，肠球菌，乳酸杆菌，双歧杆菌。5种
健康鸽与
腹泻鸽肠道菌群比较研究肠
道
菌
取
肠
道
MRS培养基，营养琼
脂平板，双歧杆菌培
养基，麦康凯培养基，
EC培养基，生化试验
培养基
需
氧，
厌氧 24-72h 37℃
芽孢
杆菌,
乳酸
杆菌,
双歧
杆菌,
大肠
杆菌,
肠球
菌。5
种
水貂粪便粪营养琼脂培养基，莫厌氧 48-72h 37℃乳酸
乳酸杆菌的分离与鉴定便匹罗星锂盐改良MRS
培养基，营养肉汤培
养基，生化试验培养
基
杆
菌，
嗜酸
性乳
酸杆
菌，
干酪
乳酸
杆
菌。3
种
猪源益生芽孢杆菌的分离鉴定与生物
学特性分析粪
便
LB培养基，淀粉培养
基，酪素培养基，羧
甲基纤维素钠培养
基。
需
氧，
厌氧 18-24 h 37℃
嗜热
脂肪
芽孢
杆
菌，
地衣
芽孢
杆
菌，
枯草
芽孢
杆
菌。3
种
厌氧菌在有氧的情况下不能生长。要培养厌氧菌，必须创造一个
环境中的游离氧，以降低氧化还原电势。如疱肉培养基、硫基乙酸钠培养基，牛心脑浸液培养基等。常用的厌氧培养方法有许多，可根据实际情况选用。
1.厌氧缸法：接种好标本的平板或液体培养基试管，可放入厌氧缸内培养，厌氧缸是普通的干燥缸，用物理化学的方法使缸内造成厌氧环境，从而将厌氧菌培养出来。
2.厌氧袋：即在塑料袋内造成厌氧环境来培养厌氧菌。塑料袋透明而不透气，内装气体发生管、美兰指示剂管、钯催化剂管、干燥剂。放入已接种好的平板后，尽量挤出袋内空气，然后密封袋口。先折断气体发生管，后折断美兰指示剂管，命名袋内在半小时内造成无气环境。如不突变表示袋内已达厌氧状态，可以孵育。
3.厌氧手套箱：是迄今为止国际上公认的培养厌氧菌最佳仪器之一。它是一个密闭的大型金属箱，箱的前面有一个有机玻璃做的透明面板，板上装有两个手套，可通过手套在箱内进行操作，故名。箱侧有一交换室，具有内外二门，内门通箱内先关着。欲放物入箱，先打开外门，放入交换室，关上外门进行抽气和换气达到厌氧状态，然后手伸入手套把交换室内门打开，将物品移入箱内，关上内门。箱内保持厌氧状态，也是利用充气中的氢在钯的催化下和箱中钱残余氧化合成水的原理。该箱可调节温度，本身是孵箱或孵箱即附在其内，还可放入解剖显微镜便于观察厌氧菌菌落，这种厌氧箱适于作厌氧细菌的大量培养研究，大量培养基可放入作预还原和厌氧性无菌试验。金属硬壁型厌氧箱的抽气、充气、厌氧环境和温度等均系自动调节。
4.厌氧盒：原理同厌氧袋，有成品销售。
5.生物耗氧法：在一密闭的容器内放以生物，消耗氧气，同时产生二氧化碳，供细菌生长用。我没见过。
6.焦性末食子酸法：在一洁净的玻片上铺上纱布或滤纸，均匀撒上焦性末食子酸，然后再混入NaHCO3粉末或NaOH溶液，迅速将已接种细菌的平板倒扣在上面，用融化的白蜡封边，造成一个封闭空间。焦性末食子酸与碱反应后耗氧。该法用于厌氧不严格的厌氧菌的培养，简单。如有梭状芽孢杆菌。
7.疱肉培养基：本身就是一个不需特殊设备的厌氧培养法。疱肉和肉汤装入大试管，液面封凡士林，造成无氧环境。
厌氧菌标本采集与送检必须注意两点：标本绝对不能被正常菌群所污染;应尽量避免接触空气。
1. 采集：
采集标本须注意：不被正常菌群污染，并尽量避免接触空气。采集深部组织标本时，需用碘酒消毒皮肤用注射器抽取，穿刺针头应准确插入病变部位深部，抽取数毫升即可，抽出后可排出一滴标本于酒精棉球上。若病灶处标本量较少，则可先用注射器吸取1ml还原性溶液或还原性肉汤，然后再抽取标本。在紧急情况下，可用棉拭取材，并用适合的培养基转送。厌氧培养最理想的检查材料是组织标本，因厌氧菌在组织中比在渗出物中更易生长医。
用于厌氧菌培养的标本不同于一般的细菌培养，多采用特殊的采集方法，如针筒抽取等，应严格无菌操作，严禁接触空气。
不同部位标本采集方法也各有不同特点。
2.送检方法与处理
标本送到实验室后，应在20～30min内处理完毕，最迟不超过2 h，以防止标本中兼性厌氧菌过度繁殖而抑制厌氧菌的生长。如不能及时接种，可将标本置室温保存(一般认为，冷藏对某些厌氧菌有害，而且在低温时氧的溶解度较高)。
1)针筒运送：一般用无菌针筒抽取标本后，排尽空气，针头插入无菌橡皮塞，以隔绝空气，立即送检。这种方法多用于液体标本的运送，如血液、脓液、胸腹水、关节液等医.
