细胞冻存 细胞生物学实验报告
细胞生物学实验课-3-细胞传代与冻存
四、实验步骤
1.准备：超净工作台紫外线处理30分钟, 用肥皂洗手, 穿鞋套，用新洁尔灭溶液拭擦双手消毒。 2. 倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要 传代及细胞需要稀释的倍数。将培养用液置37°C预 热。 3．关闭超净台紫外灯, 打开可见光灯开关,打开抽风 机清洁空气，除去臭氧。用75%酒精擦双手消毒 。 4.正确摆放超净台内的实验用品：酒精灯、酒精棉 球、新洁尔灭纱布、试管架、滴管筒（头）、吸管 筒（头）、废液缸等。点燃酒精灯，准备好实验试 剂：DMEM培养基（其中血清含量10%）、 血清、 胰酶等。
细胞生物学实验 张伟
思考题
1.试述传代培养的步骤和注意事项，并指出哪 些是关键步骤? 2.细胞胞传代培养的目的是什么? 3.贴壁细胞和悬浮细胞传代方法上有什么不 同? 4.如何估计是否传代和传代的方式? 5.细胞冻存应注意的问题。
细胞生物学实验
张伟
细胞生物学实验
张伟
2. 细胞传代的意义与目的 防止细胞增殖过度、营养枯竭、酸中毒 维持细胞种的延续。 利用培养细胞进行各种实验。
细胞生物学实验
张伟
3. 需要注意的两个问题 传代中的 “代”与细胞世代中的 “代” 不同 传代的频率或间隔与培养液的性质、接 种细胞的数量和细胞增殖速度有关。
细胞生物学实验
实验三、细胞的传代培养与冻存
细胞生物学实验
张伟
1.细胞培养中为什么NaHCO3？
2.细胞培养中为什么添加血清？
3.消化液胰酶的浓度是多少？
细胞生物学实验
张伟
一、实验原理
（一）传代培养
1.传代培养的概念 当原代培养细胞或已成为细胞系的细 胞，增殖达到一定密度后，将培养的细胞 从一个容器以适当比率转移到另一个或几 个容器中扩大培养，称为传代培养或继代 培养。
细胞冻存实验报告
一、实验目的1. 掌握无菌操作技术。
2. 熟悉细胞冻存的一般方法与步骤。
3. 了解冻存细胞复苏的注意事项。
4. 通过实验，提高细胞培养和冻存操作技能。
二、实验原理细胞冻存是指将细胞在低温下冷冻保存，以延长其存活时间，便于后续实验研究。
在冷冻过程中，细胞内的水分会形成冰晶，导致细胞结构受损。
因此，为了降低冰晶对细胞的损伤，通常在冻存液中添加保护剂，如二甲基亚砜（DMSO）或甘油。
细胞冻存的主要步骤包括：细胞培养、冻存液配置、细胞冻存、细胞复苏等。
三、实验材料1. 细胞：人胚胎肾细胞HEK2932. 培养基：DMEM培养基3. 抗生素：青霉素、链霉素4. 冻存液：DMEM培养基+10%FBS+10%DMSO5. 冻存管：无菌冻存管6. 冷冻箱：-80℃低温冰箱7. 灭菌设备：高压蒸汽灭菌器、酒精灯、紫外灯等四、实验步骤1. 细胞培养：将HEK293细胞接种于培养皿中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养，待细胞长满培养皿后，用吸管吸出培养液，加入含有0.25%胰酶的DMEM培养基，消化细胞。
2. 冻存液配置：按照冻存液配方，将DMEM培养基、FBS和DMSO混合均匀，分装于无菌冻存管中，高压蒸汽灭菌。
3. 细胞冻存：将消化后的细胞悬液转移至无菌冻存管中，加入适量冻存液，封口，标记后置于-80℃低温冰箱中冻存。
4. 细胞复苏：将冻存管从-80℃低温冰箱中取出，放入37℃水浴中解冻，待细胞完全解冻后，加入适量培养液，接种于新的培养皿中，置于培养箱中培养。
五、实验结果1. 冻存细胞复苏后，细胞形态、生长状态与原代细胞相似。
2. 经过冻存和复苏的细胞，仍具有良好的增殖能力。
六、实验讨论1. 冻存过程中，细胞内的水分形成冰晶，可能导致细胞结构受损。
因此，在冻存过程中，添加DMSO等保护剂，可以降低冰晶对细胞的损伤。
2. 冻存细胞复苏后，细胞形态、生长状态与原代细胞相似，说明冻存和复苏过程对细胞的影响较小。
3. 冻存细胞具有较好的增殖能力，表明冻存细胞可以用于后续实验研究。
实验七细胞的冻存和复苏6
实验7 细胞的冻存和复苏【实验原理】在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。
