用鸡胚成纤维细胞生产传染性喉气管炎活疫苗工艺

用鸡胚成纤维细胞生产传染性喉气管炎活疫苗的工艺探索摘？要：《兽医生物制品规程》中规定鸡传染性喉气管炎活疫苗的生产及生产用种毒的繁殖都是接种spf鸡胚，收获绒毛尿囊膜来进行的。spf鸡胚价格昂贵，绒毛尿囊膜产量少，挑膜工艺容易污染，造成损失和浪费。用鸡胚成纤维（cef）二代细胞代替鸡胚绒毛尿囊膜制备生产用种毒及疫苗，所制备的种毒及疫苗各项指标均符合《规程》规定的标准，提高了疫苗的批产量，降低了生产成本。关健词：spf鸡胚；绒毛尿囊膜；cef传代细胞；疫苗批产量

鸡传染性喉气管炎（k317株）活疫苗的传统生产方法是接种spf 胚，收获感染的鸡胚绒毛尿囊膜制备而成，绒毛尿囊膜接种法工艺繁琐，制备人工气室不仅耗费时间长，而且合格率达不到100%，收获时污染率高，尤其是气候炎热的季节污染率更高，造成不必要的损失和浪费，加大了生产成本。用鸡胚成纤维传代细胞代替鸡胚绒毛尿囊膜生产该疫苗，生产工艺容易掌握和控制，可批量生产，节约了鸡胚的使用量，降低了生产成本。

1 材料

1.1 鸡传染性喉气管炎（k317株）基础种毒（膜毒），由本公司质管部提供。

1.2 spf鸡胚，购自北京梅里亚维通实验动物有限公司，25日龄、40日龄spf鸡，由生产车间孵化。

1.3 cef由细胞组制备。

2 方法

2.1 细胞制备

2.1.1 cef原代细胞制备按《规程》方法进行，所不同的是用冷消化方法，消化过程在4℃进行。

2.1.2 cef二代细胞制备 cef原代细胞长成致密单层后，按常规方法进行传代，可连续传3代，二代细胞和原代细胞相比，杂细胞和细胞碎片少，细胞更加纯净，细胞活力好，产毒效价高。细胞产量大，减少鸡胚使用数量，降低成本。

2.2 生产用种毒制备基础种毒按0.5～1%接种cef二代细胞，37℃吸附1小时，补足细胞维持液，37℃培养，96～120小时收获，如此方法连续盲传，直至出现典型有规律的细胞病变（cpe）为止，病毒液冻融两次，-20℃保存备用。

2.3 生产用细胞毒的检验按照《规程》方法进行。

2.4 细胞病毒液制备及检验取生产用细胞毒按0.5～1%比例接

种cef二代细胞，置37℃培养，当cpe达75～80%时收毒，冻融2次，-20℃保存。效力检验方法采用鸡胚检验法。

3 结果

3.1 细胞制备采用胰酶冷消化法进行。好处其是：胰酶温和消化，细胞碎片少，细胞形态好，获得细胞数量多，每胚可至少获得3亿个细胞。

3.2 生产用毒种制备共盲传三次，第一次盲传未出现cpe，第二次盲传96小时后出现轻微的cpe，第三次盲传后72小时出现明显的cpe，96小时cpe达到80%时收获，冻融2次，-20℃保存。

3.3 生产用细胞毒检验结果：无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染；eid50为105.75/0.2ml；安全性好，5只鸡无任何异常均健活；最小免疫量为l0-4/0.06ml；特异性检验成立，为鸡传染性喉气管炎病毒。

3.4 细胞病毒液制备及检验结果共生产三批半成品，收毒时间在92～96小时之间，cpe达到80%时收获，三批半成品无菌检验均为阴性，鸡胚效力检验其eid50分别为 105.68、106.0和105.83。

3.5 两种疫苗安全、效力对比试验结果（详见表1、表2）。

4 讨论与小结 4.1 用鸡传染性喉气管炎（k317株）膜毒接种cef 二代细胞，盲传三代细胞发生典型的细胞病变，所制备的细胞毒各项指标均符合《规程》中对生产用毒种的要求，可代替组织毒作为生产用种毒。

4.2 两种疫苗大剂量（10羽份）接种25日龄spf鸡，对鸡的安全性良好，二者安全检验结果差异不明显，均符合《规程》标准。

4.3 两种疫苗成本分析以生产10000瓶（均为1000羽份/瓶）成品苗为例，组织苗所用原材料成本约为7.58万元，而细胞苗所需原材料成本仅为2700元左右，组织苗成本是细胞苗的28倍；而用相同数量的spf胚，细胞苗的产量是组织苗的50倍。由此可见，用cef传代细胞代替绒毛尿囊膜生产鸡传染性喉气管炎活疫苗切实可行。