2)无菌小瓶运送：一般采用无菌的青霉素小瓶，瓶内加一定量的培养基和少量氧化还原指示剂，用橡皮盖加铝盖固定密封，排除瓶内空气，充以C02气体。同时先观察瓶内氧化还原指示剂的颜色，以判断瓶内是否为无氧环境，如合格将用无菌注射器将液体标本注入瓶中即可。
3)棉拭子运送一般不采用棉拭子运送，如果使用该方法，一定使用特制运送培养基，确保无氧环境，确保不被污染，确保快速送检。
4)厌氧罐或厌氧袋运送将厌氧罐或厌氧袋内装入可有效消耗氧
气的物质，确保无氧环境。该方法一般用于运送较大的组织块或床边接种的培养皿等。
厌氧菌广泛存在于外界环境和人体的口腔、肠道和女性生殖道等部位，常引起内源性感染。据文献报道，约60 % 的临床感染有厌氧菌参与，且大多数是与需氧菌混合感染，故开展厌氧菌的检验对感染的诊断、治疗都有重要意义。
一、厌氧菌样品的采集Collection of anaerobic bacteria' s speci mens
标本避免正常菌群污染和氧接触，采用下列方法：
(1) 脓胸及未破溃的脓肿：皮肤消毒后，以无菌注射器抽取(排尽空针及针头内的气体) ，将针头插入无菌橡皮塞内送检。
(2) 肺分泌物和痰标本：用支气刷采取或环甲膜穿刺术。
(3) 尿液标本：用无菌注射器从耻骨上缘行膀脱穿刺术抽取。
(4) 血液标本：可用两端接有无菌针头的塑料袋或橡皮导管，将一端针头刺入静脉，待血液流出后将另一端针头立即插入培养瓶内(瓶内负压) ，使血液直接流入培养瓶内。
(5) 窦道、深部脓肿等的标本:可用特别采样器采取。
二、涂片与染色Smear preparation and stain
标本涂片、革兰染色、镜检，观察细菌的形态和染色性，并估计标本中大致的含菌量，可用"少量”" + "、" ++ "、" + ++"、" ++
++ "表示。镜检不仅能反映各种厌氧菌的特殊形态，同时也能为鉴定厌氧菌提供参考和依据。如脆弱拟杆菌菌体细长，两端尖：韦荣球菌是极小的革兰阴性球菌。厌氧菌芽胞的位置、形态、大小对鉴定很有意义，必要时作芽胞形成试验。例如，芽胞在菌体极端且大于菌体呈鼓槌状，是破伤风梭菌的特征。根据厌氧菌的特殊形态，可初步确定有无厌氧菌感染，及时向临床医师发出一级报告，建议采用哪类药物。
三、标本接种Inoculating
一般标本接种3 个血琼脂平板，分别放置于有氧、无氧和含5 % ~ l0 % CO2 的环境中培养。如果只要求检出厌氧菌，只需接种l
个厌氧血琼脂平板，也可增加1 个相应的选择厌氧血琼脂平板。为便于在混合培养中及早发现厌氧菌，一般将标本分3 段划线接种，在第1 和第2 段交界处贴1 张甲硝哗(5 mg/片)纸片，若出现隐约抑菌圈，则提示有厌氧菌生长。
不同厌氧菌的生长速度和菌落形态各异，色素也有不同，荧光产生与否也有助于鉴定，根据上述特征，可初步推测厌氧菌的种类：
1.革兰阴性杆菌