如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。
在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。
贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。
细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的－5～0℃，细胞仍能生长，活力受损不大。
目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。
【实验目的】掌握细胞冻存的方法，熟练进行细胞冻存与复苏操作。
【仪器、材料及试剂】1．仪器：4℃冰箱，-70℃冰箱，液氮罐，离心机，水浴锅，微量加样器等2．材料：冻存管（塑料螺口专用冻存管或安瓿瓶）、离心管、吸管等。
3．试剂：0.25％胰酶、培养基、含保护剂的培养基（即冻存液）等。
【操作步骤】1．冻存①消化细胞（同实验二），将细胞悬液收集至离心管中。
②1000rpm离心10分钟，弃上清液。
③沉淀加含保护液的培养，计数，调整至5×106/ml左右。
④将悬液分至冻存管中，每管1 ml。
⑤将冻存管口封严。
如用安瓿瓶则火焰封口，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。
⑥贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。
冻存管外拴一金属重物和一细绳。
⑦按下列顺序降温：室温→4℃（20分钟〕→冰箱冷冻室（30分钟）→低温冰箱（－30℃1小时）→气态氮（30分钟）→液氮。
注意：操作时应小心，以免液氮冻伤。
液氮定期检查，随时补充，绝对不能挥发干净，一般30立升的液氮能用1～1.5月。
2．复苏①从液氮中取出冻存管、迅速置于37℃温水中并不断搅动。
使冻存管中的冻存物在1分钟之内融化。
②打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中。
③1000rpm离心10分钟，弃去上清液。
④沉淀加10ml培养液，吹打均匀，再离心10分钟，弃上清液。
⑤加适当培养基后将细胞转移至培养瓶中，37℃培养，第二天观察生长情况。
细胞生物学实验实验报告
细胞生物学实验班级：生科142姓名：旷江学号：10143131组号： 2小组成员：旷江、韦立尧、莫霞指导老师：范立强、李鹏飞华东理工大学应用生物学系摘要本次细胞生物学实验通过细胞形态与结构的观察技术，细胞化学，细胞生理，细胞培养与分析，细胞周期分析，细胞成分分离与分析，细胞增殖与染色等技术对动植物细胞进行细胞形态结构的观察、细胞生理过程的研究、细胞培养与细胞分析、细胞冻存与复苏等，以此来研究动植物细胞的结构、功能和各种生命规律。
关键词：细胞增殖、细胞染色、冻存复苏、生理过程、形态结构AbstractThe cell biology experiment was carried out by cell morphology and structure observation technique, cytochemistry, cell physiology, cell culture and analysis, cell cycle analysis, cell fractionation and analysis, cell proliferation and staining. Observation of cell physiological processes, cell culture and cell analysis, cell cryopreservation and resuscitation, in order to study the structure of animals and plants, functions and a variety of laws of life.Key words: cell proliferation, cell staining, cryopreservation, physiological processes, morphological structur目录第一章综述 (1)1.1实验目的 (1)第二章实验原理 (2)2.1实验流程和应用实验方法 (2)2.2细胞器活体染色与显微观察 (2)2.3细胞骨架的观察 (3)2.4细胞冻存复苏 (3)2.5细胞冻存复苏活力检测 (3)2.6哺乳动物细胞的基因转染 (4)2.7细胞凋亡诱导和分析 (4)第三章实验仪器及试剂 (6)3.1实验仪器 (6)3.2实验试剂 (6)第四章实验步骤............ 错误！未定义书签。
实验四细胞的冷冻保存
冰晶对细胞的损伤
细 胞 脱 水
电解质浓度变化 pH变化 蛋白质变性 细胞超微结构改变
细
胞
冰
晶
溶酶体膜透性变化 线粒体功能障碍
水解酶释出
损
核内DNA构型和生物学行为的变化
伤
冷冻保存原则
冷冻过程要缓慢。
冻存细胞必须处在对数生长期 细胞浓度控制在：1×107－5×107/ml 使用高浓度血清或蛋白保护剂 使用合适的细胞冷冻保护剂，以保护细胞在冷冻 过程中免受冰晶破坏。
实验四 细胞的冷冻保存
一、实验目的
掌握细胞冻存与复苏的基本原理、方法和要领
熟练进行细胞冻存与复苏的操作
二、实验原理
细胞冻存的主要目的：
保存种子细胞。 减少细胞被污染的危险性。
减少细胞因传代培养而引起的遗传变异和 形态改变。
避免有限细胞系出现衰老或恶性转化。 降低人力和物力。
简易冷冻程序
细胞冻存管放入泡Biblioteka 小盒纱布小袋中放入-70℃冰箱
3h
细胞冻存管放入
液氮表面上停留30min 放入-20℃冰箱
直接投入液氮 3h 细胞冻存管放入
细胞冻存管放入泡沫小盒 纱布小袋中 （30－40min）
放入液氮灌的液氮蒸汽中，逐渐下降到液氮表面 停留30min后，直接投入液氮中 液氮罐口缓慢放入，按-1℃/min，在30－ 停留30min
细胞冻存管装入纱布小袋
40min内到达液氮表面
投入液氮
液氮
从液体向气体转化的过程中产生的深低温 -196℃
本次冷冻程序
细胞冻存管用厚棉
花包裹，放入塑料
盒中或泡沫盒中，
直接投入-70 ℃超 低温冰箱中。
细胞冻存
细胞冻存
1.实验前准备：细胞室及工作台紫外线照射15min；
培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、恒温水浴箱37℃预热，回温培养液和PBS。
2. 冻存前24-48h更换半量或全量培养基，使细胞处于指数生长期，约为80–90％致密度。
3. 配制冷存液（使用前配制）：
将DMSO加入胎牛血清(FBS)中，最后浓度为10％，混合均匀，置于室温下待用。
1mL冻存液=900uLFBS+100uLDMSO（FBS:DMSO=9:1）
4. 用吸管吸弃培养皿中细胞培养液，PBS清洗2遍吸出冲洗液，加入胰蛋白酶消化(6cm培
养皿0.5mL胰酶）
5. 显微镜下观察，细胞回缩成圆形，细胞上有亮点，大部分细胞飘起，加入3mL含血清培
养液终止消化，吸管吸取培养液吹打使细胞成为均匀分散的细胞悬液，转移入15mL离心管，（另一种做法：显微镜下观察，细胞回缩成圆形，细胞上有亮点，少部分细胞飘起，吸弃消化液，加适量含血清培养液，轻轻吹打，使细胞脱落，成为均匀分散的细胞悬液，调整细胞浓度为1-5*106cells/mL,分装）
6. 取50uL细胞悬浮液计数细胞浓度及冻前存活率离心，其余离心，1000rpm，5min
7. 弃上清液，缓慢逐滴加入冻存液，并晃动离心管，制成细胞冻存悬液，使细胞浓度为1～
5*106cells/ml，轻轻吹打是细胞分散均匀，分装于已标示完全的冻存管中，1ml/管
8. 冷存管置于4℃10min—-20℃30min—-80℃16～18h(或隔夜)---液氮槽长期储存。
（-20℃不要超过1h）。
生物冷冻技术实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 了解生物冷冻技术的原理和方法。