(1)在BBE 琼脂平板上有灰黑色、直径> lmm 的菌落，菌落周围有黑色的晕，可初步鉴定为脆弱拟杆菌。
(2) 在卡那万古溶血琼脂平板上，有棕色或黑色菌落，或用伍德灯照射有砖红色荧光者，为产黑素普雷沃菌。
(3)菌落沉入琼脂内，使培养基表面留有小坑者，可能是解脲拟杆菌和纤细拟杆菌。
(4) 菌落表面有小斑点，或如面包屑，结合涂片所见，可初步鉴定为具核梭杆菌。
2. 革兰阴性球菌菌体很小，排列成双、短链或小堆，菌落小，不透明，可能是小韦荣球菌。
3. 革兰阳性球菌排列成长短不等的链，可能是消化链球菌。
4. 苹兰阳性无芽胞杆菌
(1)菌落呈臼齿形、粗糙，结核脓样分泌物中有硫黄样颗粒，可能是放线菌。
(2) 菌体呈X 、Y 、V 排列，菌落小，灰白，不透明，可能是丙酸杆菌。
5 .革兰阳性芽胞杆菌只要见有芽胞，即可鉴定为梭菌属。菌落有双环溶血，卵黄平皿上卵磷脂酶试验和Nagler 试验阳性，涂片染色为革兰阳性短粗杆菌，有芽胞，有荚膜，可鉴定为产气荚膜梭菌。
四、耐氧试验Oxygen tolerance test
当厌氧平板上有细菌生长时，为了确定是否为厌氧菌，必须做耐氧试验。从每个琼脂平板上挑取4~5 个性状不同的菌落，每个菌落分别转种于2 块需氧血琼脂平板和1 块厌氧血琼脂平板(每个琼脂平板可划4~6 区，每区种一个可疑菌落) ，然后将平板分别放置在需氧、二氧化碳和厌氧环境中培养。
凡在厌氧环境生长，而在需氧和二氧化碳环境中不生长的细菌为专性厌氧菌;在需氧和厌氧环境中均能生长者为兼性厌氧菌;在需氧和二氧化碳环境中生长，而在厌氧环境中不生长者为专性需氧菌;在需氧、厌氧环境中均不生长或生长不佳，而在二氧化碳环境中生长良好的细菌为需二氧化碳菌。
五、鉴定试验Identification test
可依据厌氧菌的菌体染色形态、菌落特性以及对某些抗生素的敏感性作出初步鉴定。最后鉴定则要进行生化反应及终末代谢产物等检查。
生化试验主要包括多种糖类发酵试验、吲哚试验、硝酸盐还原试验、触酶试验、卵磷脂酶试验、脂酶试验、明胶液化试验及胆汁肉汤生长试验和硫化氢试验等。目前用于厌氧菌快速鉴定有胞外酶试验，4 h 即可观察结果;自动微生物鉴定系统，如VITEK-ANI 、MicroS can- ANI 等也可鉴定厌氧细菌。
在进行厌氧菌分离鉴定的过程中，需注意下列事项:
①厌氧菌标本在采集和运输的过程中必须与空气隔绝(厌氧菌暴露于空气中时间太长可死亡) ，务必在30 min 内完成，同时应避免正常菌群的污染。
②培养基要新鲜配制，若储存太久，有氧气溶解在表面或有过氧化物在培养基中，不利于厌氧菌生长。
③若菌落太小，需用放大镜观察菌落。
④作耐氧试验，要求从每个琼脂平板上挑取4 ~ 5 个性状不同的菌落，分别接种需氧和厌氧血琼脂平板，置于需氧、二氧化碳和厌氧环境中培养。
⑤如作胞外酶鉴定，一定要有足够的菌液浓度。