2. 掌握生物样本冷冻保存的操作步骤。
3. 评估冷冻保存对生物样本的影响。
二、实验原理生物冷冻技术是一种利用低温环境减缓生物样本内细胞和分子活动的技术，从而实现生物样本长时间保存的技术。
主要方法包括液氮冷冻、干冰冷冻、低温冰箱保存等。
低温环境可以降低生物分子的代谢速率，减缓细胞衰老和死亡，保持生物样本的活力、功能和完整性。
三、实验材料1. 生物样本：细菌、细胞、组织等。
2. 冷冻设备：液氮罐、干冰、低温冰箱等。
3. 试剂：固定液、解冻液、无菌水等。
4. 实验器具：冷冻管、离心管、移液器、显微镜等。
四、实验步骤1. 准备工作（1）将生物样本置于无菌环境中，避免污染。
（2）将所需试剂和器具准备齐全。
2. 生物样本冷冻保存（1）液氮冷冻：将生物样本置于液氮中，使其快速冷冻至-196℃。
（2）干冰冷冻：将生物样本置于干冰中，使其缓慢冷冻至-78℃。
（3）低温冰箱保存：将生物样本置于低温冰箱中，使其缓慢冷冻至-20℃。
3. 生物样本解冻（1）液氮冷冻样本：将样本从液氮中取出，立即置于37℃水浴中解冻。
（2）干冰冷冻样本：将样本从干冰中取出，置于室温下自然解冻。
（3）低温冰箱保存样本：将样本从低温冰箱中取出，置于室温下自然解冻。
4. 评估冷冻保存对生物样本的影响（1）观察样本外观，记录细胞形态、活力等变化。
（2）进行显微镜观察，记录细胞核、细胞质等结构变化。
（3）进行生化实验，检测细胞内酶活性、蛋白质表达等指标。
五、实验结果与分析1. 外观观察：冷冻保存后的生物样本，细胞形态基本完整，活力较高。
2. 显微镜观察：冷冻保存后的生物样本，细胞核、细胞质等结构基本完好，未出现明显损伤。
3. 生化实验：冷冻保存后的生物样本，酶活性、蛋白质表达等指标基本正常。
六、实验结论1. 生物冷冻技术可以有效保存生物样本的活力、功能和完整性。
2. 液氮冷冻、干冰冷冻、低温冰箱保存等不同冷冻方法对生物样本的影响较小，可根据实际情况选择合适的冷冻保存方法。
细胞冻存
细胞工程实验报告实验课程：细胞工程实验内容：细胞冻存一实验目的掌握低温液氮冻存的原理，学习细胞缓慢冻存实验方法二实验器具（冻存罐）（冻存管）（冻存管托）三实验原理低温液氮冻存贮存细胞是细胞培养室常规通用技术。
这不仅避免了在培养器具、培养液及各种准备工作方面人力物力时间的大量耗费，也避免增加污染的机会；并防止了在多次传代和体外环境变化时细胞发生遗传性状的不稳定。
液氮中温度可达-196℃，细胞贮存的时间理论上是无限的，解冻后细胞仍能生长繁殖。
为培养工作提供了极大的方便。
在不加任何保护剂的情况下直接冻存细胞时，细胞内外环境中的水分会很快结成冰晶，能导致细胞发生一系列不良反应如脱水、电解质浓度增高、渗透压改变pH改变、蛋白质变性、机械损伤等，最终导致细胞死亡。
如向细胞培养液中加入一些保护剂，可使冰点降低，在缓慢的冻结条件下，使细胞内水分在冻结前透出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，避免上述现象的发生甘油和二甲亚砜是目前最常使用的保护剂，它们对细胞无明显毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞，提高细胞膜对水的通透性，而对细胞内酶和蛋白质等则具有一定的保护作用。
保护剂的使用浓度一般在5%～15%。
降温方法：使用降温仪：以-1～-2℃/min的降温速率→-25 ℃以下→以-5～-10℃/min的降温速率→-100 ℃→迅速浸入液氮中。
分步降温：4 ℃放置30～60 min →-70～-80 ℃放置1～2天→迅速浸入液氮中。
四实验步骤（一）细胞悬液准备75%酒精棉球消毒双手、工作台面、培养瓶和试管等。
取对数生长期的细胞，将培养液倒入废液缸中。
向培养瓶内加入3ml PE液，平放轻摇。
向培养瓶内加入0.3ml的0.25%胰蛋白酶消化液，轻摇。
拍打悬浮后，制备成单细胞悬液（内含活细胞和死细胞）。
（二）冻存取对数生长期细胞，在冻存前24小时换培养液一次。
按上步骤制成细胞悬液。
在细胞悬液中加入2ml冻存液，吹吸数次使细胞均匀悬浮，→取0.5～0.8 ml分装入细胞冻存管内，密封，在管上做好标记，放于小试管架上，→放入4～5℃冷藏箱中30～45分钟，使冷冻保护剂充分渗入细胞内，与细胞达到平衡，→放入-75℃，1天，→快速放入液氮罐的试管托内，沉入液氮中。
传代冻存实验报告
一、实验目的1. 掌握细胞传代和冻存的基本操作步骤；2. 熟悉细胞传代和冻存过程中的注意事项；3. 提高细胞培养的纯度和稳定性。
二、实验原理细胞传代是指将原代培养的细胞用胰酶或胶原蛋白酶处理，使其从培养容器上分离下来，再重新接种到新的培养容器中继续培养。
冻存是指将细胞在超低温条件下（通常为-196℃）保存，以延长细胞的生命周期。
三、实验材料1. 原代细胞；2. 胰酶/胶原蛋白酶；3. 培养基；4. CO2培养箱；5. 离心机；6. 液氮罐；7. 灭菌器材。
四、实验步骤1. 原代细胞传代（1）将原代细胞用胰酶/胶原蛋白酶处理，使其从培养容器上分离下来；（2）用无菌PBS洗涤细胞，去除残留的胰酶/胶原蛋白酶；（3）将细胞重悬于培养基中，调整细胞浓度为1×10^6个/mL；（4）将细胞接种到新的培养容器中，置于CO2培养箱中培养。
2. 细胞冻存（1）将细胞用胰酶/胶原蛋白酶处理，使其从培养容器上分离下来；（2）用无菌PBS洗涤细胞，去除残留的胰酶/胶原蛋白酶；（3）将细胞重悬于冻存液中，调整细胞浓度为1×10^6个/mL；（4）将细胞悬液分装到无菌冻存管中，每管1mL；（5）将冻存管放入液氮罐中，进行超低温保存。
3. 细胞复苏（1）从液氮罐中取出冻存管，置于37℃水浴锅中解冻；（2）将解冻后的细胞悬液转移至离心管中，离心5min，800rpm；（3）弃去上清液，加入适量培养基，重悬细胞；（4）将细胞接种到新的培养容器中，置于CO2培养箱中培养。
五、实验结果1. 传代细胞生长良好，形态正常；2. 冻存细胞复苏后，生长良好，形态正常；3. 传代冻存过程中，细胞纯度和稳定性得到保证。
六、实验讨论1. 在细胞传代过程中，应尽量减少细胞损伤，避免过度传代；2. 冻存过程中，应选择合适的冻存液，保证细胞活性；3. 细胞复苏后，应尽快接种到新的培养容器中，避免细胞损伤。
七、实验结论本实验成功完成了细胞传代和冻存，为后续实验提供了高质量、稳定的细胞材料。
细胞的冻存实验报告
一、实验目的1. 了解细胞冻存的基本原理和操作方法。
2. 掌握细胞冻存过程中所需的设备和材料。
3. 掌握细胞冻存过程中的无菌操作技术。
4. 通过实验，提高细胞冻存的成功率。
二、实验原理细胞冻存是利用低温环境，使细胞内水分结冰，减缓细胞代谢活动，从而实现细胞的长期保存。
在冻存过程中，细胞内水分的结冰会导致细胞结构损伤，因此需要添加一定比例的冻存保护剂，以降低细胞损伤程度。
常见的冻存保护剂有二甲基亚砜（DMSO）、甘油等。
冻存过程中，细胞应逐步降温至-80℃，以避免温度突变对细胞造成损伤。
三、实验材料1. 细胞：选取生长良好的细胞，如人胚肾细胞（HEK293）、人肺上皮细胞（A549）等。
2. 冻存液：DMEM培养基+10%FBS+10%DMSO。
3. 设备：超净工作台、冰箱、液氮罐、移液器、冻存管等。
四、实验步骤1. 准备细胞：将细胞培养至对数生长期，收集细胞悬液，调整细胞浓度至1×10^6个/ml。
2. 配制冻存液：将DMEM培养基、FBS和DMSO按比例混合，配制冻存液。
3. 灭菌：使用无菌操作技术，将冻存液进行灭菌处理。
4. 分装细胞：将灭菌后的冻存液分装至冻存管中，每管加入1ml细胞悬液。
5. 冷冻：将冻存管置于超净工作台中，用移液器将细胞悬液均匀分布在冻存管底部。
6. 降温：将冻存管放入冰箱中，逐步降温至-80℃。
7. 液氮保存：将冻存管取出冰箱，迅速放入液氮罐中保存。
8. 解冻：需要复苏细胞时，将冻存管从液氮罐中取出，置于40℃水中迅速解冻。
9. 细胞培养：将解冻后的细胞悬液转移至新的培养瓶中，按照常规方法进行细胞培养。
五、实验结果与分析1. 成功冻存：通过显微镜观察，解冻后的细胞形态与冻存前相似，细胞活力良好。
2. 失败冻存：部分细胞在解冻后出现形态异常、细胞死亡等现象，表明冻存过程中可能存在操作失误或冻存液制备不当等问题。
六、实验结论通过本次实验，我们掌握了细胞冻存的基本原理和操作方法，了解了冻存过程中所需的设备和材料。
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创作编号：
GB8878185555334563BT9125XW
创作者：凤呜大王*
细胞生物学实验报告
细胞冻存
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同组成员：
一、实验原理
在低于-70℃的超低温条件下，由机体内部的生化反应极其缓慢，甚至终止，因此采用适当的方法将生物材料降至超低温条件，即可使生命活动固定在某一阶段而不衰老死亡。
当以适当的方法将冻存的生物体恢复至常温时，其内部的生化反应可恢复正常。
冷冻保存就是将体外培养物悬浮在加有或不加冷冻保存液的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度，并在此温度下对其进行长期保存的过程。
水在低于零度的条件下→结冰→细胞死亡。
如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。
在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。
贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。
目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。
最适冷冻速度：不同细胞的最适冷冻速度不同。
标准冷冻的开始速度为－1至－2℃/min，当温度低于－25℃时，可加速，到－80℃时可直接加入液氮中（－196℃）。
复苏细胞时则直接将细胞的冻存管放到40℃热水中迅速解冻。
二、实验目的
1、掌握无菌操作技术。
2、.掌握细胞冻存的一般方法与步骤。
3、掌握培养细胞的消化方法。
4、了解在倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态和生长状况。
三、实验仪器、材料、试剂及用品
1、仪器：超净工作台、CO2培养箱、倒置相差显微镜
2、材料：人宫颈癌HeLa 细胞
3、试剂：胰酶、DMEM培养基、血清、DMSO、抗生素
4、用品：培养瓶，试管，移液管，巴斯德吸管，废液缸，75％酒精棉球，酒精灯
四、实验步骤
1、穿好实验服，进入无菌室前穿鞋套、洗手。
2、倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。
将培养用液置370C下预热。
3、无菌室及超净台紫外线照射，关闭超净台紫外灯, 打开可见光灯开关，打开抽风机，用75%酒精擦双手消毒，再用酒精棉擦拭桌面。
4、点燃酒精灯；取出无菌试管，巴士德吸管和刻度吸管；安上橡皮头；过酒精灯火焰略烧后插在无菌试管内。
5、配置5ml冻存液（DMEM 70%，FCS 20%，DMSO10%），即DMEM 3.85ml，FCS 0.65ml，DMSO0.5ml。
6、取待冻存的细胞用胰酶消化，靠近火焰倒胰酶，显微镜下观察细胞的消化状态，待细胞大部分收缩、突起、一半变圆，细胞边界清晰时，即可立起或翻转培养瓶停止消化。
7、加两滴管2mL冻存液，即全面吹打细胞瓶壁,吹打均匀，细胞浓度宜大，3×106个/mL左右。
8、细胞悬液装入冻存管中。
用胶布封裹，做好标记（写上细胞种类，时间及冻存条件等）。
冻存管在40℃下存放30分钟，转放-20℃ 1.5～2小时, 再转入-700℃，4～12小时后即可转移到液氮内，注意进行登记。
五、实验结果
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创作者：凤呜大王*实验结果见下节课细胞复苏后可观察到。
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创作者：凤呜大王*。